Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
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Wir danken Nathalie Vernoux für ihre Anleitung und Unterstützung bei den Experimenten. Wir danken auch Drs. Emmanuel Planel und Serge Rivest für den Einsatz ihrer Fluoreszenz- bzw. Konfokalmikroskope. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Stipendien des Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; to F.G.I), Fondation Famille-Choquette und Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (zu M.B.) und Shastri Indo-Canadian Institute (zu K.B.) sowie ein Discovery-Stipendium des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) an M.E.T. M.E.T. hält einen Canada Research Chair (Tier II) of Neuroimmune Plasticity in Health and Therapy.

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommissionen in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care und dem Animal Care Committee der Université Laval durchgeführt.
1. Immunostainierung
<ol><li>Wählen Sie mit Hilfe eines Hirnatlas drei Maushirnabschnitte aus, die den Interessenbereich (ROI) (d. h. den Hippocampus) enthalten. Legen Sie die Abschnitte in eine Kunststoff-Multi-Well-Platte und bedecken Sie sie mi...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll kann in zwei kritische Teile unterteilt werden: Qualität der Färbung und Analyse. Wenn die Färbung nicht optimal ist, wird sie mikrogliaale Zellen nicht angemessen darstellen, was die Dichte-, Verteilungs- und Morphologiemessungen beeinflusst. Darüber hinaus kann der Anteil der infiltrationsperipheren myeloischen Zellen unterschätzt werden. Dies ist eine optimierte Version des Färbeprotokolls, aber es gibt mehrere Faktoren, die zu suboptimalen Bildern führen können. Auch wenn die Durchblutung des...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Ob akut oder chronisch, Neuroinflammation wird stark durch Mikroglia beeinflusst, die ansässigen Makrophagen des Gehirns. Die Visualisierung von Mikroglia durch Immunfärbung ist wertvoll für die Untersuchung von Neuroinflammation mit dem Einsatz der Lichtmikroskopie, einer hochzugänglichen Technik. Bei homeostatischen Bedingungen werden Mikroglia in der Regel in einem nicht überlappenden, mosaikartigen Muster verteilt. Sie zeigen kleine Somas, die verzweigte Prozesse erweitern1, die manchmal miteinander in Kontakt treten2. Mikrogliale verzweigte Prozesse vermessen dynamisch das Blutparenchym und interagieren mit Neuronen, anderen Gliazellen und Blutgefäßen während normaler physiologischer Bedingungen3. Microglia sind mit einem Arsenal von Rezeptoren ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, immunologische Aufgaben auszuführen und auf Veränderungen im Gehirnmilieu, auf Zelltod oder Gewebeschäden zu reagieren. Darüber hinaus üben sie wichtige physiologische Funktionen aus, insbesondere in der synaptischen Bildung, Wartung und Elimination4,5.
Unter den verfügbaren Markern, die zur Untersuchung von Mikroglia verwendet werden, ist das ionisierte Calciumbindungsadaptermolekül 1 (IBA1) eines der am häufigsten verwendeten. IBA1 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das eine außergewöhnliche Visualisierung der mikroglialen Morphologie, einschließlich feiner distaler Prozesse, bietet, wie durch Elektronenmikroskopie6bestätigt wird. Dieses Tool war maßgeblich an der Charakterisierung der mikrogliaalen Transformation, früher als "Aktivierung" bezeichnet, in einer Vielzahl von Tierseuchenmodellen7,8,9. In Gegenwart von Neuroinflammation, die mikrogliaale Reaktion umfasst: Mikrogliase, die als eine Erhöhung der Zelldichte definiert ist, Veränderungen in der Verteilung, die manchmal zu Clustering führen, Vergrößerung des Zellkörpers, sowie Verdickung und Verkürzung der Prozesse, die mit mehr Ameboidformen verbunden sind10,11,12,13.
