Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Vi er taknemmelige for Nathalie Vernoux for hendes vejledning og hjælp til eksperimenterne. Vi vil også gerne takke DRs. Emmanuel Planel og Serge Rivest for brugen af deres fluorescens og confokale mikroskoper, hhv. Dette arbejde blev delvist finansieret af stipendier fra det mexicanske råd for videnskab og teknologi (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og centre thématique de Recherche en Neuro Sciences (CTRN; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-Santé (til M.B.), og Shastri Indo-Canadian Institute (til K.B.), samt en opdagelse tilskud fra Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. besidder en Canada forskning stol (tier II) af Neuroimmune plasticitet i sundhed og terapi.

Alle forsøgsprocedurer blev udført efter aftale med retningslinjerne fra de etiske udvalg for Dyreetik i overensstemmelse med det canadiske råd om dyrepasning og Komiteen for dyrepasning i Université Laval.
1. immun farvning
<ol><li>Vælg tre mus hjernen sektioner, der indeholder den region af interesse (ROI) (dvs., hippocampus) ved hjælp af en hjerne Atlas. Anbring sektionerne i en plastik multi-brønd plade, og dæk dem til med 350 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS) (tabel 1</...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Denne protokol kan opdeles i to kritiske dele: kvaliteten af farvning og analyse. Hvis farvning ikke er optimal, vil det ikke repræsentere mikrogliale celler tilstrækkeligt, hvilket påvirker tætheden, fordelingen og morfologiske målinger. Desuden kan andelen af infiltration perifere myeloide celler undervurderes. Dette er en optimeret version af farvnings protokollen, men der er flere faktorer, der kan resultere i suboptimale billeder. Selv om perfusion af dyret ikke er inkluderet i denne protokol, hvis hjernen fiks...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Uanset om akut eller kronisk, neuroinflammation er tæt påvirket af microglia, de residente makrofager i hjernen. Visualisering af microglia gennem immun farvning er værdifuldt for studiet af neuroinflammation med brug af let mikroskopi, en meget tilgængelig teknik. I homeostatiske forhold distribueres microglia typisk i et ikke-overlappende mosaiklignende mønster. De udviser små Somas, der udvider forgrenede processer1, som undertiden kontakter hinanden2. Microglial forgrenede processer dynamisk undersøgelse hjernen parenchyma, interagere med neuroner, andre gliale celler, og blodkar under normale fysiologiske betingelser3. Microglia er udstyret med et arsenal af receptorer, der giver dem mulighed for at udføre immunologiske opgaver og reagere på ændringer i hjernen Milieu, celledød, eller vævsskader. Desuden, de udøver vigtige fysiologiske funktioner, især i synaptisk dannelse, vedligeholdelse, og elimination4,5.
Blandt de tilgængelige markører, der anvendes til at studere microglia, er ioniseret calcium bindende adapter molekyle 1 (IBA1) en af de mest udbredte. IBA1 er et calcium bindende protein, der giver enestående visualisering af mikroglial morfologi, herunder fine distale processer, som bekræftet af elektronmikroskopi6. Dette værktøj har været medvirkende til at karakterisere mikroglial transformation, tidligere kaldet "aktivering", i en bred vifte af dyresygdomme modeller7,8,9. I nærværelse af neuroinflammation, den mikrogliale respons omfatter: microgliose, der er defineret som en stigning i cellulær tæthed, ændringer i fordelingen, der undertiden resulterer i klyngedannelse, udvidelse af celle kroppen, samt fortykkelse og afkortning af processer forbundet med flere ameboid figurer10,11,12,13.
Immun farvning er begrænset af tilgængeligheden af antistoffer rettet mod specifikke markører. Det er vigtigt, at IBA1 udtrykkes af microglia, men også af perifere makrofager, der infiltrerer hjernen14. Mens observation af IBA1-positive celler inde i hjernen er blevet en markør for microglia i dette forskningsområde, perifer makrofag infiltration er blevet rapporteret under forskellige betingelser, selv marginalt i den raske hjerne15,16 ,17,18. Derfor tillader brugen af IBA1 alene ikke selektiv visualisering af microglia. Desuden, makrofager vedtage molekylære og morfologiske egenskaber af Resident microglia, når de har infiltreret hjernen, hvilket hindrer differentiering19. Dette udgør en udfordring, når man undersøger funktionen af både microglia og infiltrerer makrofager.
