Name: isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro
Uploaded: 2019-12-20T14:00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грантагентством Чешской Республики (18-02699S); Грантовое агентство Министерства здравоохранения Чешской Республики (17-31538A); Институциональный исследовательский проект Чешской академии наук (RVO 68378050) и проекты MEYS CR (L-1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI C.1.05/2.1.00/19.0395, и OP RDE C.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775); Карлов университет (личная стипендия К.К.), а также проект оперативной программы «Прага-конкурентоспособность» (C.2.16/3.1.00/21547). Мы признательна За поддержку с помощью микроскопии, IMG CAS, Prague, Czech Republic (поддерживаемые MEYS CR проекты LM2015062 и LO1419).

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Чешской центральной комиссией по защите животных.
1. Материалы
<ol><li>Домашние животные в специфических условиях без патогенов в соответствии с руководящими принципами Федерации лабораторных ассоциаций наукоемких животных с бесплатным доступом к регулярной чау и питьевой воде. Домашние животные под циклом темного/света 12 h/12 h. Для изоляции гепатоцитов и культуры используйте животных в возрасте 8–12 недель.</li>
	<li>Фондовые решения A и B<ol>
<li>Подготовьте биржевое решение A и биржевое решение B в соответствии с таблицей 1 и таблицей 2,соответственно, заранее. Растворите все компоненты в 1 l дистиллированной H2O (dH2O).</li>
		<li>Отрегулируйте рН растворов до 7.2 и отфильтруйте растворы через фильтр 0,2 мкм. Оба раствора могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Фондовое решение C<ol>
<li>Подготовьте раствор С в день первичной изоляции гепатоцитов.</li>
		<li>Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 3, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3.</li>
		<li>Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Используйте одну трубку на одно животное. Поместите все необходимые аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Акционерное решение D<ol>
<li>Подготовьте раствор D в день первичной изоляции гепатоцитов.</li>
		<li>Добавить все компоненты в соответствии с таблицей 4, заполнить до 30 мл общий объем с dH2O, и растворить. Отрегулируйте рН до 7,3.</li>
		<li>Aliquot 30 мл раствора в 50 мл труб. Добавить коллагенеза I (5 мг/30 мл) в раствор D. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Биржевое решение E<ol>
<li>Подготовьте раствор E в день первичной изоляции гепатоцитов.</li>
		<li>Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 5, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3.</li>
		<li>Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Добавьте альбумин V (0,65 г/50 мл) в раствор E. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Приготовление коллагеновых сэндвичей
<ol><li>За день до первичной изоляции гепатоцитов, подготовить первый слой коллагена I бутерброд. ПРИМЕЧАНИЕ: Работа на льду и использовать предварительно охлажденные растворы, советы, пластины и трубки, чтобы свести к минимуму нежелательное гелирование коллагена I.</li>
	<li>Нейтрализовать необходимое количество коллагена I (из крысиного хвоста) в соответствии с протоколом производителя. На экспериментальный образец (3,5 см) требуется объем нейтрализации коллагена (1,5 мг/мл). Для приготовления 1 мл нейтрализованного коллагена (1,5 мг/мл) добавьте 100 л 10x DMEM, 1,5 л из 1 МН НаОХ и 48,5 л dH2O в 500 л коллагена (концентрация запасов 3 мг/мл). Проверьте рН нейтрализованного коллагена с лакмусовой бумагой (рН должен быть 7,5 евро).</li>
	<li>Рассеять 100 л нейтрализованного раствора коллагена равномерно, используя предварительно охлажденный 200 л оконечности над поверхностью 3,5 см блюдо, установленное на льду.</li>
	<li>Инкубировать ночь в стандартных условиях культуры (инкубатор с 5% CO2 при 37 градусах Цельсия). В день первичной изоляции гепатоцитов добавьте 1 мл предварительно разогретого (37 градусов По Цельсию) PBS к первому коллагеновому слою. Разрешить коллагена для регидратации в течение 2-3 ч при 37 градусах Цельсия.</li>
</ol>3. Оборудование настроено
<ol><li>Подготовьте все оборудование, указанное в таблице материалов, и установите, как показано на рисунке 1.</li>
</ol>4. Хирургическая процедура
<ol><li>Анестезия мыши путем внутримышечной инъекции плитки (60 мг/кг массы тела), золазепама (60 мг/кг) и ксилазина (4,5 мг/кг). Через несколько минут, подтвердить надлежащее анестезии на ноге щепотку. Если животное не реагирует на щепотку, перейдите на 4.2.</li>
	<li>Поместите обезопаживающую мышь на коврик для вскрытия и засучив нижние и верхние конечности, чтобы зафиксировать мышь в положении на спине. Swab живот с 70% этанола и открыть живот с V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Сложите кожу на грудь, чтобы раскрыть брюшную полость. Поместите рассекающий коврик под рассекающим сядр микроскопом.</li>
	<li>Согните иглу инсулинового шприца (30 G) под углом 45 градусов. Выставляют нижнюю полину вены (IVC), перемещая кишечник и толстую кишку в каудальном направлении.</li>
	<li>Заполните 2,5 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) раствора С в шприц 2 мл с канюлей. Убедитесь, что в канюле или шприцах нет пузырьков воздуха.</li>
	<li>Перед cannulation IVC, изменить положение доли печени, нажав их до диафрагмы с мокрой (PBS) ватным тампоном. Поместите шелковый шов вокруг IVC чуть ниже печени(Рисунок 2A, B).</li>
	<li>Введите 10 л гепарина (5000 U/mL) в вену портала с помощью инсулинового шприца с иглой 30 G, согнутой под углом 45 градусов(рисунок 2С).</li>
	<li>Чтобы канитование печени, сделать небольшой разрез с микрохирургическими ножницами в IVC непосредственно рядом с печенью (ниже шва; Рисунок 2D), который достаточно велик, чтобы вставить канюли. Закрепите канюлу в положении с помощью швов и двух хирургических узлов(рисунок 2E).</li>
	<li>Вырезать вену портала(Рисунок 2F), чтобы перфузии буферов вытекать из печени, чтобы предотвратить расширение печени.</li>
	<li>Вручную пронизываете печень 1,5 мл предварительно разогретого раствора С, медленно нажимая шприц, подключенный к канюле (это должно занять 15 с). Удаление крови из печени путем обесцвечивания печени теперь можно наблюдать.</li>
	<li>Предварительно заполните перистальтический насос предварительно подогретым (37 градусов по Цельсию) раствором C. Проверьте перфузийный аппарат и убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха.</li>
	<li>Осторожно отключите канюлю от шприца и подключите ее к трубам перистальтического насоса, работающего со скоростью потока 2,5 мл/мин. Работайте быстро, но осторожно и убедитесь, что канюля остается в положении и что никакие пузырьки не попадают в трубку или канюлю.</li>
