Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

אנו אסירי תודה לנטלי ורנוקס על הדרכתו ועזרתה בניסויים. בנוסף, אנו רוצים להודות לד"ר עמנואל פלאמל וסרג ' ריבסט לשימוש הקרינה הפלואורסצנטית והקונקמיקרוסקופים שלהם, בהתאמה. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מלגות מהמועצה המקסיקנית למדע וטכנולוגיה (conacyt; ל-F. G. I), fondation famille-צ'קט ומרכז תימטאקה דה רצ'רצ'ה en מדעי המוח (ctrn; כדי K.P.), כפות דה מחקר du קוויבק-סאנטא (כדי מ ב), ו שתיל הודו-קנדי המכון (כדי K.B.), כמו גם מענק דיסקברי ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) כדי M.E.T. M.E.T. מחזיקה כסא מחקר בקנדה (Tier II) של נוירוטיקה החיסונית בריאות וטיפול.

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהסכמה עם ההנחיות לוועדות האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ולוועדת הבריאות של אוניברסיטת לאוול.
1. מכתים חיסוני
<ol><li>בחר שלושה סעיפים המוח העכבר המכיל את אזור הריבית (ROI) (כלומר, ההיפוקמפוס) בעזרתו של אטלס המוח. ...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה ניתן לחלק בשני חלקים קריטיים: איכות ההכתמים והניתוח. אם הצביעת אינו אופטימלי, הוא ייכשל לייצג תאים microglial כראוי, ובכך להשפיע על צפיפות, הפצה, ומורפולוגיה מדידות. בנוסף, הפרופורציה של תאים מיאלואיד היקפית היקפיים עלול להיות לא מזלזל. זוהי גירסה ממוטבת של פרוטוקול ההכתמים, אך ישנם ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

אם אקוטי או כרוני, דלקת נוירו מושפע היטב על ידי microglia, מקרופאגים התושב של המוח. המחשה של מיקרוגלייה באמצעות כתמים חיסוני הוא בעל ערך למחקר של דלקת מוחי עם שימוש של מיקרוסקופ אור, טכניקה נגישה מאוד. בתנאים הומסטטיים, מיקרוגלייה מופצים בדרך כלל בתבנית ללא חפיפה, כמו פסיפס. הם מציגים מנות קטנות שמרחיבות את התהליכים הללו1, אשר לעיתים מגעיםאחד לשני. תהליכים מיקרוסקופיים מיקרוגליאל באופן דינמי לסקר את המוח בתוך מכימומה, אינטראקציה עם נוירונים, תאים גליה אחרים, וכלי דם במהלך מצבים פיזיולוגיים נורמליים3. Microglia מצוידים בארסנל של קולטנים המאפשרים להם לבצע משימות אימונולוגיים להגיב לשינויים בתחומי המוח, למוות בתאים, או לנזק לרקמות. בנוסף, הם להפעיל פונקציות פיזיולוגיות מפתח, בעיקר היווצרות סינפטית, תחזוקה, וביטול4,5.
בין הסמנים הזמינים המשמשים לחקר microglia, כריכת סידן כריכה מתאם מולקולה 1 (IBA1) הוא אחד הנפוצים ביותר. IBA1 הוא חלבון מחייב סידן המספק הדמיה יוצאת דופן של מורפולוגיה microglial, כולל תהליכים בסדר המרוחק, כפי שאושרו על ידי אלקטרון מיקרוסקופ6. כלי זה היה אינסטרומנטלי באפיון טרנספורמציה microglial, שנקרא בעבר "הפעלה", במערך עצום של מחלת בעלי חיים מודלים7,8,9. בנוכחות של דלקת ניווניות, התגובה microglial כוללת: microglial המוגדר כגידול בצפיפות הסלולר, שינויים בהפצה כי לפעמים כתוצאה באשכולות, הגדלה של גוף התא, כמו גם עיבוי ו קיצור של תהליכים המשויכים לצורות מסוימות של מאמתיבה10,11,12,13.
