Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

We zijn Nathalie Vernoux dankbaar voor haar begeleiding en assistentie bij de experimenten. Ook willen we drs. Emmanuel Planel en Serge Rivest bedanken voor respectievelijk het gebruik van hun fluorescentie-en confocale microscopen. Dit werk werd deels gefinancierd door beurzen van de Mexicaanse Raad van Wetenschappen en technologie (CONACYT; tot F. G. I), de Fondation famille-Choquette en het Centre thématique de Recherche en neurowetenschappen (CTRN; to K.P.), Fonds de recherche du Québec-Santé (naar M.B.), en Shastri Indo-Canadees Instituut (naar K.B.), evenals een ontdekking subsidie van natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) aan M.E.T. M.E.T. houdt een Canada Research Chair (Tier II) van neuro-immune plasticiteit in gezondheid en therapie.

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele Dierenethische comités, in overeenstemming met de Canadese Raad voor Dierverzorging en het Dierenzorg Comité van de Université Laval.
1. immunokleuring
<ol><li>Selecteer drie muis hersen secties met de regio van belang (ROI) (dat wil zeggen, de hippocampus) met behulp van een hersen Atlas. Plaats de delen in een plastic multi-well plaat en bedek ze met 350 μL fosfaatgebufferde zout...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Dit protocol kan worden onderverdeeld in twee kritieke onderdelen: kwaliteit van de kleuring en analyse. Als de kleuring niet optimaal is, zal het falen om microglial cellen adequaat weer te geven, waardoor de dichtheid, verdeling en morfologie metingen worden aangetast. Bovendien kan het aandeel van infiltratie perifere myeloïde cellen worden onderschat. Dit is een geoptimaliseerde versie van het kleurings protocol, maar er zijn verschillende factoren die kunnen resulteren in suboptimale afbeeldingen. Hoewel de perfusi...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Of acute of chronische, neuro ontsteking wordt nauw beïnvloed door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Het visualiseren van Microglia door middel van immunokleuring is waardevol voor de studie van neuro ontsteking met het gebruik van lichte microscopie, een zeer toegankelijke techniek. In homeostatische omstandigheden worden Microglia meestal verdeeld in een niet-overlappend, mozaïek achtig patroon. Ze vertonen kleine soma's die vertakte processen uitbreiden1, die soms contact met elkaar2. Microglial vertakte processen dynamisch onderzoek van de hersen parenchym, interactie met neuronen, andere gliacellen en bloedvaten tijdens normale fysiologische omstandigheden3. Microglia zijn uitgerust met een arsenaal aan receptoren die hen in staat stellen om immunologische taken uit te voeren en te reageren op veranderingen in de hersen milieu, op celdood of op weefselbeschadiging. Bovendien, zij uitoefenen belangrijke fysiologische functies, met name in synaptische vorming, onderhoud, en eliminatie4,5.
Onder de beschikbare markers die worden gebruikt om Microglia te bestuderen, is geïoniseerde calcium bindings adapter molecuul 1 (IBA1) een van de meest gebruikte. IBA1 is een calcium bindend eiwit dat een uitzonderlijke visualisatie van microgliale morfologie biedt, inclusief fijne distale processen, zoals bevestigd door elektronenmicroscopie6. Deze tool heeft een belangrijke rol gespeeld bij het karakteriseren van microglial transformatie, voorheen "Activation" genoemd, in een breed scala aan dierziekte modellen7,8,9. In aanwezigheid van neuro ontsteking omvat de microglial respons: microgliosis die wordt gedefinieerd als een toename in cellulaire dichtheid, veranderingen in de distributie die soms resulteren in Clustering, vergroting van het cellichaam, evenals verdikking en verkorting van processen in verband met meer ameboid vormen10,11,12,13.