	<li>Пронизываете печень раствором С в течение 2 мин (5 мл раствора С). Измените раствор D и продолжайте перфузию еще 10 мин (25 мл раствора D).</li>
	<li>После того, как печень была проникнута, удалить его из брюшной полости. Печень теперь будет очень хрупкой и бледного цвета(рисунок 3).</li>
</ol>5. Изоляция первичных гепатоцитов
<ol><li>Удалите печень из мыши. Канюля будет по-прежнему привязаны к печени, так что используйте щипцвы, чтобы поднять канюли с печенью, и тщательно отрезать все соединения фасции. Перенесите печень в трубку 50 мл, содержащую 20 мл предварительно прогретого раствора Е.</li>
	<li>Держите канюли с печенью с помощью щипков и отмежевать ткани, потирая печень вокруг стенки трубки для передачи изолированных гепатоцитов в буфер. Держите изолированные клетки на льду. ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные первичные гепатоциты жизнеспособны в течение нескольких часов, сохраняя на льду. Пользователи могут повторить шаги 4.1 до 5.2 изоляции первичных гепатоцитов от другой донорской мыши, если это необходимо, или приступить к следующему шагу.</li>
	<li>Поместите 70 мкм нейлоновой ячейки ситечко на вершине 50 мл трубки и фильтровать изолированные клетки.</li>
	<li>Центрифуга трубки на 50 х г и 4 кв к в течение 5 мин. Аспирируй супернатант. Чтобы удалить мертвые клетки и увеличить процент жизнеспособных клеток, resuspend гранулы в 20 мл 40% percol в DMEM.</li>
	<li>Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант, содержащий мертвые клетки и resuspend гранулы в 20 мл раствора Е.</li>
	<li>Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 10 мл раствора Е.</li>
	<li>Проверьте первичный выход гепатоцитов и жизнеспособность с помощью trypan синий окрашивания. Подсчитайте номер ячейки с помощью камеры подсчета клеток Нойбауэр и отрегулируйте концентрацию клеток до 3,75 х 105 жизнеспособных ячеек/мл. Держите клетки на льду.</li>
</ol>6. Культивирование первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах
<ol><li>Подготовка гепатоцитов культуры среды (HCM). Добавьте 15 кл глюкагона (1 мг/мл), 15 л гидрокортизона (50 мг/мл) и 40 л инсулина (10 мг/мл) до 50 мл полной среды (DMEM, высокая глюкоза, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина).</li>
	<li>Равномерно рассеять 2 мл (5 х 105 клеток/мл) жизнеспособных первичных гепатоцитов в предварительно покрытой 3,5 см блюдо. Инкубировать клетки с 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию на 3 ч. Важно: Равномерно распределить клетки, наклоняя блюдо во всех направлениях непосредственно перед тем, как положить блюдо в инкубатор.</li>
	<li>Приготовьте нейтрализованный коллаген I (100 л/3,5 см блюдо; т.е. достаточный объем для всех блюд, как описано выше ,шаг 2.1). Держите на льду до использования.</li>
	<li>После 3 ч тщательно удалите средние и неприсоединенные клетки и добавьте 100 кЛ нейтрализованного коллагена I к каждому 3,5 см блюду, чтобы сформировать верхний слой коллагена бутерброд на клетках. Инкубировать сэндвич с коллагеном в стандартных условиях клеточной культуры (5% CO2 при 37 градусах Цельсия) на 1 ч. После 1 ч инкубации, тщательно добавьте 2 мл HCM.</li>
	<li>После 24 ч культуры, изменить среду HCM на свежий.</li>
	<li>Культура в течение 3-8 дней, в зависимости от образования желчных каналикули. Проверьте культуру каждый день под микроскопом(рисунок 4). Изменение HCM каждый второй день.</li>
</ol>7. Иммуномаркировка первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах
<ol><li>Удалите средства массовой информации из гепатоцитов бутерброды, а затем тщательно мыть с предварительно подогретых PBS. Исправьте культуры сэндвича с 1 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).</li>
	<li>После фиксации, мыть бутерброды 3x в течение 10 минут в 2 мл PBS 0,1% Tween 20 (PBS-T).</li>
	<li>Пермяки клетки с 1 мл 0,1 м глицин, 0,2% Тритон X-100 в PBS на RT для 1 ч. Вымойте 3x на 10 мин в PBS-T.</li>
	<li>Аккуратно нарушить верхний слой коллагена, используя 10 л погрузочный наконечник подключен к вакуумной аспирации для обеспечения достаточного проникновения антител.</li>
	<li>Блок с 1 мл 5% BSA в PBS-T (т.е. блокирующий раствор) для 2 ч. Инкубировать с первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе на ночь при 37 градусах Цельсия. Вымойте 3x в течение 15 мин в PBS-T.</li>
	<li>После мытья, инкубировать со вторичными антителами при 37 кс на 5 ч. Вымойте 3x в течение 15 минут в PBS-T следуют 1x мыть с дистиллированной H2O.</li>
	<li>Гора с анти-увядание монтажа средств (см. Таблица материалов) для микроскопии.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gissen, P., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+hepatocyte+polarity+and+liver+disease.">Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease.</a> Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).</li><li>LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+maintenance+of+bile+canalicular+networks+in+collagen-sandwiched+hepatocytes.">Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes.</a> Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).</li><li>Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+organization+of+the+bile+canalicular+cytoskeleton+with+special+reference+to+actin+and+actin-binding+proteins.">The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins.</a> Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).</li><li>Herr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+alpha-catenin+elicits+a+cholestatic+response+and+impairs+liver+regeneration.">Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6835 (2014).</li><li>Yeh, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver-specific+beta-catenin+knockout+mice+have+bile+canalicular+abnormalities,+bile+secretory+defect,+and+intrahepatic+cholestasis.">Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis.</a> Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).</li><li>Pradhan-Sundd, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+catenin+loss+in+murine+liver+causes+tight+junctional+deregulation+and+progressive+intrahepatic+cholestasis.">Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis.</a> Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).</li><li>Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+development+and+protein+trafficking+in+hepatocytes+lacking+E-cadherin/beta-catenin-based+adherens+junctions.">Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).</li><li>Jirouskova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin+controls+biliary+tree+architecture+and+stability+in+cholestasis.">Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis.</a> Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).