Mens microglia og perifere makrofager har forskellige oprindelser (f. eks. fra den embryonale blomme sæk og knoglemarv, henholdsvis20og21), er der et stigende antal fund, som indikerer, at de to cellepopulationer udøver forskellige roller i hjernen19. Det er derfor afgørende at anvende metoder, der diskriminerer mellem disse to populationer uden invasive manipulationer (dvs. knoglemarv kimærer eller parabioose), der kan moduere deres tæthed, fordeling, morfologi, og funktion. TMEM119 er dukket op som en microglia-specifik markør på tværs af sundheds-og sygdomsforhold22. Når det kombineres med IBA1, bliver denne markør nyttig til at differentiere disse celler fra infiltrering af makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er udviklingsmæssigt reguleret, TMEM119 udtrykkes så tidligt som postnatal dag 3 (P3) og 6 (P6), støt stigende indtil nå voksne niveauer mellem P10 og P1422. IBA1 udtrykkes så tidligt som embryonal dag 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåede dobbelt mærkning protokol er derfor nyttigt at studere disse to populationer i hele postnatale liv.
Denne protokol giver en trin-for-trin immunofarvning procedure, der tillader diskrimination mellem microglia og perifere makrofager. Det forklarer også, hvordan man gennemfører en kvantitativ analyse af mikroglial tæthed, distribution og morfologi samt analyse af perifer makrofag infiltration. Mens undersøgelsen af microglia og perifere makrofager er nyttig på sin egen, denne protokol giver yderligere lokalisering af neuroinflammatoriske Foyers; det fungerer således også som en platform til at identificere specifikke regioner, der skal undersøge, med anvendelse af supplerende (endnu, mere tids-og ressourceforbrugende) teknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Dette er en protokol til dual visualisering af microglia og infiltrerende makrofager i mus hjernevæv. TMEM119 (som etiketter microglia selektivt), når det kombineres med IBA1 (som giver en usædvanlig visualisering af deres morfologi), tillader undersøgelse af ændringer i tæthed, fordeling, og morfologi. Det er vigtigt at kvantificere disse parametre for at give indsigt i de roller, der udøves af microglia, hjernens hjemmehørende makrofager. Under normale fysiologiske forhold distribueres microglia regelmæssigt i et mosaiklignende mønster og præsenterer en lille Soma med forgrenede processer. Ikke desto mindre, som en reaktion på miljømæssige faktorer (dvs., traumer, infektion, sygdom, eller skade), mikroglial tæthed, distribution, og morfologi er ændret i forskellige manerer, afhængigt af fornærmelse. Desuden giver den beskrevne dobbelt farvning metode visualisering af infiltrerende makrofager i hjernen baseret på deres udtryk for IBA1 og uden samlokalisering med TMEM119. Denne tilgang giver således mulighed for diskrimination mellem microglia og infiltrering af makrofager, som er nødvendig for at give funktionel indsigt i deres særskilte involvering i hjernens homøostase på tværs af forskellige sammenhænge af sundhed og sygdom. Denne protokol integrerer de seneste fund i Neuro immunologi, der vedrører identifikationen af selektive markører. Det fungerer også som et nyttigt redskab for både erfarne Neuro immunologer og forskere, der søger at integrere Neuro Immunologi i projekter.

Figur 1 viser Co-mærkning af microglia ved hjælp af IBA1 og TMEM119 i en koronal del af dorsale hippocampus afbildet ved 20x ved Fluorescens mikroskopi. En vellykket farvning afslører mikrogliale celle legemer og deres fine processer (figur 1A − C). Denne farvning muliggør bestemmelse af mikroglial tæthed og fordeling og identifikation af mikrogliale klynger (figur 1I<...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Denne protokol beskriver en trin-for-trin arbejdsgang for immunfluorescent cofarvning af IBA1 og TMEM119, foruden analyse af mikroglial tæthed, distribution, og morfologi, samt perifer myeloid celleinfiltration i mus hjernevæv.