Immunokleuring wordt beperkt door de beschikbaarheid van antilichamen gericht tegen specifieke markers. Belangrijk is dat IBA1 wordt uitgedrukt door Microglia, maar ook door perifere macrofagen die de hersenen ininfiltreren14. Terwijl observatie van IBA1-positieve cellen in de hersenen een marker van Microglia is geworden in dit onderzoeksveld, is perifere macrofaag infiltratie gemeld onder verschillende omstandigheden, zelfs marginaal in het gezonde brein15,16 ,17,18. Bijgevolg is het gebruik van IBA1 alleen niet toegestaan voor selectieve visualisatie van Microglia. Daarnaast nemen macrofagen moleculaire en morfologische kenmerken van Resident Microglia aan zodra ze de hersenen hebben geïnfiltreerd, waardoor differentiatie19wordt belemmerd. Dit vormt een uitdaging bij het onderzoeken van de functie van zowel Microglia als infiltrerende macrofagen.
Hoewel Microglia en perifere macrofagen verschillende oorzaken hebben (bijv. uit de embryonale dooierzak en het beenmerg, respectievelijk20,21), is er een toenemend aantal bevindingen waaruit blijkt dat de twee celpopulaties verschillende rollen in de hersenen19. Het is dus van cruciaal belang om methoden te gebruiken die discrimineren tussen deze twee populaties zonder invasieve manipulaties (d.w.z. beenmerg chimeras of parabiose) die hun dichtheid, verdeling, morfologie en functie kunnen moduleren. TMEM119 is ontstaan als een Microglia-specifieke marker over gezondheids-en ziekte omstandigheden22. In combinatie met IBA1, deze marker wordt nuttig voor het differentiëren van deze cellen van infiltreren macrofagen, die TMEM119-negatief en IBA1-positief zijn. Terwijl het is ontwikkelmentaal gereguleerd, TMEM119 wordt uitgedrukt zo vroeg als postnatale dagen 3 (P3) en 6 (P6), gestaag toenemen tot het bereiken van volwassen niveaus tussen P10 en P1422. IBA1 wordt uitgedrukt in embryonale dag 10,5 (E 10.5)23. Het voorgestelde dubbele etiketterings protocol is dus nuttig om deze twee populaties gedurende het hele postnatale leven te bestuderen.
Dit protocol biedt een stapsgewijze immunokleurings procedure die discriminatie tussen Microglia en perifere macrofagen mogelijk maakt. Ook wordt uitgelegd hoe u een kwantitatieve analyse van de microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals analyse van perifere macrofaag infiltratie uitvoeren. Hoewel het onderzoek naar Microglia en perifere macrofagen op zichzelf nuttig is, maakt dit protocol de lokalisatie van neuroinflammatoire Foyers mogelijk. het fungeert dus ook als een platform voor het identificeren van specifieke regio's om te onderzoeken, met het gebruik van complementaire (nog, meer tijd-en resource-verbruiken) technieken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Dit is een protocol voor de dubbele visualisatie van Microglia en infiltrerende macrofagen in muis hersenweefsel. TMEM119 (welke labels Microglia selectief), in combinatie met IBA1 (die een uitzonderlijke visualisatie van hun morfologie biedt), maakt onderzoek mogelijk van veranderingen in dichtheid, distributie en morfologie. Het kwantificeren van deze parameters is belangrijk om inzicht te geven in de rollen die worden uitgeoefend door Microglia, de ingezeten macrofagen van de hersenen. Onder normale fysiologische omstandigheden worden Microglia regelmatig verdeeld in een mozaïek achtig patroon en presenteren ze een klein SOMA met vertakte processen. Niettemin, als reactie op omgevingsfactoren (dat wil zeggen, trauma, infectie, ziekte, of letsel), microgliale dichtheid, verdeling, en morfologie worden gewijzigd op verschillende manieren, afhankelijk van de belediging. Bovendien maakt de beschreven methode voor dubbele kleuring visualisatie mogelijk van infiltrerende macrofagen in de hersenen op basis van hun expressie van IBA1 en zonder colokalisatie met TMEM119. Deze aanpak maakt het mogelijk discriminatie tussen Microglia en infiltrerende macrofagen, die nodig is om functionele inzichten in hun duidelijke betrokkenheid bij hersenen homeostase over verschillende contexten van gezondheid en ziekte te bieden. Dit protocol integreert de nieuwste bevindingen in Neuro immunologie die betrekking hebben op de identificatie van selectieve markers. Het fungeert ook als een nuttig hulpmiddel voor zowel ervaren neuro immunologen als onderzoekers die Neuro immunologie willen integreren in projecten.