Die Immunfärbung wird durch die Verfügbarkeit von Antikörpern begrenzt, die gegen bestimmte Marker gerichtet sind. Wichtig ist, dass IBA1 durch Mikroglia, aber auch durch periphere Makrophagen ausgedrückt wird, die das Gehirn infiltrieren14. Während die Beobachtung von IBA1-positiven Zellen im Gehirn zu einem Marker von Mikroglia in diesem Forschungsgebiet geworden ist, wurde die periphere Makrophageninfiltration unter verschiedenen Bedingungen berichtet, sogar geringfügig im gesunden Gehirn15,16 ,17,18. Folglich erlaubt die Verwendung von IBA1 allein keine selektive Visualisierung von Mikroglia. Darüber hinaus übernehmen Makrophagen molekulare und morphologische Merkmale der ansässigen Mikroglia, sobald sie das Gehirn infiltriert haben, wodurch die Differenzierung behindert wird19. Dies stellt eine Herausforderung bei der Untersuchung der Funktion sowohl der Mikroglia als auch der Infiltrierung von Makrophagen dar.
Während Mikroglia und periphere Makrophagen unterschiedliche Ursprünge haben (z. B. aus dem embryonalen Eigelbsack bzw.20,21), gibt es immer mehr Befunde, die darauf hindeuten, dass die beiden Zellpopulationen verschiedene Rollen im Gehirn19. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, Methoden zu verwenden, die zwischen diesen beiden Populationen ohne invasive Manipulationen (d. h. Knochenmarkchimeren oder Parabiose) unterscheiden, die ihre Dichte, Verteilung, Morphologie und Funktion modulieren können. TMEM119 hat sich als mikrogliaspezifischer Marker für Gesundheit und Krankheit sprägsiert22. In Kombination mit IBA1 wird dieser Marker nützlich, um diese Zellen von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden, die TMEM119-negativ und IBA1-positiv sind. Während es entwicklungsreguliert ist, wird TMEM119 bereits in den postnatalen Tagen 3 (P3) und 6 (P6) ausgedrückt und steigt stetig an, bis das Erwachsenenniveau zwischen P10 und P1422erreicht wird. IBA1 wird bereits am embryonalen Tag 10.5 (E10.5)23ausgedrückt. Das vorgeschlagene Doppelkennzeichnungsprotokoll ist daher nützlich, um diese beiden Populationen während des gesamten postnatalen Lebens zu untersuchen.
Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Immunstaining-Verfahren, das eine Diskriminierung zwischen Mikroglia und peripheren Makrophagen ermöglicht. Außerdem wird erläutert, wie eine quantitative Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie die Analyse der peripheren Makrophageninfiltration durchgeführt werden kann. Während die Untersuchung von Mikroglia und peripheren Makrophagen allein nützlich ist, ermöglicht dieses Protokoll weiterhin die Lokalisierung neuroinflammatorischer Foyers; Daher dient es auch als Plattform, um bestimmte zu untersuchende Regionen zu identifizieren, wobei ergänzende (noch zeit- und ressourcenverbrauchende) Techniken verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Dies ist ein Protokoll zur dualen Visualisierung von Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen im Gehirngewebe der Maus. TMEM119 (das Mikroglia selektiv kennzeichnet), in Kombination mit IBA1 (das eine außergewöhnliche Visualisierung ihrer Morphologie bietet) ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen in Dichte, Verteilung und Morphologie. Die Quantifizierung dieser Parameter ist wichtig, um Einblicke in die Rolle zu geben, die von Mikroglia, den ansässigen Makrophagen des Gehirns, ausgeübt wird. Unter normalen physiologischen Bedingungen werden Mikroglia regelmäßig in einem mosaikartigen Muster verteilt und stellen ein kleines Soma mit verzweigten Prozessen dar. Als Reaktion auf Umweltfaktoren (z. B. Trauma, Infektion, Krankheit oder Verletzung) werden mikrogliaale Dichte, Verteilung und Morphologie je nach Beleidigung auf unterschiedliche Weise verändert. Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Doppelfärbungsmethode die Visualisierung von infiltrierenden Makrophagen im Gehirn basierend auf ihrer Expression von IBA1 und ohne Kolokalisierung mit TMEM119. Dieser Ansatz ermöglicht somit die Diskriminierung zwischen Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen, die erforderlich ist, um funktionelle Einblicke in ihre ausgeprägte Beteiligung an der Homöostase des Gehirns in verschiedenen Kontexten von Gesundheit und Krankheit zu geben. Dieses Protokoll integriert die neuesten Erkenntnisse in der Neuroimmunologie, die sich auf die Identifizierung selektiver Marker beziehen. Es dient auch als nützliches Werkzeug für erfahrene Neuroimmunologen und Forscher, die Neuroimmunologie in Projekte integrieren möchten.