כתמים חיסוני מוגבל על ידי הזמינות של נוגדנים בבימויו של סמנים ספציפיים. חשוב מכך, IBA1 מתבטא על ידי מיקרוגלייה אבל גם על ידי מקרופאגים היקפיים שיסתננו את המוח14. בעוד התבוננות של תאים IBA1-חיוביים בתוך המוח הפך סמן של מיקרוגלייה בתחום זה מחקר, הסתננות מקרופאג היקפית דווחה בתנאים שונים, אפילו שולית במוח בריא15,16 ,17,18. כתוצאה מכך, השימוש IBA1 לבדו אינו מאפשר ויזואליזציה סלקטיבית של microglia. בנוסף, מקרופאגים לאמץ תכונות מולקולריות ומורפולוגיות של מיקרוגליה תושב ברגע שהם חדרו למוח, ובכך בידול19. זה מייצג אתגר בעת חקירת הפונקציה של שני מיקרוגלייה ו הסתננות מקרופאגים.
בעוד מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים יש מקורות ברורים (למשל, מן שק החלמון העובריים ואת מח העצם, בהתאמה20,21), יש מספר גדל והולך של ממצאים המציינים כי שתי אוכלוסיות תאים להפעיל תפקידים שונים במוח19. לפיכך, חיוני להשתמש בשיטות ההפלות בין שתי האוכלוסיות הללו ללא מניפולציות פולשניות (כלומר, מקרי מח עצם או parabiosis) שיכולים לווסת את הצפיפות, ההפצה, המבנה והתפקוד שלהם. TMEM119 התפתחה כסמן ספציפי microglia על פני בריאות ומחלות בתנאים22. בשילוב עם IBA1, סמן זה הופך להיות שימושי להבדיל תאים אלה מן הסתננות מקרופאגים, שהם TMEM119-שליליים ו IBA1-חיובית. למרות שהוא מוסדר באופן מנטלי, TMEM119 מתבטא כבר בימים אחרי הלידה 3 (P3) ו 6 (P6), הגדלת בהתמדה עד להגיע לרמות מבוגרים בין P10 ו P1422. IBA1 מתבטאת מוקדם כמו יום עובריים 10.5 (E 10.5)23. פרוטוקול תיוג כפול המוצע שימושי ובכך לחקור את שתי האוכלוסיות הללו במהלך החיים לאחר הלידה.
פרוטוקול זה מספק הליך חיסוני צעד אחר צעד המאפשר אפליה בין מיקרוגלייה ומקרופאגים היקפיים. זה גם מסביר כיצד לבצע ניתוח כמותי של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם ניתוח של הסתננות מקרופאג היקפית. בעוד החקירה של מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים הוא שימושי משלו, פרוטוקול זה עוד מאפשר לוקליזציה של מייבשי נוירודלקתיות; לפיכך, היא משמשת גם כפלטפורמה לזיהוי אזורים מסוימים כדי לחקור, עם שימוש בטכניקות משלימות (עדיין, זמן רב יותר וצורכת משאבים).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

זהו פרוטוקול עבור הדמיה כפולה של מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים ברקמת המוח של העכבר. TMEM119 (אשר מדבקות מיקרוגלייה באופן סלקטיבי), כאשר בשילוב עם IBA1 (אשר מספק הדמיה יוצאת דופן של המבנה שלהם), מאפשר חקירה של שינויים צפיפות, הפצה, מורפולוגיה. לכמת את הפרמטרים הללו חשוב במתן תובנות לתוך התפקידים שהופעלו על ידי microglia, מקרופאגים המתמחים של המוח. בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, מיקרוגלייה מופצים באופן קבוע בדפוס כמו פסיפס ולהציג סומה קטנה עם תהליכים מסויד. עם זאת, כתגובה לגורמים סביבתיים (קרי, טראומה, זיהום, מחלה או פציעה), צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה משתנות בנימוסים שונים, בהתאם לעלבון. בנוסף, השיטה המתוארת כפולה כפולות מאפשר ויזואליזציה של הסתננות מקרופאגים במוח מבוסס על הביטוי שלהם IBA1 וללא התאמה לשפות אחרות עם TMEM119. גישה זו מאפשרת הפליה בין מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים, אשר נדרש כדי לספק תובנות תפקודית למעורבות שלהם ברורים הומאוסטזיס המוח על פני ההקשרים השונים של בריאות ומחלות. פרוטוקול זה משלב את הממצאים העדכניים ביותר נוירואימונולוגיה הנוגעת לזיהוי של סמנים סלקטיבית. הוא משמש גם כלי שימושי עבור נוירואימונוולוגים מנוסים וחוקרים המבקשים לשלב נוירואימונולוגיה לפרויקטים.

