Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

ونحن ممتنون لناتالي فرناكس علي توجيهها ومساعدتها في التجارب. ونود أيضا ان نشكر السيد ايمانويل بلانيل سيرج ريفيست لاستخدامهما المجاهر والمجهر المحوري ، علي التوالي. وقد مول هذا العمل جزئيا بمنح دراسية من المجلس المكسيكي للعلم والتكنولوجيا (CONACYT ؛ إلى الاتحاد الأعصاب) ، ومؤسسه العائلة المختارة ومركز البحوث العلمية الخاصة (ك) ، وصندوق البحوث في كيبيك-سانتيه (إلى م.) ، معهد shastri الهندي الكندي (إلى K.B.) ، فضلا عن منحه ديسكفري من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا (NSERC) إلى M.E.T. M.E.T. يحمل كرسي البحوث الكندية (الطبقة الثانية) من اللدونة المناعية العصبية في الصحة والعلاج.

وتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية للجان المؤسسية للأخلاقيات الحيوانية ، وفقا للمجلس الكندي لرعاية الماشية ولجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه لافال.
1-التحصين المناعي
<ol><li>حدد ثلاثه أقسام الدماغ الماوس التي تحتوي علي منطقه الفائدة (ROI) (?...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

ويمكن تقسيم هذا البروتوكول في جزاين الحرجة: نوعيه تلطيخ والتحليل. إذا كان تلطيخ ليس الأمثل ، وسوف تفشل في تمثيل الخلايا الدقيقة بشكل كاف ، التالي تؤثر علي الكثافة ، والتوزيع ، وقياسات المورفولوجية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن الاستهانة بنسبه الخلايا النخاعية الطرفية للتسلل. هذا هو الإصدار الأم...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

