Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

我们感谢娜塔莉·韦尔努对实验的指导和协助。我们还要感谢伊曼纽尔·普朗内尔博士和谢尔盖·里夫斯特博士分别使用荧光显微镜和共聚焦显微镜。这项工作的部分经费来自墨西哥科学技术委员会（CONACYT;F.G.I）、法米尔-乔奎特基金会和神经科学研究中心（CTRN;K.P.）、魁北克基金会-圣地基金会（至医学硕士）的奖学金。Shastri Indo-Canada 研究所（至 K.B.），以及加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）向 M.E.T.M.E.T.提供的发现补助金，担任加拿大健康与治疗神经免疫可塑性研究主席（第二级）。

所有实验程序均符合机构动物伦理委员会的指导方针，符合加拿大动物护理理事会和拉瓦尔大学动物护理委员会。
1. 免疫染色
<ol><li>在大脑地图集的帮助下，选择三个包含感兴趣区域（ROI）（即海马）的小鼠大脑部分。将各部分放入塑料多孔板中，用 350 μL 的磷酸盐缓冲盐 （PBS） 覆盖它们（表 1）。 注：为了获得最佳效果，大脑应注入4%的甲醛，并使用振动...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

该协议可以分为两个关键部分：染色和分析的质量。如果染色不是最佳的，它将无法充分表示微胶质细胞，从而影响密度、分布和形态测量。此外，渗透周围骨髓细胞的比例可能被低估。这是染色协议的优化版本，但有几个因素可能会导致图像不理想。即使动物的灌注不包括在本协议中，但如果大脑固定没有很好地执行，染色的质量将受到损害。此外，需要足够的灌注，以确保血管内没有可能干?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

无论是急性还是慢性，神经炎症都受到微胶质（大脑常住巨噬细胞）的严重影响。通过免疫染色可视化微胶质对于使用光显微镜（一种高度可访问的技术）研究神经炎症有价值。在静时条件下，微胶质通常以非重叠的马赛克状模式分布。他们表现出小索马，延长冲撞过程1，有时相互接触2。在正常生理条件下，微胶质电肿过程动态地测量脑气囊瘤，与神经元、其他胶质细胞和血管相互作用3。Microglia 配备了一个受体库，允许他们执行免疫学任务，并应对大脑环境的变化、细胞死亡或组织损伤。此外，它们还发挥关键的生理功能，特别是在突触形成、维持和消除4、5。
在用于研究微胶质的现有标记中，离子钙结合适配器分子1（IBA1）是使用最广泛的指标之一。IBA1是一种钙结合蛋白，提供微胶质形态的卓越可视化，包括精细的远端过程，电子显微镜6证实了这一点。该工具在描述微胶质转化（以前称为"活化"）方面起到了重要作用，在动物疾病模型7、8、9中。在神经炎症的存在，微胶质反应包括：微胶质症，定义为细胞密度增加，分布变化，有时导致聚类，细胞体扩大，以及增厚和缩短与更多ameboid形状相关的过程10，11，12，13。
免疫染色受针对特定标记物的抗体的可用性的限制。重要的是，IBA1是由微胶质表达的，但也由渗入大脑14的外围巨噬细胞表达。虽然观察脑内的IBA1阳性细胞已成为这一研究领域微胶质的标志，但周围巨噬细胞渗透在各种条件下被报道，甚至在健康大脑中略有渗透。 ，17，18.因此，单单使用IBA1并不能选择性地可视化微胶质。此外，巨噬细胞在渗入大脑后，采用居民微胶质的分子和形态特征，从而阻碍分化。这是一个挑战，当调查微胶质和渗透巨噬细胞的功能。
虽然微胶质和周围巨噬细胞有不同的起源（例如，从胚胎蛋黄囊和骨髓，分别20，21），有越来越多的发现表明，两个细胞群发挥不同的角色在大脑19。因此，使用无侵入性操作（即骨髓嵌合体或寄生虫）来区分这两个种群的方法至关重要，这些方法可以调节它们的密度、分布、形态和功能。TMEM119已成为一个微胶质特异性标记跨越健康和疾病条件22。当与IBA1结合使用时，该标记对于区分这些细胞与渗透巨噬细胞（TMEM119阴性和IBA1阳性）非常有用。虽然它是发育调节，TMEM119早在产后第3天（P3）和6（P6），稳步增加，直到达到P10和P1422之间的成人水平。IBA1最早表示在胚胎日10.5 （E10.5）23。因此，拟议的双标签方案有助于研究这两个种群的产后生活。
该协议提供了一个分步免疫染色程序，允许在微胶质和周围巨噬细胞之间进行区分。并解释了如何对微胶质密度、分布和形态进行定量分析，以及对周围巨噬菌体渗透的分析。虽然微胶质和周围巨噬细胞的调查本身是有用的，但该协议进一步允许神经炎门厅的本地化;因此，它还作为一个平台，利用补充（然而，更耗费时间和资源）技术，确定要调查的特定区域。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