Abbildung 1 zeigt die Co-Kennzeichnung von Mikroglia mit IBA1 und TMEM119 in einem koronalen Abschnitt des dorsalen Hippocampus, der mit 20x durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet ist. Eine erfolgreiche Färbung zeigt mikrogliaale Zellkörper und ihre feinen Prozesse (Abbildung 1A-C). Diese Färbung ermöglicht die Bestimmung der mikrogliaalen Dichte und Verteilung und Identifizierung von mikrogliaalen Clustern ...

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Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Dieses Protokoll zeigt Ihnen, wie Sie Mikroglia färben, quantitative Dichte- und Morphologieanalysen durchführen sowie die Makrophageninfiltration in das Gehirn quantifizieren können. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, Veränderungen in der Mikrogliaverteilung und Morphologie auf quantitative Weise zu messen und Mikroglia von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden Dieses Analyseprotokoll kann leicht auf andere Tiermodelle angewendet werden, um Veränderungen in der mikroglianverteilung und Morphologie zu messen, wo Anti-IBA1- und Anti-TMEM119-Antikörper verfügbar sind. Es wird dringend empfohlen, die Zellzahl und Diespuren für den experimentellen Zustand zu führen und in der Art und Weise, wie dieses Verfahren durchgeführt wird, konsistent zu sein.Um dieses Verfahren zu starten, öffnen Sie ein Bildverarbeitungsprogramm wie Fidschi oder ImageJ, das das nächste Nachbar-Entfernungs-Plug-in installiert hat. Öffnen Sie das 20X-Bild, wenn der Maßstab in den Metadaten der Datei enthalten ist und nicht automatisch aus den Metadaten festgelegt wird. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Skalieren festlegen aus, und geben Sie dann die richtigen Informationen ein.Um den Maßstab manuell basierend auf einem auf dem Bild aufgedruckten Maßstab festzulegen, wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus. Platzieren Sie den Cursor am Rand der Skala, und zeichnen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine Linie so nah wie möglich an den Maßstab auf dem Bild. Wählen Sie Analysieren, Skalieren festlegen.Ein Fenster wird angezeigt und die richtige bekannte Entfernung und Längeneinheit gesetzt, um die Pixelpro-Länge-Einheit zu bestimmen, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie als Nächstes Bild, Farbe, Zusammengesetzt erstellen aus, um ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle zu erstellen. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Messen festlegen aus. Prüfbereich, Schwerpunkt und Perimeter.Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten die Datei öffnen aus und klicken Sie dann auf OK. Wechseln Sie zu Bild, Farbe, Kanalwerkzeug, um das Kanalwerkzeug zu öffnen. Verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um einen groben Umfang um den Interessenbereich zu zeichnen. Doppelklicken Sie auf das Oval-Werkzeug in der Werkzeugleiste, um das Auswahl-Pinselwerkzeug zu aktivieren.Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auswahlpinsel aktivieren aktiviert ist, und klicken Sie auf OK. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel den Umfang an den Interessenbereich an, und drücken Sie dann T auf der Tastatur in diesem Bereich, um den Pfeil Y-Manager zu erreichen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder Drücken Sie die M-Taste, und das Ergebnisfenster wird angezeigt. Kopieren und fügen Sie die Ergebnisse in ein Datenblatt ein, und speichern Sie die Informationen über den Bereich.Nachdem Sie den Bereich des Interessenbereichs kopiert haben, basieren Sie die Informationen aus dem Ergebnisfenster, indem Sie darauf klicken und die Rückraumtaste drücken. Wählen Sie das Fenster ROI-Manager aus, wählen Sie die ROI-Ablaufverfolgung aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie die Umbenennung drücken. Klicken Sie auf OK, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf den neuen Namen der ROI-Ablaufverfolgung, und speichern Sie ihn.Doppelklicken Sie in der Werkzeugleiste auf das Pinselwerkzeug. Wählen Sie die Farbe Schwarz und die Pinselgröße 10 aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Paint on overlay deaktiviert ist.Legen Sie im TMEM119-Kanal vorsichtig einen schwarzen Punkt auf die Mitte des Soma für jede TMEM119 positive Mikroglia. Platzieren Sie einen weißen Punkt in der Mitte der Zellen, die für TMEM119 nicht positiv sind. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für alle Zellen, die im Interessenbereich enthalten sind.Als Nächstes wählen Sie Bild, Farbe, Split-Kanal, ein Fenster für jeden Kanal wird angezeigt. Identifizieren Sie den Kanal mit den Punktanmerkungen, und schließen Sie die beiden anderen Fenster. Um das neue Split-Channel-Bild umzuleiten, gehen Sie zu Analysieren, Messen festlegen.Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten das Split Channel Image aus, und klicken Sie auf OK. Wählen Sie dann Bild, Typ, Achtbit. Wechseln Sie zu Bildanpassung, und wählen Sie Schwellenwert aus. Passen Sie die Schieberegler in beiden Balken ganz nach links an.Dadurch werden nur noch die schwarzen Punkte belassen, die nun weiß erscheinen. Wählen Sie im Fenster ROI Manager die Interessenregion aus. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Partikel analysieren aus.Geben Sie im Textfeld für Größe eins bis 20 ein. Das Kontrollkästchen für Pixel-Einheiten sollte deaktiviert bleiben, während das Kontrollkästchen für Anzeigeergebnisse, Zusammenfassen und Hinzufügen zum Manager aktiviert werden soll. Klicken Sie auf OK, um das Fenster Zusammenfassung anzuzeigen, in dem die Anzahl der Punkte angezeigt wird.Kopieren Sie diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Wählen Sie dann Plug-Ins NND aus, um das NND-Fenster anzuzeigen. Jede Zahl stellt den Abstand jeder Mikroglia zur nächsten benachbarten Mikroglia dar.Kopieren Sie alle diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Gehen Sie zurück zum Fenster Schwellenwert und passen Sie den oberen Schieberegler ganz rechts an, wodurch alle weißen Punkte sichtbar sind, die nun weiß angezeigt werden. Wählen Sie Analysieren, Partikel analysieren, um das Pop-up-Fenster "Partikel analysieren" anzuzeigen.Klicken Sie auf OK, um das Fenster Zusammenfassung anzuzeigen, das die Anzahl der Punkte bereitstellt. Kopieren Sie diese Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Wechseln Sie zum ROI Manager, und wählen Sie alle Punkte aus.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste und speichern Sie mit dem Namen des Bildes. Dies ermöglicht das Speichern aller Punkte in einer ZIP-Datei. Öffnen Sie zunächst die 4DX-Bilddateien.Es wird ein Popup-Fenster angezeigt, in dem sie gefragt wird, ob die Bilder in einem Stapel geöffnet werden sollen. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie als Nächstes Bild, Stapel, ZProject aus, um das Fenster Z-Projektion zu öffnen. Schließen Sie alle Slices vom ersten bis zum letzten Slice ein.Stellen Sie sicher, dass die maximale Intensität unter Projektionstyp ausgewählt ist, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das neue Fenster, das das ZProject enthält. Wählen Sie Bild, Farben, Split-Kanäle und leiten Sie die Spuren auf den Bildern des IBA1-Kanals. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren, Messen festlegen aus.Überprüfen Sie den Bereich, den Schwerpunkt und den Umfang. Wählen Sie im Dropdown-Menü Umleiten die geöffnete Datei aus, und klicken Sie auf OK. Um den Maßstab manuell basierend auf einem auf dem Bild aufgedruckten Maßstab festzulegen, wählen Sie das Werkzeug Gerade Linie aus. Platzieren Sie den Cursor am Rand der Skala, und zeichnen Sie beim Drücken der Umschalttaste eine Linie so nah wie möglich an den Maßstab auf dem Bild.Wählen Sie Analysieren, Skalieren festlegen. Ein Fenster wird angezeigt. Geben Sie den richtigen bekannten Abstand und die richtige Längeneinheit ein, um die Pixel pro Längeneinheit zu bestimmen, und klicken Sie auf OK. Um die Soma-Größe im IBA1-Kanal zu messen, zeichnen Sie mit dem Werkzeug Freihandauswahl einen groben Umfang des Soma.Doppelklicken Sie auf das Oval-Werkzeug auf der Symbolleiste, um das Auswahlpinsel-Werkzeug zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auswahlpinsel aktivieren aktiviert ist, und klicken Sie auf OK. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel die Ablaufverfolgung so an, dass sie am besten zum Soma passt. Durch das Zoomen wird die Genauigkeit in diesem Schritt ermöglicht.Drücken Sie als Nächstes die T-Taste, um die Soma-Ablaufverfolgung zum ROI-Manager hinzuzufügen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder drücken Sie die M-Taste, um die Ergebnisse anzuzeigen. Kopieren Sie diese Ergebnisse, und fügen Sie sie in ein Datenblatt ein.Wechseln Sie zum Fenster ROI-Manager, wählen Sie den interessenreichen Bereich aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie auf Umbenennen klicken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die umbenannte Interessensregion und klicken Sie auf Speichern. Stellen Sie sicher, dass der Name angibt, dass die Ablaufverfolgung für soma ist, und speichern Sie die Datei.Um den Arborisierungsbereich im IBA1-Kanal zu messen, wählen Sie zuerst das Werkzeug Polygonauswahl aus. Klicken Sie mit dem Werkzeug auf die mikrogliaale Prozessextremität, um die Polygonform zu starten. Gehen Sie um die Mikroglia, indem Sie auf die Spitzen jeder Prozessextremität klicken, um ein Polygon zu bilden, das am besten die Fläche darstellt, die von den mikrogliaalen Arborisationen bedeckt wird.Wenn das Polygon abgeschlossen ist, klicken Sie auf den Startpunkt, um es zu schließen. Drücken Sie dann die T-Taste, um die Ablaufverfolgung zum ROI Manager hinzuzufügen. Wählen Sie Analysieren, Messen oder drücken Sie die M-Taste, um die Daten zum Ergebnisfenster hinzuzufügen.Kopieren Sie diese Daten, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein. Um die Informationen zum Arborisierungsbereich zu speichern, wechseln Sie zum Fenster ROI Manager, wählen Sie den Interessenbereich aus, und ändern Sie den Namen, um dem Namen des Bildes zu entsprechen, indem Sie umbenennen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die umbenannte Interessensregion und klicken Sie auf Speichern.Stellen Sie sicher, dass der Name angibt, dass die Ablaufverfolgung für die Arborisierung bestimmt ist, und speichern Sie die Datei. Diese Studie beschrieb den schrittweisen Arbeitsablauf für die immunfluoreszierende Co-Färbung von IBA1 und TMEM119 sowie für die Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um die Co-Kennzeichnung von Mikroglia mit IBA1 und TMEM119 im koronalen Abschnitt des dorsalen Hippocampus bei 20-facher Vergrößerung abzubilden.Eine erfolgreiche Färbung zeigt mikrogliaale Zellkörper und ihre feinen Prozesse. Die Färbung ermöglicht die Bestimmung der mikrogliaalen Dichte und Verteilung sowie die Identifizierung von mikrogliaalen Clustern und infiltrierenden Makrophagen. Konfokale Mikroskopie wird verwendet, um die schrittweise mikrogliale Arborisation Stoltoisationsverfolgung bei 40-facher Vergrößerung abzubilden.Diese repräsentativen Ergebnisse zeigen IBA1 positive und TMEM119 positive Mikroglia sowie ein Beispiel für die Zellkörperverfolgung. Es ist wichtig, beim Zählen von Zellen konsistent zu sein und sowohl auf die Signale von IBA1 als auch auf TMEM119 zu achten. Diese Technik ermöglicht es dem Forscher, Regionen des Gehirns zu identifizieren, die von einem bestimmten Reiz beeinflusst werden, der dann mit komplementären Techniken eingehender untersucht werden kann.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolierung von myeloider dendritischer Zellen und Epithelzellen Menschliche Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolierung, Fixierung und Immunfluoreszenz Imaging der Maus Nebennieren

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse der SAMHD1-Restriktion durch Durchflusszytometrie in humanen myeloischen U937-Zellen

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...