איור 1 מציג את שיתוף התיוג של מיקרוגלייה באמצעות IBA1 ו TMEM119 בחלק הקורילי של ההיפוקמפוס הדו היפוב1 ב-20x על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מכתים מוצלח חושף את גופי התא microglial ואת התהליכים העדינים שלהם (איור 1א-ג). זה הצביעת מאפשר נחישות של צ...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

פרוטוקול זה יראה לך כיצד להכתים microglia, לבצע צפיפות כמותית וניתוח מורפולוגיה, כמו גם לכמת חדירת מקרופאג לתוך המוח. טכניקה זו מאפשרת לחוקר למדוד שינויים בהפצת מיקרוגליה ומורפולוגיה באופן כמותי ולהבדיל בין מיקרוגליה לבין חדירת מקרופאגים פרוטוקול ניתוח זה יכול להיות מיושם בקלות על מודלים אחרים של בעלי חיים כדי למדוד שינויים בהפצה מיקרוגליאלית ומורפולוגיה שבהם זמינים נוגדנים נגד IBA1 ואנטי TMEM119. מומלץ מאוד לבצע את ספירת התאים ואת העקבות עיוורים למצב הניסיוני להיות עקבי באופן שבו הליך זה מבוצע.כדי להתחיל בהליך זה, פתח תוכנית לעיבוד תמונה כגון Fiji או ImageJ שבה מותקן תוסף מרחק השכן הקרוב ביותר. פתחו את התמונה 20X אם קנה המידה כלול במטא-נתונים של הקובץ ולא מוגדר אוטומטית מהמטא-נתונים. שורת התפריטים, בחר נתח, הגדר קנה מידה ולאחר מכן הזן את המידע הנכון.להגדרה ידנית של קנה המידה בהתאם לקנה מידה המוטבע בתמונה, בחרו בכלי קו ישר. מקם את הסמן בקצה קנה המידה ובזמן הקשה על מקש Shift, צייר קו קרוב ככל האפשר לשינוי קנה המידה בתמונה. בחר נתח, הגדר קנה מידה.חלון יצץ ויניח את המרחק הידוע ואת יחידת האורך הנכונים כדי לקבוע את יחידת הפיקסל לכל אורך ולחוץ על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'צור ללא הפרדות צבע' ליצירת תמונה ללא הפרדות צבע מכל הערוצים. שורת התפריטים, בחר נתח, הגדר מידות. בדוק את האזור, המרכז וההיקף.בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר בקובץ הפתיחה ולאחר מכן לחץ על אישור. עבור אל תמונה, צבע, כלי ערוץ לפתיחת הכלי ערוץ. השתמש בכלי בחירה ביד חופשית כדי לצייר היקף מחוספס סביב אזור העניין. לחצו פעמיים על הכלי אליפסה ב סרגל הכלים כדי להפוך את הכלי מברשת הבחירה לזמין.ודאו שהתיבה 'הפוך מברשת בחירה לזמינה' מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר'. באמצעות מברשת הבחירה, התאימו את ההיקף כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לאזור העניין, ולאחר מכן הקישים T על המקלדת באזור זה כדי ללחוץ על מנהל Y של החץ. בחרו 'נתח', 'מדוד' או הקש על מקש M וחלון 'תוצאות' יצצים. העתק והדבק את התוצאות לתוך גליון נתונים ושמור את המידע הנוגע לאזור.לאחר העתקת האזור של אזור העניין, אתה מבסס את המידע מחלון התוצאות על-ידי לחיצה עליו והקשה על מקש Backspace. בחר בחלון מנהל ההשקעות, בחר את מעקב ROI ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ על אישור ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם החדש של המעקב והשמור של ROI.