</li><li>Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+bile+canalicular+network+formation+and+maintenance+by+AMP-activated+protein+kinase+and+LKB1.">Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1.</a> Journal of Cell Science. 123, 3294-3302 (2010).</li><li>Woods, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LKB1+is+required+for+hepatic+bile+acid+transport+and+canalicular+membrane+integrity+in+mice.">LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice.</a> Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).</li><li>Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+kinase+B1+regulates+hepatocellular+tight+junction+distribution+and+function+in+vivo.">Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo.</a> Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).</li><li>Sarnova, L., Gregor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+system+architecture:+experimental+models+and+visualization+techniques.">Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques.</a> Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).</li><li>Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repolarization+of+hepatocytes+in+culture.">Repolarization of hepatocytes in culture.</a> Hepatology. 25 (1), 167-172 (1997).</li><li>Bhandari, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tissue+engineering:+a+role+for+co-culture+systems+in+modifying+hepatocyte+function+and+viability.">Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability.</a> Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).</li><li>Godoy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+2D+and+3D+in+vitro+systems+using+primary+hepatocytes,+alternative+hepatocyte+sources+and+non-parenchymal+liver+cells+and+their+use+in+investigating+mechanisms+of+hepatotoxicity,+cell+signaling+and+ADME.">Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME.</a> Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).</li><li>Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+primary+human+hepatocytes+and+hepatoma+cell+line+Hepg2+with+regard+to+their+biotransformation+properties.">Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties.</a> Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).</li><li>Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+cytokeratin+filament+network+breakdown+in+cells+treated+with+the+phosphatase+inhibitor+okadaic+acid.">In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid.</a> Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).</li><li>Chalupsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAM10/17-Dependent+Release+of+Soluble+c-Met+Correlates+with+Hepatocellular+Damage.">ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage.</a> Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Horner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Percoll+purification+on+isolation+of+primary+human+hepatocytes.">Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).</li><li>Severgnini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+two-step+method+for+isolation+of+functional+primary+mouse+hepatocytes:+cell+characterization+and+asialoglycoprotein+receptor+based+assay+development.">A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development.</a> Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Использование мыши первичной гепатоцитов культур имеет важное значение для исследований в пробирке, чтобы лучше понять сигнальные процессы, участвующие в создании поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной структуры, и секреции желчи. Проблемы в изоляции и долгосрочной культуре мыши первичных гепатоцитов в 2D-культуре привели к изобретению нескольких технических подходов с повышенной изоляционностью и долговечностью изолированных клеток, каждый из которых имеет несколько преимуществ и Недостатки. В настоящее время широко признано, что 2D культуры первичных гепатоцитов имитируют лишь ограниченное количество атрибутов биологии печени в течение короткого периода времени. Таким образом, 3D-культивирование в расположении сэндвича коллагена широко заменяет 2D условия, особенно когда сосредоточено на функции цитоскелета в биологии печени (например, токсические лекарственные эффекты или пространственная организация переноса желчи).
С 1980-х годов было описано несколько протоколов изоляции гепатоцитов мыши с различными модификациями. Двухступенчатый коллагенеза перфузии подход стал широко использоваться во многих лабораториях. Добавление градиентной центрифугирования в протокол изоляции позволяет удалить мертвые клетки19,20 и значительно увеличивает количество жизнеспособных клеток (здесь, обычно до 93%). Несмотря на то, что этот шаг расширяет время обработки клеток и приводит к уменьшению числа клеток21, этот шаг рассматривается как необходимый в 3D коллагена сэндвич культуры для надлежащего образования желчных каналикулярной сети. Кроме того, более важно действовать быстро и точно во время перфузионных шагов, что сокращает время обработки клеток.
Другими важными факторами, повышающие жизнеспособность клеток и их способность юбилярной сети в 3D, является использование свежеприготовленных растворов и избегание пузырьков во время перфузии. Поэтому решения должны быть подготовлены в день изоляции гепатоцитов мыши, а перистальтический насос и трубки должны быть проверены при смене растворов. Если соблюдать протокол, то изоляция первичных гепатоцитов должна быть успешной с высокой урожайностью жизнеспособных клеток.
Другим важным фактором в долгосрочной культуре 3D гепатоцитов является первоначальный источник первичных гепатоцитов, которые используются. Важно использовать животных, которым от 8 до 12 недель, которые служат оптимальными донорами гепатоцитов. Использование гепатоцитов пожилых животных было не столь успешным в долгосрочной культуре, так как эти гепатоциты меняли свою морфологию чаще, деполяризовали и перестали формировать каналикулярные сети. Кроме того, нашивание гепатоцитов на правильно нейтрализованном коллагеновом геле, образованном из относительно высококонцентрированного раствора, является жизненно важным шагом. В большинстве протоколов используются концентрации около 1 мг/мл. После многих оптимизаций, концентрация 1,5 мг/мл является оптимальной для долгосрочного выращивания гепатоцитов и обеспечивает высокоорганизованные гепатоциты с сформированными желчных каналикули.
Этот простой в последующей протокол позволяет долгосрочное выращивание первичных гепатоцитов мыши. Представитель результаты демонстрируют широкий спектр использования для 3D культивированных первичных гепатоцитов мыши при изучении роли цитоскелетных компонентов в формировании желчных каналикули.