سواء الحاده أو المزمنة ، ويتاثر التهاب العصبي باحكام من الخلايا الصغيرة ، والضامة المقيمين في الدماغ. يعتبر تصور الخلايا الصغيرة من خلال المناعة أمرا قيما لدراسة التهاب العصبي مع استخدام المجهر الضوئي ، وهي تقنيه يمكن الوصول اليها بشكل كبير. في ظروف التماثل المنزلي ، يتم عاده توزيع الخلايا الصغيرة في نمط غير متراكب يشبه الفسيفساء. هم يبديون [سومد] صغيره ان يمدد عمليات [رفيد]1, اي أحيانا اتصلت واحده آخر2. العمليات المجهرية التي يتم مسحها بشكل حيوي الدماغ parenchyma ، والتفاعل مع الخلايا العصبية ، وغيرها من الكريات الدبقيه ، والاوعيه الدموية خلال الظروف الفسيولوجية العادية3. وقد تم تجهيز ميكروليا مع ترسانة من المستقبلات التي تسمح لهم بأداء المهام المناعية والاستجابة للتغيرات في وسط الدماغ, لموت الخلايا, أو لتلف الانسجه. الاضافه إلى ذلك ، فانها تمارس الوظائف الفسيولوجية الرئيسية ، ولا سيما في تشكيل متشابك ، والصيانة ، والقضاء علي4،5.
ومن بين العلامات المتاحة المستخدمة لدراسة الخلايا الصغيرة ، المتاينه الكالسيوم ملزمه محول جزيء 1 (IBA1) هي واحده من أكثر استخداما علي نطاق واسع. IBA1 هو بروتين ملزم للكالسيوم يوفر تصورا استثنائيا لمورفولوجية المجهرية ، بما في ذلك العمليات البعيدة الدقيقة ، كما يؤكد ذلك المجهر الكتروني6. وقد كانت هذه الاداه مفيده في توصيف التحول ميكروجليال ، وكان يسمي سابقا "التنشيط" ، في مجموعه واسعه من الامراض الحيوانية نماذج7،8،9. في وجود التهاب عصبي ، وتشمل الاستجابة ميكروجليال: ميكروجليسيس التي يتم تعريفها بأنها زيادة في كثافة الخلوية ، والتغيرات في التوزيع التي تؤدي في بعض الأحيان إلى التكتل ، وتوسيع جسم الخلية ، وكذلك سماكه تقصير العمليات المرتبطة بالاشكال الأكثر اميبويد10،11،12،13.
المناعة محدوده بتوافر الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات محدده. الأهم من ذلك ، يتم التعبير عن IBA1 من قبل ميكروليا ولكن أيضا من قبل الضامة الطرفية التي تخترق الدماغ14. في حين أصبحت مراقبه الخلايا الايجابيه الIBA1ه داخل المخ علامة علي الميكروبات في هذا المجال البحثي ، تم الإبلاغ عن تسلل الضامة المحيطيه تحت ظروف مختلفه ، حتى هامشيا في الدماغ صحية15،16 و17و18. التالي ، فان استخدام IBA1 وحده لا يسمح التصور الانتقائي من الخلايا الصغيرة. الاضافه إلى ذلك ، تعتمد الضامة السمات الجزيئية والمورفولوجية من الخلايا الدقيقة المقيمة بمجرد انها تسللت إلى الدماغ ، التالي عرقله التمايز19. وهذا يمثل تحديا عند التحقيق في وظيفة كل من الخلايا الصغيرة والضامة التسلل.
في حين ان الخلايا الصغرى والضامة الطرفية لها أصول متميزة (علي سبيل المثال ، من كيس الصفار الجنيني ونخاع العظم ، علي التوالي20،21) ، هناك عدد متزايد من النتائج التي تشير إلى ان اثنين من السكان الخلية تمارس ادوار مختلفه في الدماغ19. التالي فمن الاهميه بمكان استخدام الأساليب التي تميز بين هذين الشعبين دون تلاعبات الغازية (اي النخاع العظمي الشمبانزي أو بارابيوسيس) التي يمكن ان تعدل كثافتها ، والتوزيع ، والشكل ، والوظيفة. وقد برزت TMEM119 كعلامة خاصه بالخلايا الصغيرة في جميع الحالات الصحية والامراض22. عند دمجها مع IBA1 ، يصبح هذا المؤشر مفيدا للتمييز بين هذه الخلايا وبين الضامة التي يتم التسلل اليها ، والتي هي TMEM119 سالبه و IBA1 موجبه. وفي حين انها تخضع للتنظيم التنموي ، فانه يتم التعبير عن TMEM119 في وقت مبكر من أيام ما بعد الولادة 3 (P3) و 6 (الرؤساء الستة) ، وتزداد باطراد حتى تصل إلى مستويات الكبار بين P10 و P1422. ويعبر عن IBA1 في وقت مبكر من اليوم الجنيني 10.5 (E 10.5)23. ولذلك فان البروتوكول المقترح لوضع العلامات المزدوجة مفيد لدراسة هذين النوعين من السكان طوال فتره ما بعد الولادة.
يوفر هذا البروتوكول إجراءات مناعية خطوه بخطوه تسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية. كما يشرح كيفيه اجراء تحليل كمي لكثافة ميكروجليال ، والتوزيع ، والمورفولوجية ، فضلا عن تحليل تسلل الضامة المحيطيه. في حين ان التحقيق في الخلايا الصغيرة والضامة الطرفية هو مفيد من تلقاء نفسها, هذا البروتوكول كذلك يسمح توطين الاجنه التهابيه العصبية; التالي ، فانه يعمل أيضا كمنبر لتحديد مناطق معينه للتحقيق فيها ، مع استخدام تقنيات تكميليه (ولكنها أكثر استهلاكا للوقت والموارد).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

هذا هو بروتوكول لتصور مزدوج من الخلايا الصغيرة والتسلل الضامة في انسجه المخ الماوس. TMEM119 (التي تسمي الميكروبات الصغيرة بشكل انتقائي) ، عندما يقترن IBA1 (الذي يوفر التصور استثنائيه من المورفولوجية) ، يسمح التحقيق في التغيرات في الكثافة والتوزيع والتشكل. التحديد الكمي لهذه المعلمات أمر مهم في توفير رؤى حول الأدوار التي تمارسها الخلايا الصغيرة ، الضامة المقيمة في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم توزيع الخلايا الصغيرة بانتظام في نمط يشبه الفسيفساء وتقدم سوما صغيره مع العمليات الدقيقة. ومع ذلك ، وكاستجابة للعوامل البيئية (اي الصدمات ، والعدوى ، والمرض ، أو الاصابه) ، يتم تغيير الكثافة الصغرى ، والتوزيع ، والمورفولوجية في مختلف الآداب ، اعتمادا علي الاهانه. بالاضافه إلى ذلك ، فان طريقه التلطيخ المزدوج الموصوفة تسمح بتصور الضامة التسلل في الدماغ استنادا إلى التعبير عن IBA1 ودون التنظير مع TMEM119. التالي فان هذا النهج يسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة المتسللة ، وهو أمر مطلوب لتوفير رؤى وظيفية لمشاركتها المتميزة في توازن الدماغ في مختلف سياقات الصحة والمرض. يدمج هذا البروتوكول أحدث النتائج في المناعة العصبية التي تتعلق بتحديد علامات انتقائية. كما انها بمثابه أداه مفيده لكل من خبراء المناعة العصبية ذوي الخبرة والباحثين الذين يسعون إلى دمج المناعة العصبية في المشاريع.