Figuur 1 toont de co-labeling van Microglia met behulp van IBA1 en TMEM119 in een coronale sectie van de dorsale Hippocampus afgebeeld op 20x door fluorescentiemicroscopie. Een succesvolle kleuring onthult microglial cellichamen en hun fijne processen (Figuur 1A − C). Deze kleuring maakt de bepaling mogelijk van microgliale dichtheid en verdeling en identificatie van microgliale clusters (F...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Dit protocol beschrijft een stapsgewijze workflow voor immunofluorescerende cokleuring van IBA1 en TMEM119, naast de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie, evenals perifere myeloïde celinfiltratie in muizen hersenweefsel.

Immunofluorescentie kleuring met behulp van IBA1 en TMEM119 voor Microgliale dichtheid, morfologie en perifere myeloïde Celinfiltratie analyse in Muizenhersenen

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Dit protocol zal u laten zien hoe microglia vlek, uitvoeren van kwantitatieve dichtheid en morfologie analyse, alsmede om macrofaag infiltratie in de hersenen te kwantificeren. Deze techniek stelt de onderzoeker in staat om veranderingen in microgliadistributie en morfologie op een kwantitatieve manier te meten en microglia te onderscheiden van het infiltreren van macrofagen Dit analyseprotocol kan eenvoudig worden toegepast op andere diermodellen om veranderingen in microgliadistributie en morfologie te meten waar anti-IBA1 en anti-TMEM119 antilichamen beschikbaar zijn. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de celtellingen en sporen die blind zijn voor de experimentele aandoening uit te voeren en consistent te zijn in de manier waarop deze procedure wordt uitgevoerd.Open om deze procedure te starten, open een beeldverwerkingsprogramma zoals Fiji of ImageJ dat de dichtstbijzijnde buurmanafstandplug-in heeft geïnstalleerd. Open de 20X-afbeelding als de schaal zich in de metagegevens van het bestand bevindt en niet automatisch is ingesteld vanaf de metagegevens. Selecteer op de menubalk Analyseren, Schaal instellen en voer de juiste gegevens in.Als u de schaal handmatig wilt instellen op basis van een schaal die op de afbeelding is afgedrukt, selecteert u het gereedschap Rechte lijn. Plaats de cursor op de rand van de weegschaal en teken tijdens het indrukken van de Shift-toets een lijn die zo dicht mogelijk bij de schaal op de afbeelding komt. Selecteer Analyseren, Schaal instellen.Er verschijnt een venster en plaatst de juiste bekende afstand en lengte-eenheid om de pixel per lengte-eenheid te bepalen en op OK te klikken. Selecteer vervolgens Afbeelding, Kleur, Samengesteld maken om een samengestelde afbeelding van alle kanalen te maken. Selecteer Analyseren op de menubalk, Stel Metingen in. Check Area, Centroid en Perimeter.Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden naar het bestand openen en klik op OK. Ga naar Afbeelding, Kleur, Kanaalgereedschap om het gereedschap Kanaal te openen. Gebruik het gereedschap Selectie uit de vrije hand om een ruwe omtrek rond het interessegebied te tekenen. Dubbelklik op het gereedschap Ovaal op de gereedschapsbalk om het gereedschap Selectiepenseel in te schakelen.Controleer of het selectiepenseel selectiepenseel inschakelen is ingeschakeld en klik op OK. Met het selectiepenseel past u de omtrek aan het beste bij het interessegebied en drukt u vervolgens op T op het toetsenbord in dit gebied naar pijl Y-manager. Selecteer Analyseren, meten of drukken op de M-toets en het venster Resultaten wordt weergegeven. Kopieer en plak de resultaten in een gegevensblad en sla de informatie over het gebied op.Nadat u het gebied van het interessegebied hebt gekopieerd, baseert u de informatie uit het venster Resultaten door erop te klikken en op de toets Backspace te drukken. Selecteer het venster ROI