这是一种用于微胶质和渗透小鼠脑组织巨噬细胞的双重可视化的协议。TMEM119（选择性地标记微胶质），当与IBA1（提供其形态的异常可视化）相结合时，可以调查密度、分布和形态的变化。量化这些参数对于深入了解微胶体（大脑的常驻巨噬细胞）所扮演的角色非常重要。在正常生理条件下，微胶质定期以马赛克状模式分布，并呈现具有模压过程的小索马。然而，作为对环境因素（即创伤、感染、疾病或伤害）的反应，微胶质密度、分布和形态会以各种方式改变，具体取决于侮辱。此外，所述双染色方法允许根据其IBA1的表达，在不与TMEM119共定位的情况下，对大脑中渗透巨噬细胞进行可视化。因此，这种方法允许区分微胶质和渗透巨噬细胞，这是提供功能见解，使他们在健康和疾病的不同背景下对大脑平衡的独特参与。该协议集成了神经免疫学中与选择性标记物鉴定相关的最新发现。它还作为一个有用的工具，为有经验的神经免疫学家和研究人员寻求将神经免疫学纳入项目。

图1显示了使用IBA1和TMEM119在背海马的日冕部分使用的微胶合体共标记，通过荧光显微镜以20倍成像。成功的染色揭示了微胶质细胞体及其精细过程（图1A+C）。这种染色允许确定微胶质密度和分布，并识别微胶质簇（图1I）和渗透巨噬细胞（图1F）。</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