Гепатоциты, центральные клеточные структуры печени, которые отвечают за ее метаболические функции, являются однозначно поляризованными эпителиальными клетками. Их поляризация, появляющаяся у млекопитающих вскоре после рождения, приводит к образованию желчной каналикулярной сети и необходима для правильной секреции желчи. Аптические мембраны гепатоцитов коллективно образуют желчь canaliculi, в то время как базальные мембраны остаются в контакте с эндотелием синусоидов. Потеря поляризации гепатоцитов приводит к перераспределению транспортеров желчи и приводит к патологическим процессам, связанным с задержкой желчи в печени (т.е. холестаз).
Создание и поддержание поляризации гепатоцитов и развитие желчных каналикули влечет за собой сложные механизмы. Основные процессы зависят от коллективного взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, контактами клеток и взаимодействиями с внеклеточной матрицей1. Цитоскелет гепатоцитов состоит из всех трех сетей нити, актина цитоскелет, микротрубочки, и промежуточных нитей, которые обеспечивают структурную поддержку каналикулярного образования. Дифференциальная роль компонентов цитоскелета в регенерации и поддержании желчных каналических сетей ранее была проиллюстрирована in vitro в 3D коллаген-сэндвич гепатоцитных культурах2.
Актин микрофиламентов и микротрубочек имеют важное значение на начальных стадиях поляризации мембраны гепатоцитов в местах генерации canaliculus2. Актин цитоскелет устанавливает структуру и функцию желчных каналикули, образуя мембранно-ассоциированные микрофилеты и окружное кольцо, тем самым поддерживая каналическую архитектуру и вставляя актиновый цитоскелет в плотные и придерживающиеся узлов3. Кольцо кератиновых промежуточных нитей за пределами актина цитоскелета еще больше стабилизирует каналикулярную структуру3.
Важность белков в гепатоцитных стыковочных комплексах в организации желчных каналикули архитектуры была хорошо документирована в нескольких выбивания моделей мыши, которые показывают искаженные каналикули у мышей, не хватает как жесткие и / или приверженцев соединения белков4,5,6. Удаление адептов соединения белка-катенина, как было показано, приводит к дезорганизации гепатоцитов актин цитоскелет, расширение желчных каналикулярных люменов, вытекающей жесткой соединения, и эффективно холестатический фенотип4. Кроме того, исследования in vitro показали важность связующих компонентов соединения E-кадерин и q-катенин в реконструкции гепатоцеллю apical lumen и торговли белками7.
Поразительно, абляция цитоскелет кросспригвации белка плектин, который является основным организатором кератина, выявил фенотипы сопоставимы с теми, которые связаны с актина цитоскелет8. Это говорит о решающей роли кератина промежуточных нитей в поддержке каналикулярной структуры. В пробирке исследования с использованием 3D гепатоцитов коллагена бутерброды также показали важность AMP активированного белка киназы и его восходящий активатор LKB1 в желчных каналикулярныхсетейформирования 9 . Эти выводы были затем дополнительно подтверждены последующими исследованиями in vivo10,11. Таким образом, стало ясно, что исследования in vitro необходимы для углубления понимания сигнальных процессов, связанных с установлением поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной сети и секреции желчи.
Основной проблемой в изучении процессов, связанных с образованием желчи и его реакцией на патологические ситуации in vitro, является использование условий клеточной культуры, которые очень напоминают ситуацию in vivo12. Свежеизолированные первичные гепатоциты не поляризуются; таким образом, они теряют свою функцию, морфологию и функциональные желчные каналикули в 2D-культурных условиях (например, изменения в регуляции генов, поляризации и дедифференциации13,14,15). Несмотря на это факт, свежеизолированные гепатоциты наиболее точно отражают природу печени invivo, в отличие от печено-производных клеточных линий16. Даже если они были использованы в прошлом, увековеченные клеточные линии не оказывают эпителиально-как характерная морфология гепатоцитов, и желчные каналикулярные люмены, образованные этими клетками напоминают печень canaliculi плохо7. В последнее время 3D культур первичных гепатоцитов, как от мышей и крыс, стали полезным инструментом для изучения процессов, связанных с образованием желчных каналикулярных сетей in vitro9. Первичные гепатоциты, культивированные между двумя слоями коллагена (именуемые 3D коллагеном, могут быть повторно поляризованы в течение нескольких дней. Из-за высоких технических требований, необходимых при культивировании мышей гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах, здесь мы представляем сложный протокол для изоляции, культивирования, и иммуномаркировки мыши гепатоцитов, встроенных в 3D коллагенбутерброды бутерброды для того, чтобы охарактеризовать участие цитоскелетных компонентов во время формирования желчных каналов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>15-1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arteriotomy Cannula (1mm)</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I. from Rat tail (3mg/ml)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (from Clostridium Hystolyticum)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose monohydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3054.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Pufferan</td>
			<td>G 05104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin (5000 U/mL)</td>
			<td>Zentiva</td>
			<td>8594739026131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (30G)</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>320829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>T888.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microsurgical scissor</td>
			<td>FST</td>
			<td>15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump Minipuls Evolution</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F110701, F110705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>P10144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-2124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk braided black</td>
			<td>Chirmax</td>
			<td>EP 0.5 &#8211; USP 7/0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>ROTH</td>
			<td>3957.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 2 ml</td>
			<td>Chirana</td>
			<td>CH002L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Nuve</td>
			<td>NB 9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 &#956;m, diam. 47 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA7402004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>2629-990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zoletil</td>
			<td>Vibrac</td>
			<td>VET00083</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and 3d collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro

Гепатоциты являются центральными клетками печени, отвечающими за ее метаболическую функцию. Таким образом, они образуют однозначно поляризованный эпителий, в котором два или более гепатоцитов способствуют апикальных мембран, образуя желчь канализациической сети, через которую выделяется желчь. Поляризация гепатоцитов необходима для правильного формирования каналикуляров и зависит от взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, клеточными контактами и внеклеточной матрицей. В пробирке исследования гепатоцитов цитоскелет атравимы участия в формировании canaliculi и его ответ на патологические ситуации препятствуют отсутствие клеточной культуры, которая будет очень похож на структуру сети canaliculi in vivo. Описано здесь протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослой мыши с помощью модифицированного метода перфузии коллагенеза. Также описано производство культуры в 3D коллагенсэндвич настройки, которая используется для иммуномаркировки компонентов цитоскелета для изучения желчных каналикулярных формирования и его ответ на лечение в пробирке. Показано, что гепатоцит3D коллагена сэндвич культур реагировать на лечение с токсинами (этанол) или актин цитоскелет изменения наркотиков (например, блеббистатин) и служить ценным инструментом для в пробирке исследования желчных каналикули формирования и функции.

Мышиные первичные гепатоциты были выделены и посеяны в 3D коллагеновы бутерброды. Bile canaliculi между двумя смежными клетками начали образовываться в течение нескольких часов после посева. Клетки образовывали кластеры и самоорганизовывались в приблизительно регулярной сети желчных каналикули в течение 1 дня(рисунок 4). В течение 3-6 дней, кластеры 5-10 клеток, как правило, наблюдались, с полностью поляризованными гепатоцитов формирования каналикулярной сети(рисунок 4).
Лечение первичных гепатоцитов мыши в 3D коллагеновых сэндвичах с токсином (этанол) или цитоскелет-изменяющими препараты (например, blebbistatin, окадаиновая кислота) привело к изменениям в гепатоцитцит цитоскелет, canaliculi ширина, форма, и количество желчных каналикули иллюстрируется иммуномаркировки с антитела к кератину 8 (наиболее обильные кератина в гепатоцитов), фаллоидин (визуализация F-актин), и антитела к жесткой белка перекресток zon-ocquo Рисунок 5).
Лечение этанолом оказало лишь легкое воздействие на организацию кератина 8; однако, это увеличило мучительность (как видно из F-актина окрашивания) и распределение желчных каналикулярных ширин(рисунок 5). Интенсивность сигнала окрашивания ЗО-1 была снижена в этанол-обработанных желчных каналикули по сравнению с необработанными контроля, что свидетельствует о потере жестких узлов после лечения этанола. Ингибирование актомиозина контрактильность с блеббистатином значительно повлияло на форму и количество желчных каналикули. Регулярная каналикулярная сеть была реорганизована, по сравнению с необработанными гепатоцитами, в беспорядочную форму желчных каналикули с повышенной частотой толстых округлых желчных каналикули вместо тонких длинных (как видно в гистограмме каналикулярной ширины).
Кроме того, лечение окадановой кислотой (ОА), ингибирующей фосфатазы сильно влияет на физические свойства кератинов, как ранее показано8,17. ОА изменяет растворимость кератиновных нитей; таким образом, лечение привело к глубокой реорганизации кератина сетки, которая рухнула на большие перинуклеарные агрегаты. Как F-актин, так и плотный протеин соединения ЗО-1 не были локализованы в какие-либо конкретные структуры, что свидетельствует о почти полном исчезновении организованных желчных каналикули и полной потере полярности гепатоцитов. Остальные желчные каналикули были значительно сужены по сравнению с необработанными элементами управления, как видно на гистограмме ширины каналикулярной(рисунок 5).
Для корреляции микроскопических наблюдений изменений в цитоскелете гепатоцитов с гепатоцелликальной биохимической реакцией на лечение, протокол также измерил уровни аланина аминотрансферазы (ALT) и аспартата трансаминаза (АСТ) (два фермента печени, которые обычно используются в качестве маркеров гепатоцеллической травмы) в супернатанте из 3D коллагеновых сэндвичей... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Лечение этанолом значительно повысило уровень как АЛТ, так и АСТ, что свидетельствует о серьезной гепатоцеллюлярной травме. Лечение blebbistatin не привело к каким-либо значительным изменениям в уровнях ALT и AST по сравнению с окадановой кислотой лечения, которое вызвало мягкие биохимические изменения с повышенным уровнем ALT, но никаких изменений в уровнях АСТ. Таким образом, биохимические маркеры гепатоцеллюлярной травмы измеряются в пробирке от гепатоцитов супернатанта, коррелирующих с цитоскелетными изменениями, наблюдаемыми иммуностогированием.