ويبين الشكل 1 المشاركة في وضع العلامات علي الخلايا الصغيرة التي تستخدم IBA1 و TMEM119 في الجزء الإكليلي من الحصين الظهري الذي يبلغ 20x بواسطة المجهر الفلوري. التلطيخ الناجح يكشف عن الأجسام الخلوية الصغيرة وعملياتها الدقيقة (الشكل 1ا − ج...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

يصف هذا البروتوكول سير العمل خطوه بخطوه للحصول علي التكلفة المناعية لIBA1 و TMEM119 ، بالاضافه إلى تحليل الكثافة الصغرى والتوزيع والتشكل ، فضلا عن تسلل الخلايا النقوي الطرفية في انسجه المخ الماوس.

تلطيخ المناعية باستخدام IBA1 و TMEM119 لكثافة Microglial ، المورفولوجية والطرفية الخلية النخاعية تحليل تسلل في الدماغ الماوس

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

هذا البروتوكول سوف تظهر لك كيفية وصمة عار microglia، وإجراء تحليل الكثافة الكمية والمورفولوجيا، وكذلك لتحديد حجم تسلل الضامة في الدماغ. هذه التقنية تسمح للباحث لقياس التغيرات في توزيع microglia والمورفولوجيا بطريقة كمية ولتمييز microglia من اختراق الضامة هذا بروتوكول التحليل يمكن تطبيقها بسهولة على نماذج الحيوانات الأخرى لقياس التغيرات في التوزيع microglial والمورفولوجيا حيث تتوفر الأجسام المضادة المضادة IBA1 و ANTI-TMEM119. ينصح بشدة لإجراء تعداد الخلايا وآثار أعمى لحالة تجريبية وتكون متسقة في الطريقة التي يتم بها تنفيذ هذا الإجراء.لبدء هذا الإجراء، افتح برنامج معالجة صورة مثل Fiji أو ImageJ يحتوي على أقرب مسافة جارة المكونات الإضافية المثبتة. افتح صورة 20X إذا كان المقياس موجودًا في بيانات التعريف للملف ولم يتم تعيينه تلقائيًا من بيانات التعريف. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين مقياس، ثم أدخل المعلومات الصحيحة.لتعيين المقياس يدويًا استنادًا إلى مقياس مطبوع على الصورة، حدد أداة الخط المستقيم. ضع المؤشر على حافة المقياس، وأثناء الضغط على مفتاح Shift، قم برسم خط أقرب ما يمكن إلى المقياس على الصورة. حدد تحليل، تعيين مقياس.سوف يطفو على النافذة ووضع الصحيح المسافة المعروفة وحدة الطول لتحديد بكسل لكل وحدة طول وانقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد صورة، لون، جعل مركب لإنشاء صورة مركبة من جميع القنوات. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين القياسات. تحقق من المنطقة، الوسطى والمحيط.في القائمة المنسدلة إعادة توجيه إلى، حدد فتح الملف ثم انقر فوق موافق. انتقل إلى الصورة، اللون، أداة القناة لفتح أداة القناة. استخدم أداة اختيار حر لرسم محيط تقريبي حول المنطقة ذات الاهتمام. انقر نقراً مزدوجاً فوق الأداة البيضاوية على شريط الأدوات لتمكين أداة الفرشاة التحديد.تأكد من تحديد المربع تمكين فرشاة التحديد ثم انقر فوق موافق. باستخدام فرشاة التحديد، ضبط محيط لتناسب أفضل المنطقة من الفائدة، ثم اضغط على T على لوحة المفاتيح في جميع أنحاء هذه المنطقة إلى السهم مدير Y. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M والنوافذ النتائج سوف يطفو على المنبثقة. انسخ النتائج ولصقها في ورقة بيانات واحفظ المعلومات المتعلقة بالمنطقة.