该协议描述了IBA1和TMEM119免疫荧光结化的分步工作流程，除了分析微胶质密度、分布和形态，以及小鼠脑组织中外周髓细胞渗透。

使用IBA1和TMEM119进行小鼠脑微胶质密度、形态学和周围骨髓细胞渗透分析的免疫荧光染色

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

该协议将告诉你如何染色微胶质，执行定量密度和形态分析，以及量化巨噬细胞渗透到大脑。该技术允许研究人员以定量方式测量微胶质分布和形态的变化，并区分微胶质与渗透巨噬细胞这种分析方案可以很容易地应用于其他动物模型，以测量微胶质分布和形态的变化，其中抗 IBA1 和抗TMEM119抗体可用。强烈建议进行与实验条件盲的细胞计数和痕迹，并在执行此程序的方式保持一致。要开始此过程，请打开安装了最近邻居距离插件的图像处理程序，如斐济或 ImageJ。如果比例包含在文件的元数据中，并且不会从元数据自动设置，则打开 20X 映像。在菜单栏上，选择"分析"，设置比例，然后输入正确的信息。要根据图像上刻印的刻度手动设置比例，请选择"直线"工具。将光标放在比例的边缘，在按 Shift 键时，绘制一条尽可能靠近图像比例的线。选择"分析"，设置比例。将弹出一个窗口，并设置正确的已知距离和长度单位，以确定像素的每个长度单位，然后单击"确定"。接下来，选择"图像、颜色、合成"以创建所有通道的复合图像。在菜单栏上，选择"分析"，"设置测量值"。检查区域、中心和周长。在"重定向到"下拉菜单中，选择"打开"文件，然后单击"确定"。转到"图像、颜色、通道工具"以打开通道工具。使用"手绘选择"工具绘制感兴趣区域周围的粗糙周长。双击工具栏上的椭圆形工具以启用选择画笔工具。确保选中"启用选择画笔"框，然后单击"确定"。使用选择画笔，调整周长以最适合感兴趣的区域，然后在整个区域中按键盘上的 T 以箭头 Y 管理器。选择"分析"、测量或按 M 键，结果窗口将弹出。将结果复制并粘贴到数据手册中，并保存有关区域的信息。复制感兴趣区域的区域后，通过单击"结果"窗口并按"退格"键来基础信息。选择 ROI 管理器窗口，选择 ROI 跟踪，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像名称。单击"确定"，然后右键单击 ROI 跟踪的新名称并保存。双击工具栏中的"画笔"工具。选择黑色和画笔大小 10。确保"叠加上绘制"选项未选中。在 TMEM119 通道中，小心地在每个 TMEM119 正微胶质的 soma 中心放置一个黑点。将白点放在对 TMEM119 不呈阳性的单元格中心。对感兴趣区域中包含的所有单元格重复相同的过程。接下来，选择"图像、颜色、分割通道"，将显示每个通道的窗口。标识具有点注的通道，并关闭其他两个窗口。要重定向新的拆分通道图像，请转到"分析"，设置测量。在"重定向到下拉菜单"中，选择"拆分通道图像"并单击"确定"。然后选择"图像""键入"八位。转到图像调整并选择阈值。在两个条形中向左调整滑块。这将只留下黑点，现在将显示为白色。在 ROI 管理器窗口中选择感兴趣的区域。在"菜单"栏中，选择"分析"，"分析粒子"。在"大小"的文本框中，输入 1 到 20。像素单位的框应保持未选中状态，而显示结果的框应选中"汇总"和"添加到管理器"。单击"确定"以显示"摘要"窗口，该窗口将给出点数。将此信息复制并粘贴到数据手册中。然后，选择插件 NND 以显示 NND 窗口。每个数字表示每个微胶质与最近相邻微胶的距离。将所有这些信息复制并粘贴到数据手册中。返回"阈值"窗口，并将顶部滑块一直向右调整，这会保持所有白点可见，现在显示为白色。选择"分析"，"分析粒子"以显示"分析粒子"弹出窗口。单击"确定"以显示提供点数的"摘要"窗口。将此信息复制并粘贴到数据手册中。转到 ROI 管理器并选择所有点。然后右键单击并保存图像的名称。这将允许保存 ZIP 文件中的所有点。首先，打开 4DX 图像文件。将出现一个弹出窗口，询问是否应该在堆栈中打开图像。单击"确定"。接下来，选择"图像、堆栈"和"Z 项目"以打开 Z 投影窗口。包括从第一个切片到最后一个切片的所有切片。确保在"投影类型"下选择"最大强度"，然后单击"确定"。单击包含 ZProject 的新窗口。选择图像、颜色、分割通道，并在 IBA1 通道的图像上执行跟踪。在"菜单"栏中，选择"分析"、设置测量。检查区域、中心和周长。在"重定向到"下拉菜单中，选择打开的文件，然后单击"确定"。要根据图像上刻印的刻度手动设置比例，请选择"直线"工具。将光标放在比例的边缘，在按 Shift 键时，绘制一条尽可能靠近图像比例的线。选择"分析"，设置比例。将弹出一个窗口。输入正确的已知距离和长度单位，以确定每个长度单位的像素，然后单击"确定"。要测量 IBA1 通道中的索马大小，请使用"手绘选择"工具绘制索马的粗糙周长。双击工具栏上的"椭圆形"工具以启用"选择画笔"工具。确保选中"启用选择画笔"框，然后单击"确定"。使用"选择画笔"，调整轨迹以最适合 soma。在此步骤中，放大将启用精度。接下来，按 T 键将 soma 跟踪添加到 ROI 管理器。选择"分析"、测量或按 M 键以显示结果。复制这些结果并将其粘贴到数据手册中。转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣的区域，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像的名称。右键单击重命名的感兴趣区域，然后单击"保存"。确保名称指定跟踪是 soma 的，并保存该文件。要测量 IBA1 通道中的轴化区域，请首先选择多边形选择工具。使用该工具单击微胶质过程四肢以启动多边形形状。单击每个过程四肢的尖端，形成一个多边形，最好地表示微胶中覆盖的区域， 在微胶中四周。当多边形完成时，单击起点以关闭它。然后，按 T 键将跟踪添加到 ROI 管理器。选择"分析、测量"或按 M 键将数据添加到"结果"窗口。将此数据复制并粘贴到数据手册中。若要保存有关树化区域的信息，请转到 ROI 管理器窗口，选择感兴趣的区域，然后通过按"重命名"更改名称以匹配图像的名称。右键单击重命名的感兴趣区域，然后单击"保存"。确保名称指定跟踪用于轴化并保存文件。本研究描述了 IBA1 和 TMEM119 免疫荧光共染色的分步工作流程，以及微胶质密度、分布和形态以及小鼠脑组织内周围骨髓细胞渗透的分析。荧光显微镜用于在20倍放大倍率下，使用 IBA1 和 TMEM119 在背海马的冠状部分对微胶质的共标记进行成像。成功的染色揭示了微胶质细胞体及其精细过程。染色允许确定微胶质密度和分布，并用于识别微胶质簇和渗透巨噬细胞。共体显微镜用于以 40 倍的放大倍率对步进微胶状跟踪过程进行成像。这些代表性的结果显示，IBA1阳性和TMEM119阳性微胶质以及细胞体追踪的例子。在计数细胞时保持一致，并注意 IBA1 和 TMEM119 的信号非常重要。这种技术使研究人员能够识别受特定刺激影响的大脑区域，然后通过补充技术更深入地研究这些区域。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

从人类胸腺髓样树突状细胞和上皮细胞的分离

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

科研

免疫与感染

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

与碘酸雪夫染色检测糖原的外周血单个核细胞

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

分离和流式细胞仪分析从缺血小鼠脑免疫细胞

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

分离和胶质瘤浸润外周血单个核细胞的流式细胞仪分析

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

评估视网膜小胶质细胞吞噬功能<em&gt;在体内</em&gt;使用基于流式细胞术流量测定

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

支气管肺泡灌洗小鼠肺分析炎症细胞浸润

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

小鼠肾上腺的分离、固定和免疫荧光成像

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

实验自身免疫性脑脊髓炎中枢神经系统淋巴细胞渗透的流量细胞计量分析

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

流式细胞术分析人髓系U937细胞中SAMHD1限制性

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

传染性单核细胞增多症儿童外周血样本中免疫细胞亚群的分离

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...