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Экспериментальная настройка. (A)Мышь, закрепленная в положении на спине, помещается под рассекающим микроскопом перед операцией. Все необходимые хирургические инструменты помещаются на поднос. (B) Perfusion Suite во время перфузии печени мыши показаны силиконовые трубки подключения резервуарс с теплым буфером и проникнуты мыши. (C) Схематическое представление B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig2v2.jpg"> Рисунок 2: Открытие брюшной полости и каниляция IVC. Брюшко открывается V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Кожа складывается над грудью, чтобы разоблачить и увеличить брюшную полость. Чтобы разоблачить IVC, кишечник и толстая кишка тщательно перемещаются caudally. (A, B) Перед cannulation IVC, доли печени должны быть перемещены путем нажатия их вверх к диафрагме с PBS-мокрый ватный тампон. IVC затем тщательно отделены от окружающих тканей, и шелковый шов помещается вокруг IVC в непосредственной близости от печени. Панель B представляет схемы брюшной полости, показанные в панели А. Указаны доли печени, кишечник, нижняя полая вена (IVC, красный) и швы. (C) Гепарин вводится в вену портала (PV, стрелка) с инсулиновым шприцем (30 G игла согнута под углом 45 "). (D) Чтобы канюляции печени, IVC вырезованный непосредственно рядом с печенью (ниже шва). (E) Канюля вставляется и закреплены швами, связывая два хирургических узлов. (F) Вены портала полностью вырезать, чтобы свободный отток буфера, предотвращая расширение печени. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig2alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig3v2.jpg"> Рисунок 3: Представитель изображения печени до и после перфузии. (A, B) Канированная печень была резечена и проникнута в течение 12 мин при скорости потока 2,5 мл/мин. Обратите внимание на значительно обесцвеченную печень после перфузии (B) по сравнению с свежерезеченной печенью (А). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig3alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig4v2.jpg"> Рисунок 4: 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши. Представитель ярко-поля изображения мыши первичных гепатоцитов культивируется в течение 1, 2 и 3 дней в 3D условиях. Следует отметить, что более крупные кластеры высокоорганизованных клеток образуются после 3 дней в культуре. Коробок области показывают 3x увеличенные изображения. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig4alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig5v2.jpg"> Рисунок 5: Оценка морфологического ответа на токсический стресс с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Первичные гепатоциты мыши, культивированные в 3D коллагеновых сэндвичах, лечились токсинами (этанол, блеббистатин или окадаевская кислота) на 3-й день культуры. Фиксированные клетки были окрашены для визуализации цитоскелетных компонентов: кератин 8 (зеленый), F-актин (красный), и zonula occludens-1 (ЗО-1, пурпурный) иммунофлуоресценции. Токсическая обработка привела к дезорганизации визуализированных цитоскелетных компонентов, а также к уменьшению количества и увеличению мучительности желчных каналикули. Ширина каналикуляров измерялась как в необработанных, так и в обработанных гепатоцитах и изображалась как гистограммы распределения ширины. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig5alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60507/60507fig6v2.jpg"> Рисунок 6: Биохимический анализ реакции 3D гепатоцитов коллагена бутерброды с токсичными травмами в пробирке. ALT и AST, устоявшиеся маркеры гепатоцеллюлярной травмы, были измерены в супернатанте из 3D гепатоцитов коллагена бутерброды, обработанные токсинами (этанол, блеббистатин, и окадаиновая кислота). ALT и AST были повышены в обработанных клетках по сравнению с необработанными. Данные сообщаются как арифметические средства - SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60507/60507fig6alarge.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Фондовый решение A (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация (г/литр)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>80</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4No7H2O</td>
			<td>1.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4No2H2O</td>
			<td>0.598</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Биржевое решение A рецепт.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Фондовый раствор B (10x)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td>Окончательная концентрация (г/литр)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>69</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>1.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4No7H2O</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>2.772</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Рецепт фондового раствора B.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Решение C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Фондовый решение A (10x)</td>
			<td>5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,1094 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
			<td>0,0095 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>до 50 мл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 3: Рецепт фондового раствора C.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Решение D</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Стоковое решение A (10x)</td>
			<td>3 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,065 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,0125 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>до 30 мл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 4: Рецепт фондового раствора D.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Решение E</td>
		</tr>
<tr>
<td>Реагента</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Стоковое решение B (10x)</td>
			<td>5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0,1 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глюкозы</td>
			<td>0,045 г</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>до 50 мл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 5: Биржевое решение E рецепт.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro at JoVE.com