بعد نسخ المنطقة التي تهمك، يمكنك إسناد المعلومات من نافذة النتائج بالنقر فوقه والضغط على مفتاح Backspace. حدد نافذة مدير ROI، وحدد تتبع العائد على الاستثمار وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر فوق موافق ثم انقر على حق الاسم الجديد من تتبع ROI وحفظ.انقر نقراً مزدوجاً فوق أداة فرشاة في شريط الأدوات. حدد اللون الأسود وحجم الفرشاة 10. تأكد من أن الخيار "الرسام" على التراكب غير محدد.في قناة TMEM119، ضع نقطة سوداء بعناية على مركز سوما لكل ميكروجليا إيجابية TMEM119. ضع نقطة بيضاء على وسط الخلايا غير إيجابية لـ TMEM119. كرر نفس الإجراء لكافة الخلايا الموجودة في منطقة الاهتمام.بعد ذلك، حدد صورة، لون، قناة سبليت، ستظهر نافذة لكل قناة. تحديد القناة التي تحتوي على التعليقات التوضيحية نقطة وإغلاق الإطارين الآخرين. لإعادة توجيه صورة قناة الانقسام الجديدة، انتقل إلى تحليل، تعيين القياسات.في القائمة المنسدلة إعادة التوجيه إلى، حدد صورة قناة الانقسام وانقر فوق موافق. ثم حدد صورة، اكتب، ثمانية بت. انتقل إلى ضبط الصورة وحدد العتبة. ضبط المتزلجون على طول الطريق إلى اليسار في كلا الشريطين.هذا سوف يترك فقط النقاط السوداء التي سوف تظهر الآن بيضاء. حدد المنطقة التي تهمك في نافذة مدير عائد الاستثمار. في شريط القوائم، حدد تحليل، تحليل الجسيمات.في مربع النص لحجم إدخال واحد إلى 20. يجب أن يظل مربع وحدات Pixel غير محدد بينما يجب تحديد المربع الذي يعرض نتائجه، تلخيص وإضافة إلى المدير. انقر فوق موافق لعرض إطار الملخص الذي سيعطي عدد النقاط.نسخ هذه المعلومات ولصقها على ورقة البيانات. ثم، حدد المكونات الإضافية NND لإظهار نافذة NND. كل رقم يمثل المسافة التي لكل microglia لديه إلى أقرب microglia المجاورة.نسخ ولصق كافة هذه المعلومات إلى ورقة البيانات. العودة إلى نافذة عتبة وضبط المنزلق أعلى على طول الطريق إلى اليمين، والتي سوف تترك كل من النقاط البيضاء مرئية، والآن تظهر بيضاء. حدد تحليل، تحليل الجسيمات لعرض تحليل الجسيمات المنبثقة نافذة.انقر فوق موافق لإظهار إطار الملخص الذي يوفر عدد النقاط. نسخ هذه المعلومات ولصقها في ورقة البيانات. انتقل إلى مدير ROI وحدد جميع النقاط.ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحفظ مع اسم الصورة. سيسمح هذا بحفظ كافة النقاط في ملف ZIP. أولاً، افتح ملفات الصور 4DX.ستظهر نافذة منبثقة تسألك عما إذا كان يجب فتح الصور في كومة. انقر فوق موافق. بعد ذلك، حدد صورة، مكدسات، ZProject لفتح نافذة الإسقاط Z. وتشمل جميع شرائح من الشريحة الأولى حتى الماضي.تأكد من تحديد الحد الأقصى كثافة ضمن نوع الإسقاط وانقر فوق موافق. انقر على النافذة الجديدة التي تحتوي على ZProject. اختر الصورة والألوان وقنوات الانقسام وقم بإجراء الآثار على صور قناة IBA1. في شريط القوائم، حدد تحليل، تعيين القياسات.تحقق من المنطقة، الوسطى والمحيط. في القائمة المنسدلة إعادة توجيه إلى، حدد الملف المفتوح وانقر فوق موافق. لتعيين المقياس يدويًا استنادًا إلى مقياس مطبوع على الصورة، حدد أداة الخط المستقيم. ضع المؤشر على حافة المقياس، وأثناء الضغط على مفتاح Shift، قم برسم خط أقرب ما يمكن إلى المقياس على الصورة.حدد تحليل، تعيين مقياس. نافذة ستظهر إدخال المسافة الصحيحة المعروفة ووحدة الطول لتحديد بكسل لكل وحدة طول وانقر فوق موافق. لقياس حجم سوما في قناة IBA1، قم برسم محيط تقريبي لـ soma باستخدام أداة التحديد الحر.