לחצו פעמיים על הכלי מברשת ב סרגל הכלים. בחרו בצבע שחור ובגודל המברשת של 10. ודא שהאפשרות 'צייר על שכבת-על' אינה מסומנת.בערוץ TMEM119, מקם בזהירות נקודה שחורה במרכז ה- soma עבור כל מיקרוגליה חיובית TMEM119. מקם נקודה לבנה במרכז התאים אינם חיוביים עבור TMEM119. חזור על אותו הליך עבור כל התאים הכלולים באזור העניין.לאחר מכן, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'פיצול ערוץ', יופיע חלון לכל ערוץ. זהה את הערוץ עם ביאורי הנקודות וסגור את שני החלונות האחרים. כדי לנתב מחדש את תמונת הערוץ המפוצל החדשה, עבור אל נתח, הגדר מידות.בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר בתדמית פיצול ערוץ ולחץ על אישור. לאחר מכן בחרו 'תמונה', 'הקלד', 'שמונה סיביות'. עבור אל התאמת תמונה ובחר סף. כוונן את המחוונים כל הדרך שמאלה בשני מייצגי הפעילויות.פעולה זו תשאיר רק את הנקודות השחורות שיופיעו כעת בלבן. בחר את אזור העניין בחלון מנהל ההשקעות. שורת התפריטים, בחר נתח, נתח חלקיקים.בתיבת הטקסט עבור גודל, הזן אחד עד 20. התיבה עבור יחידות פיקסלים צריכה להישאר לא מסומנת כאשר יש לבדוק את התיבה עבור תוצאות תצוגה, סיכום והוספה למנהל. לחץ על אישור כדי להציג את חלון הסיכום שייתן את מספר הנקודות.העתק והדבק מידע זה בגיליון הנתונים. לאחר מכן, בחר תוספים NND כדי להציג את חלון NND. כל מספר מייצג את המרחק שיש לכל מיקרוגליה למיקרוגליה השכנה הקרובה ביותר.העתק והדבק את כל המידע הזה בגיליון הנתונים. חזור לחלון הסף והתאם את המחוון העליון כל הדרך ימינה, מה שישיר את כל הנקודות הלבנות גלויות, שנראות כעת לבנות. בחרו 'נתח', 'נתח חלקיקים' כדי להציג את החלון הנפתח 'נתח חלקיקים'.לחץ על אישור כדי להציג את חלון הסיכום המספק את מספר הנקודות. העתק והדבק מידע זה בגיליון הנתונים. עבור אל מנהל ההשקעות (ROI Manager) ובחר את כל הנקודות.לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ושמור עם שם התמונה. פעולה זו תאפשר שמירה של כל הנקודות בקובץ ZIP. ראשית, פתחו את קובצי התמונה של 4DX.יופיע חלון מוקפץ שישאל אם יש לפתוח את התמונות בערימה. לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תמונה, ערימות, ZProject כדי לפתוח את חלון הקרנה Z. כלול את כל הפרוסות מהפרוסה הראשונה עד האחרונה.ודא שהעוצמה המרבית נבחרה תחת סוג הקרנה ולחץ על אישור. לחץ על החלון החדש המכיל את ZProject. בחרו 'תמונה', 'צבעים', 'פיצול ערוצים' ונהלו את המעקבים בתמונות של ערוץ IBA1. שורת התפריטים, בחרו 'נתח', 'קבע מידות'.