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Представлен протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослых мышей с использованием модифицированной методики перфузии коллагенеза. Также описана долгосрочная культура гепатоцитов в 3D коллагенсэндвиче, а также иммуномаркировка цитоскелетных компонентов для изучения образования желчных каналикуляров и его реакции на лечение.

Изоляция и 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши для изучения роли цитоскелета в Bile Canalicular Формирование в Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Этот протокол облегчает изоляцию и воспроизводимую долгосрочную культуру гепатоцитов мыши в среде сэндвича 3D коллагена для изучения формирования канонической структуры и ее реакции на лечение в пробирке. После того, как метод был освоен, это быстрый метод для получения больших объемов высокой жизнеспособности и чистой популяции гепатоцитов мыши для исследований in vitro. Демонстрацией процедуры будет Ленка Сарнова, техник из нашей лаборатории.За день до первичной изоляции гепатоцитов добавьте 100 микролитров 10X DMEM, 485 микролитров дистиллированной воды и 15 микролитров одного гидроксида молярного натрия в 500 микролитров в крысиный хвост коллагена. Проверьте рН нейтрализованного коллагена. Она должна быть около 7,5.Используя предварительно охлажденный 200 микролитровых пипеток наконечник, распространение 100 микролитров нейтрализованного раствора коллагена над каждым из пластиковых 3,5 сантиметра диаметром культуры блюда на льду и место блюда в стандартных условиях культуры на ночь. На следующее утро, регидратировать коллагена слоев с одним миллилитр 37 градусов по Цельсию PBS на блюдо, по крайней мере три часа при 37 градусов по Цельсию. Чтобы изолировать печень, подтвердив отсутствие реакции на щепотку ноша, поместите анестезированные мыши на коврик для вскрытия в положении на спине и ленты нижних и верхних конечностей к коврику.Шваб брюшной полости с 70%этанола и сделать V-образный разрез из лобковой области для каждого forelimb. Сложите кожу над грудью, чтобы раскрыть брюшную полость и поместите коврик под рассекающий микроскоп. Перемещение тонкой кишки и толстой кишки в хвостовом направлении подвергать IVC и загрузить два миллилитров шприца с 2,5 миллилитров 37 градусов по Цельсию решение C.Connect шприц к канюле и использовать PBS пропитанной ватным тампоном, чтобы нажать печень до диафрагмы.Поместите пропитанный шов вокруг IVC чуть ниже печени. Затем с помощью инсулинового шприца, оснащенного 30-дюймовой иглой, согнутой под углом 45 градусов, ввилите в портал 10 микролитров по 5 000 единиц на миллилитр гепарина. Чтобы канюлировать печень, используйте микрохирургические ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в IVC непосредственно рядом с печенью и вставить канюлю в разрез.Безопасные канюли на месте с швами и два хирургических узлов и сократить портал вены, чтобы перфузии буферов вытекать из печени. Затем медленно угнетают поршень шприца, чтобы пронизать печень двумя миллилитров раствора в течение примерно 15 секунд. Когда все решение было доставлено, предварительно заполнить перистальтический насос со свежим 37 градусов по Цельсию раствор C и проверить перфузионный аппарат, чтобы убедиться, что Есть нет пузырьков воздуха в системе.Аккуратно отсоедините канюлю от шприца и быстро, но осторожно соедините трубы бегущего перистального насоса с канюлей. Немедленно начните перфузию со скоростью потока 2,5 миллилитров в минуту. Через две минуты переключитесь на раствор D и продолжайте перфузию еще на 10 минут.В конце перфузии, тщательно собрать печень в 50 миллилитров конической трубки, содержащей 20 миллилитров 37 градусов по Цельсию решение E.To изолировать первичные гепатоциты, держа печень канюли, руб ткани вокруг стенки трубки, чтобы постучать гепатоцитов в буфер. Когда все ткани были пюре, передать ткани суспензии в 70 микрометровый поры нейлоновый ситечко для фильтрации изолированных клеток в новую 50 миллилитровую трубку. Осадок клеток печени центрифугации и повторно гранулы в 20 миллилитров 40%Percoll в DMEM.Отделить живые и мертвые клетки центрифугации и повторно гранулы в 20 миллилитров раствора E.After центрифугирования клеток снова, повторно гранулы в 10 миллилитров свежего раствора E для подсчета. После подсчета, настроить первичный гепатоцитов рассчитывать до 3,75 раз 10 до пяти жизнеспособных клеток на миллилитр гепатоцитов культуры среды. Для культуры изолированных первичных гепатоцитов в 3D коллаген бутерброды, использовать один миллилитр пипетки равномерно распределить два миллилитров клеток на каждый коллаген покрытием 3,5 сантиметра диаметром блюдо.Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры на три часа. Во время инкубации приготовьте 100 микролитров нейтрализованного крысиного хвоста коллагена по одному раствору на тарелку, как это было продемонстрировано. В конце инкубации тщательно замените средние и незакрепленные клетки 100 микролитров нейтрализованного коллагена на тарелку и верните пластины в инкубатор клеточной культуры на час.Когда коллаген затвердел, осторожно добавьте два миллилитров свежей среды культуры гепатоцитов к каждому блюду и верните культуры в инкубатор в течение трех-восьми дней, ежедневно проверяя культуры под микроскопом. Для иммунолабеля первичных гепатоцитов в 3D коллаген бутерброды, мыть каждый бутерброд тщательно с 37 градусов по Цельсию PBS и исправить культур с одним миллилитр 4%paraformaldehyde в PBS на блюдо в течение 30 минут при комнатной температуре. В конце фиксации, мыть посуду три раза в течение 10 минут в двух миллилитров PBS дополняется 0,1%Tween 20 за стирку.После последней стирки, permeabilize клетки с одним миллилитр 0,1 молярного глицина и 0,2%Triton X-100 в PBS в течение одного часа при комнатной температуре, а затем три моет в PBS плюс Tween 20, как только что продемонстрировали. Затем используйте наконечник нагрузки на 10 микролитров, подключенный к вакууму, чтобы мягко нарушить верхний слой коллагена и блокировать любые неспецифические связывания с одним миллилитром 5%бычьего альбумин сыворотки в PBS Tween в течение двух часов. В конце инкубации добавьте первичные антитела интереса, разбавленные блокирующим раствором, к каждому блюду и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию.На следующее утро, мыть посуду с тремя 15-минутные моет в PBS Tween следуют маркировки с соответствующими вторичными антителами при 37 градусов по Цельсию в течение пяти часов. В конце инкубации, мыть культур два раза с PBS Tween и один раз с дистиллированной водой, как попродемонстрировано перед монтажом блюдо с анти-увядание монтажа среды для микроскопии. В течение одного дня посева в 3D-сэндвичах с коллагеном первичные гепатоциты мыши образуют кластеры и самоорганикуются в примерно обычной сети желчных каналикули.В течение трех-шести дней, кластеры от пяти до 10 клеток, как правило, наблюдается с полностью поляризованных гепатоцитов формирования каналикулярной сети. Лечение либо токсином, либо цитоскелетными препаратами приводит к изменениям в цитоскелете гепатоцитов и ширине, форме и количестве желчных каналикули. Хотя обработка этанолом проявляет лишь мягкое влияние на организацию кератина 8, она увеличивает тортуозность и распределение ширины желчных каналов.Интенсивность сигнала окрашивания ЗО-1 снижается в обработанных этанолом желчных каналикулах по сравнению с необработанными контролями, что свидетельствует о потере типовых соединений после обработки этанолом. Ингибирование актомиозина контрактность с Blebbistatin вызывает образование беспорядочной формы, толстые, округлые желчи canaliculi. Кроме того, лечение окадаевой кислотой подавляет фосфаты, сильно влияющие на физические свойства кератинов и приводящие к желчи canaliculi, которые значительно сужены по сравнению с необработанных контроля.Кроме того, лечение этанолом значительно повышает уровень как аланина, так и аспартата аминотранспортазы предлагая тяжелые гепатоцеллюлярные травмы в то время как Blebbistatin лечение не приводит к каким-либо изменениям рассмотрения в уровнях трансаминазы и окадайской кислоты лечение вызывает мягкие биохимические изменения в аланина аминотрансферазы, но никаких изменений в аспарат аминотрансферазы выражения. Важно продолжать работать относительно быстро во время канкуляции и в начале перфузии и избегать пузырьков, походящих в систему перфузии. Клеточные лисаты могут быть собраны в дублирующие скважины для белков, представляющих интерес, чтобы определить, происходят ли изменения в экспрессии белка и/или стадиях активации во время лечения.

Research

JoVE Journal

Biology

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Тестирование зрительной чувствительности к скорости и направления движения в Ящерицы

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Выделение Рибосома связанных стадии становления Полипептиды<em&gt; В пробирке</em&gt;, Чтобы определить Поступательное сайтов Пауза Наряду мРНК

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Определение жирных кислот и окисления Липогенез в первичных гепатоцитов мышей

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

Изоляция мыши Эпидермальных кератиноцитов и их в пробирке клоногенной культуры

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Выделение первичных гепатоцитов крыс с помощью многопараметрического перфузионного контроля

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...