Immunofluorescens farvning ved hjælp af IBA1 og TMEM119 til Mikroglial tæthed, morfologi og perifer myeloid celle infiltration analyse i muse hjernen

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Denne protokol vil vise dig, hvordan du pletter mikroglia, udføre kvantitative tæthed og morfologi analyse samt at kvantificere makrofag infiltration i hjernen. Denne teknik gør det muligt for forskeren at måle ændringer i mikrogliadistribution og morfologi på en kvantitativ måde og at skelne mikroglia fra infiltrerende makrofager Denne analyseprotokol kan nemt anvendes på andre dyremodeller for at måle ændringer i mikroglial distribution og morfologi, hvor anti-IBA1 og anti-TMEM119 antistoffer er tilgængelige. Det anbefales stærkt at udføre celletællinger og spor blændet til den eksperimentelle tilstand og at være konsekvent i den måde, denne procedure udføres.For at starte denne procedure skal du åbne et billedbehandlingsprogram som Fiji eller ImageJ, der har den nærmeste nabodistance-plug-in installeret. Åbn 20X-billedet, hvis skalaen er indeholdt i filens metadata og ikke automatisk angives fra metadataene. Vælg Analysér, Angiv skalering på menulinjen, og angiv derefter de korrekte oplysninger.Hvis du vil indstille skalaen manuelt baseret på en skala, der er præget på billedet, skal du vælge værktøjet Lige linje. Placer markøren på kanten af skalaen, og tegn en streg så tæt som muligt på skalaen på billedet, mens du trykker på Skift-tasten. Vælg Analysér, Angiv skalering.Et vindue vil poppe op og sætte den korrekte kendte afstand og enhed af længde for at bestemme pixel per længde enhed og klik på OK. Vælg derefter Billede, Farve, Gør sammensat for at oprette et sammensat billede af alle kanaler. Vælg Analysér og angiv målinger på menulinjen. Tjek område, centroid og perimeter.Vælg filen Åbn i rullemenuen Omdiriger til, og klik derefter på OK. Gå til Billede, Farve, Kanalværktøj for at åbne kanalværktøjet. Brug frihåndsmarkeringsværktøjet til at tegne en grov perimeter omkring interesseområdet. Dobbeltklik på ovalværktøjet på værktøjslinjen for at aktivere markeringspenselværktøjet.Sørg for, at feltet Aktivér markeringspensel er markeret, og klik på OK. Brug markeringspenslen til at justere omkredsen, så den passer bedst til interesseområdet, og tryk derefter på T på tastaturet i hele dette område for at pile Y-manager. Vælg Analysér, mål eller tryk på M-tasten, hvor hurtigt vinduet Resultater vises. Kopier og indsæt resultaterne i et dataark, og gem oplysningerne om området.Når du har kopieret området i det område, der er af interesse, skal du basere oplysningerne fra vinduet Resultater ved at klikke på dem og trykke på knappen Tilbage. Vælg vinduet ROI Manager, vælg sporingen af investeringsafkastet, og rediger navnet, så det svarer til billedets navn, ved at trykke på Omdøb. Klik på OK, og højreklik derefter på det nye navn på sporingen af investeringsafkastet, og gem.Dobbeltklik på penselværktøjet på værktøjslinjen. Vælg farven sort og penselstørrelsen på 10. Sørg for, at indstillingen Paint ved overlejring ikke er markeret.I TMEM119-kanalen skal du forsigtigt placere en sort prik i midten af somaen for hver TMEM119 positiv mikroglia. Placer en hvid prik i midten af cellerne, der ikke er positive for TMEM119. Gentag den samme procedure for alle celler i interesseområdet.Vælg derefter Billede, Farve, Split Channel, der vises et vindue for hver kanal. Identificer den kanal, der har prikken anmærkninger og lukke de to andre vinduer. Hvis du vil omdirigere det nye billede af den opdelte kanal, skal du gå til Analysér, Angiv målinger.Vælg billedet opdel kanal i rullemenuen Omdiriger for at finde en, og klik på OK. Vælg derefter Billede, Type, otte-bit. Gå til Billedjustering, og vælg Tærskel. Juster skyderne helt til venstre på begge søjler.Dette vil kun efterlade de sorte prikker, som nu vises hvide. Vælg interesseområdet i vinduet Roi Manager. Vælg Analysér og analysér partikel på menulinjen.Indtast en til 20 i tekstboksen til Størrelse. Feltet for Pixel-enheder skal forblive umarkeret, mens feltet for visningsresultater, Opsummer og Føj til administrator, skal markeres. Klik på OK for at få vist vinduet Oversigt, som giver antallet af point.Kopier og indsæt disse oplysninger i dataarket. Vælg derefter plug-ins NND for at få vist NND-vinduet. Hvert tal repræsenterer den afstand, som hvert mikroglia har til nærmeste nabomikren.Kopier og indsæt alle disse oplysninger i dataarket. Gå tilbage til vinduet Tærskel, og juster den øverste skyder helt til højre, hvilket vil efterlade alle de hvide prikker synlige, nu vises hvid. Vælg Analysér, Analysér partikel for at få vist pop op-vinduet Analysér partikler.Klik på OK for at få vist vinduet Oversigt, der indeholder antallet af punkter. Kopier