Manager, selecteer de ROI Trace en wijzig de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik op OK en klik met de rechtermuisknop op de nieuwe naam van de ROI Trace en sla op.Dubbelklik op het gereedschap Penseel op de gereedschapsbalk. Selecteer de kleur zwart en de penseelgrootte van 10. Controleer of de optie Paint on overlay niet is ingeschakeld.Plaats in het TMEM119-kanaal voorzichtig een zwarte stip op het midden van de soma voor elke TMEM119 positieve microglia. Plaats een witte stip in het midden van de cellen die niet positief zijn voor TMEM119. Herhaal dezelfde procedure voor alle cellen in het gebied van belang.Selecteer vervolgens Afbeelding, Kleur, Gesplitst kanaal, er verschijnt een venster voor elk kanaal. Identificeer het kanaal met de dot-annotaties en sluit de andere twee vensters. Als u de nieuwe afbeelding van het gesplitste kanaal wilt omleiden, gaat u naar Analyseren, Metingen instellen.Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden naar de optie Kanaalafbeelding splitsen en klik op OK. Selecteer vervolgens Afbeelding, Tekst, acht-bits. Ga naar Afbeelding aanpassen en selecteer Drempelwaarde. Pas de schuifregelaars helemaal naar links in beide balken aan.Hierdoor blijven alleen de zwarte stippen achter die nu wit verschijnen. Selecteer het interessegebied in het venster ROI Manager. Selecteer Analyseren in de menubalk analyseren, Deeltjes analyseren.Voer in het tekstvak voor Grootte een tot en met 20 in. Het vak voor Pixel-eenheden moet niet worden aangevinkt terwijl het vakje voor weergaveresultaten, Samenvatten en Toevoegen aan beheer moet worden aangevinkt. Klik op OK om het overzichtsvenster weer te geven waarin het aantal punten wordt weergegeven.Kopieer en plak deze informatie naar het gegevensblad. Selecteer vervolgens plug-ins NND om het NND-venster weer te geven. Elk getal vertegenwoordigt de afstand die elke microglia heeft tot de dichtstbijzijnde naburige microglia.Kopieer en plak al deze gegevens naar het gegevensblad. Ga terug naar het venster Drempel en pas de bovenste schuifregelaar helemaal naar rechts aan, waardoor alle witte stippen zichtbaar blijven en nu wit worden weergegeven. Selecteer Analyseren, Deeltjes analyseren om het pop-upvenster Analyseren weer te geven.Klik op OK om het venster Overzicht weer te geven dat het aantal punten geeft. Kopieer en plak deze informatie in het gegevensblad. Ga naar DE ROI Manager en selecteer alle punten.Klik vervolgens met de rechtermuisknop en Sla op met de naam van de afbeelding. Hierdoor kunnen alle punten in een ZIP-bestand worden opgeslagen. Open eerst de 4DX-afbeeldingsbestanden.Er verschijnt een pop-upvenster met de vraag of de afbeeldingen in een stapel moeten worden geopend. Klik op OK. Selecteer vervolgens Afbeelding, Stapels, ZProject om het venster Z-projectie te openen. Voeg alle segmenten van het eerste tot en met het laatste segment toe.Controleer of de maximale intensiteit is geselecteerd onder Projectietype en klik op OK. Klik op het nieuwe venster dat het ZProject bevat. Selecteer Afbeelding, Kleuren, Gesplitste kanalen en voer de sporen uit op de afbeeldingen van het IBA1-kanaal. Selecteer Analyseren in de menubalk, Stel Metingen in.Controleer het gebied, Centroid en Perimeter. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Omleiden het geopende bestand en klik op OK. Als u de schaal handmatig wilt instellen op basis van een schaal die op de afbeelding is afgedrukt, selecteert u het gereedschap Rechte lijn. Plaats de cursor op de rand van de weegschaal en teken tijdens het indrukken van de Shift-toets een lijn die zo dicht mogelijk bij de schaal op de afbeelding komt.Selecteer Analyseren, Schaal instellen. Er verschijnt een raam. Voer de juiste bekende afstand en lengte-eenheid in om de eenheid Pixels per lengte te bepalen en klik op OK. Als u de somagrootte in het IBA1-kanaal wilt meten, tekent u een ruwe omtrek van de soma met het gereedschap Vrije handselectie.Dubbelklik op het gereedschap Ovaal op de werkbalk om het gereedschap Selectiepenseel in te schakelen. Controleer of het selectiepenseel selectiepenseel inschakelen is ingeschakeld en klik op OK. Met het selectiepenseel past u het spoor zo goed mogelijk aan de soma. Inzoomen zorgt voor precisie tijdens deze stap.Druk vervolgens op de T-toets om het soma-trace toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer Analyseren, meten of druk op de M-toets om de resultaten weer te geven. Kopieer en plak deze resultaten op een gegevensblad.Ga naar het venster ROI Manager, selecteer het interessegebied en wijzig de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik met de rechtermuisknop op het omgedoopte interessegebied en klik op Opslaan. Zorg ervoor dat de naam aangeeft dat de tracering voor soma is en sla het bestand op.Als u het arborisatiegebied in het IBA1-kanaal wilt meten, selecteert u eerst het gereedschap Veelhoekselectie. Klik op de microgliale proces extremiteit met het gereedschap om de veelhoekvorm te starten. Ga rond de microglia door te klikken op de uiteinden van elk proces extremiteit om een veelhoek die het beste vertegenwoordigt het gebied dat door de microgliale prieleïsten vertegenwoordigt vormen.Wanneer de veelhoek is voltooid, klikt u op het beginpunt om deze te sluiten. Druk vervolgens op de T-toets om het spoor toe te voegen aan de ROI Manager. Selecteer Analyseren, meten of drukken op de M-toets om de gegevens toe te voegen aan het venster Resultaten.Kopieer en plak deze gegevens op het gegevensblad. Als u de informatie over het arborisatiegebied wilt opslaan, gaat u naar het venster ROI Manager, selecteert u het interessegebied en wijzigt u de naam die overeenkomt met de naam van de afbeelding door op Naam wijzigen te drukken. Klik met de rechtermuisknop op het omgedoopte interessegebied en klik op Opslaan.Zorg ervoor dat de naam aangeeft dat de tracering is voor het maken van het bestand en het bestand opslaat. Deze studie beschreef de stapsgewijze workflow voor de immunofluorescente co-kleuring van IBA1 en TMEM119 en voor de analyse van microgliale dichtheid, distributie en morfologie en van perifere myeloïde celinfiltratie in muishersenweefsel. Fluorescentie microscopie wordt gebruikt om beeld van de co-etikettering van microglia met behulp van IBA1 en TMEM119 in de coronale sectie van de dorsale hippocampus op 20X vergroting.Een succesvolle kleuring onthult microgliale cellichamen en hun fijne processen. De kleuring maakt het mogelijk de microgliale dichtheid en distributie te bepalen en microgliaclusters te identificeren en macrofagen te infiltreren. Confocale microscopie wordt gebruikt om de stapsgewijze microgliale arborisatie traceringsprocedure bij 40X vergroting in beeld te brengen.Deze representatieve resultaten tonen IBA1 positieve en TMEM119 positieve microglia evenals een voorbeeld van cel lichaam traceren. Het is belangrijk om consistent te zijn bij het tellen van cellen en om aandacht te besteden aan beide signalen van IBA1 en TMEM119. Deze techniek stelt de onderzoeker in staat om gebieden van de hersenen te identificeren die worden beïnvloed door een bepaalde stimulus die vervolgens dieper kan worden bestudeerd met complementaire technieken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em&gt; In Vivo</em&gt; Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse van SAMHD1-beperking door flowcytometrie in humane myeloïde U937-cellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Scheiding van immuuncelsubpopulaties in perifere bloedmonsters van kinderen met infectieuze mononucleosis

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...