انقر نقراً مزدوجاً فوق الأداة البيضاوية على شريط الأدوات لتمكين أداة فرشاة التحديد. تأكد من تحديد المربع تمكين فرشاة التحديد ثم انقر فوق موافق. باستخدام فرشاة التحديد، ضبط التتبع لتناسب أفضل سوما. يؤدي التكبير إلى تمكين الدقة أثناء هذه الخطوة.بعد ذلك، اضغط على المفتاح T لإضافة تتبع سوما إلى مدير ROI. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M لعرض النتائج. نسخ ولصق هذه النتائج إلى ورقة بيانات.انتقل إلى نافذة مدير ROI، وحدد المنطقة التي تهمك وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة التي تمت إعادة تسميتها من الفائدة وانقر حفظ. تأكد من أن الاسم يحدد أن التتبع هو سوما وحفظ الملف.لقياس منطقة التربيع في قناة IBA1، حدد أولاً أداة تحديد المضلع. انقر على أقصى عملية microglial مع أداة لبدء شكل المضلع. الذهاب حول microglia عن طريق النقر على نصائح من كل طرف عملية لتشكيل المضلع الذي يمثل أفضل المنطقة التي تغطيها arborizations microglial.عند اكتمال المضلع، انقر على نقطة البداية لإغلاقه. ثم اضغط على المفتاح T لإضافة التتبع إلى مدير ROI. حدد تحليل أو قياس أو اضغط على مفتاح M لإضافة البيانات إلى نافذة النتائج.نسخ هذه البيانات ولصقها في ورقة البيانات. لحفظ المعلومات المتعلقة بمنطقة التربيع، انتقل إلى نافذة مدير ROI، وحدد المنطقة ذات الأهمية وقم بتغيير الاسم لمطابقة اسم الصورة عن طريق الضغط على إعادة تسمية. انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة التي تمت إعادة تسميتها من الفائدة وانقر حفظ.تأكد من أن الاسم يحدد أن التتبع هو لـ التعقب وحفظ الملف. وصفت هذه الدراسة سير العمل خطوة بخطوة لتلوين مُناعي مشترك من IBA1 و TMEM119 و لتحليل كثافة الميكروفلالي، والتوزيع، والمورفولوجيا وكذلك من تسرب الخلايا النخاعية الطرفية في أنسجة الدماغ الماوس. يستخدم المجهر الفلوري لتصوير العلامات المشتركة من microglia باستخدام IBA1 و TMEM119 في القسم التاجي من الحصين الظهري في التكبير 20X.يكشف تلطيخ ناجح عن أجسام الخلايا الصغيرة وعملياتها الدقيقة. يسمح تلطيخ لتحديد كثافة وتوزيع microglial وتحديد مجموعات microglial والتسلل الضامة. يستخدم المجهر Confocal لتصوير الإجراء تتبع المبور المجهرية خطوة في التكبير 40X.تظهر هذه النتائج التمثيلية IBA1 إيجابية و TMEM119 microglia إيجابية وكذلك مثال على تتبع الجسم الخلية. من المهم أن تكون متسقة عند عد الخلايا وإيلاء الاهتمام لكل من إشارات IBA1 و TMEM119. هذه التقنية تسمح للباحث لتحديد مناطق الدماغ التي تتأثر بحافز معين والتي يمكن بعد ذلك دراسة أكثر تعمقا مع تقنيات تكميلية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة<em&gt; في فيفو</em&gt; باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

العزلة، وتثبيت، وتصوير الفلورة الغدد الكظرية الماوس

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

تحليل تقييد SAMHD1 عن طريق قياس التدفق الخلوي في خلايا U937 النخاعية البشرية

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

فصل المجموعات السكانية الفرعية للخلايا المناعية في عينات الدم المحيطية من الأطفال المصابين بكثرة الوحيدات المعدية

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...