og indsæt disse oplysninger i dataarket. Gå til ROI Manager, og vælg alle pointene.Højreklik derefter, og gem med billedets navn. Dette vil gøre det muligt at gemme alle de punkter i en ZIP-fil. Åbn først 4DX-billedfilerne.Der vises et pop op-vindue, hvor du bliver spurgt, om billederne skal åbnes i en stak. Klik på OK. Vælg derefter Billede, Stakke, ZProject for at åbne Z-projektionsvinduet. Medtag alle udsnit fra det første til sidste udsnit.Kontroller, at den maksimale intensitet er valgt under Projektionstype, og klik på OK. Klik på det nye vindue, der indeholder ZProject. Vælg Billede, Farver, Split Channels og foretage spor på billederne af IBA1 kanal. Vælg Analysér og angiv målinger på menulinjen.Tjek området, Centroid og Perimeter. Vælg den åbne fil i rullemenuen Omdiriger til, og klik på OK. Hvis du vil indstille skalaen manuelt baseret på en skala, der er præget på billedet, skal du vælge værktøjet Lige linje. Placer markøren på kanten af skalaen, og tegn en streg så tæt som muligt på skalaen på billedet, mens du trykker på Skift-tasten.Vælg Analysér, Angiv skalering. Der dukker et vindue op. Indtast den korrekte kendte afstand og længdeenhed for at bestemme enheden Pixel pr. længde, og klik på OK. Hvis du vil måle somastørrelsen i IBA1-kanalen, skal du tegne en grov omkreds af somaen med værktøjet Frihåndsmarkering.Dobbeltklik på ovalværktøjet på værktøjslinjen for at aktivere markeringspenselværktøjet. Sørg for, at feltet Aktivér markeringspensel er markeret, og klik på OK. Brug markeringspenslen til at justere sporingen, så det passer bedst til somaen. Hvis du zoomer ind, aktiveres præcision under dette trin.Tryk derefter på T-tasten for at føje somasporingen til ROI Manager. Vælg Analysér, mål eller tryk på M-tasten for at få vist resultaterne. Kopiere og indsætte disse resultater i et dataark.Gå til vinduet Roi Manager, vælg det pågældende område, og rediger navnet, så det svarer til billedets navn, ved at trykke på Omdøb. Højreklik på det omdøbte interesseområde, og klik på Gem. Sørg for, at navnet angiver, at sporingen er til soma, og gem filen.Hvis du vil måle arboriseringsområdet i IBA1-kanalen, skal du først vælge værktøjet Polygonmarkering. Klik på den mikrogliale proceseksistens med værktøjet til at starte polygonformen. Gå rundt i mikroglia ved at klikke på spidsen af hver proceseksremity at danne en polygon, der bedst repræsenterer det område, der er omfattet af de mikrogliale arborizations.Når polygonen er færdig, skal du klikke på startpunktet for at lukke den. Tryk derefter på T-tasten for at føje sporingen til roi manager. Vælg Analysér, mål eller tryk på M for at føje dataene til vinduet Resultater.Kopier og indsæt disse data i dataarket. Hvis du vil gemme oplysningerne om arboriseringsområdet, skal du gå til vinduet Roi Manager, vælge det relevante område og ændre navnet, så det svarer til billedets navn, ved at trykke på Omdøb. Højreklik på det omdøbte interesseområde, og klik på Gem.Sørg for, at navnet angiver, at sporingen er til arborisering og gemme filen. Denne undersøgelse beskrev den trinvise arbejdsgang for immunfluorescerende co-farvning af IBA1 og TMEM119 og til analyse af mikroglial tæthed, distribution og morfologi samt af perifer myeloidcelleinfiltration i musehjernens væv. Fluorescensmikroskopi bruges til at afbilde co-mærkning af mikroglia ved hjælp af IBA1 og TMEM119 i koronal del af dorsale hippocampus på 20X forstørrelse.En vellykket farvning afslører mikrogliale cellekroppe og deres fine processer. Farvningen gør det muligt at bestemme mikroglial tæthed og distribution og til identifikation af mikrogliale klynger og infiltrerende makrofager. Konfokal mikroskopi bruges til at billedet den trinvise mikroglial arborization sporing procedure på 40X forstørrelse.Disse repræsentative resultater viser IBA1 positive og TMEM119 positive mikroglia samt et eksempel på celle krop opsporing. Det er vigtigt at være konsekvent, når celler tælles, og at være opmærksom på begge signaler fra IBA1 og TMEM119. Denne teknik gør det muligt for forskeren at identificere regioner i hjernen, der er påvirket af en bestemt stimulus, som derefter kan studeres mere dybtgående med komplementære teknikker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolær Lavage af murine Lunger at analysere inflammatorisk celleinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolation, fiksering og immunfluorescens billeddannelse af musen binyrerne

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse af SAMHD1-begrænsning ved flowcytometri i humane myeloide U937-celler

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Adskillelse af immuncelleunderpopulationer i perifere blodprøver fra børn med infektiøs mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...