בדקו את האזור, המרכז וההיקף. בתפריט הנפתח נתב מחדש אל, בחר את הקובץ הפתוח ולחץ על אישור. להגדרה ידנית של קנה המידה בהתאם לקנה מידה המוטבע בתמונה, בחרו בכלי קו ישר. מקם את הסמן בקצה קנה המידה ובזמן הקשה על מקש Shift, צייר קו קרוב ככל האפשר לשינוי קנה המידה בתמונה.בחר נתח, הגדר קנה מידה. חלון יצץ. הזן את המרחק הידוע ואת יחידת האורך הנכונים כדי לקבוע את יחידת הפיקסלים לכל אורך ולחץ על אישור. כדי למדוד את גודל soma בערוץ IBA1, לצייר היקף מחוספס של soma עם הכלי בחירה ביד חופשית.לחצו פעמיים על הכלי אליפסה בסרגל הכלים כדי להפוך את הכלי מברשת בחירה לזמין. ודאו שהתיבה 'הפוך מברשת בחירה לזמינה' מסומנת ולחצו על הלחצן 'אשר'. בעזרת מברשת הבחירה, כווננו את המעקב כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לסומה. התקרבות תאפשר דיוק במהלך שלב זה.לאחר מכן, הקש על מקש T כדי להוסיף את מעקב soma למנהל ההשקעות. בחר נתח, למדוד או הקש על מקש M כדי להציג את התוצאות. העתק והדבק תוצאות אלה בגיליון נתונים.עבור אל חלון מנהל ההשקעות, בחר את אזור העניין ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אזור העניין ששמו שונה ולחץ על שמור. ודא שהשם מציין שהמעקב הוא עבור soma ושמור את הקובץ.למדידת אזור ארבוריזציה בערוץ IBA1, בחרו תחילה בכלי בחירת מצולע. לחץ על גפיים תהליך microglial עם הכלי כדי להתחיל את צורת המצולע. הסתובב במיקרוגליה על ידי לחיצה על קצות כל תהליך כדי ליצור מצולע המייצג בצורה הטובה ביותר את האזור המעובד על ידי ההתארגנויות המיקרוגליאליות.לאחר השלמת המצולע, לחץ על נקודת ההתחלה כדי לסגור אותו. לאחר מכן, הקש על מקש T כדי להוסיף את המעקב למנהל ההשקעות. בחר נתח, למדוד או הקש על מקש M כדי להוסיף את הנתונים לחלון תוצאות.העתק והדבק נתונים אלה בגיליון הנתונים. כדי לשמור את המידע אודות אזור האחזור מחדש, עבור לחלון מנהל ההשקעות, בחר את אזור העניין ושנה את השם כך שיתאימו לשם התמונה על-ידי הקשה על שנה שם. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על אזור העניין ששמו שונה ולחץ על שמור.ודא שהשם מציין שהמעקב הוא לצורך סידור מחדש ושמור את הקובץ. מחקר זה תיאר את זרימת העבודה צעד אחר צעד עבור כתמים משותפים immunofluorescent של IBA1 ו TMEM119 וניתוח של צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה, כמו גם של חדירת תאים מיאלואידיים היקפיים ברקמת המוח העכבר. מיקרוסקופיה פלואורסצנטי משמשת לתווית שותף של מיקרוגליה באמצעות IBA1 ו- TMEM119 בחלק הקורונה של ההיפוקמפוס הגבי בהגדלה של פי 20.הכתמה מוצלחת חושפת את גופי התאים המיקרוגליאליים ואת התהליכים העדינים שלהם. הכתמים מאפשרים קביעת צפיפות והתפלגות מיקרוגליאלית וזיהוי אשכולות מיקרוגליאליים ומאקרופאגים חודרים. מיקרוסקופ קונפוקלי משמש כדי לדמיין את הליך המעקב ארבוריזציה microglial צעד בהגדלה 40X.תוצאות מייצגות אלה מראות IBA1 חיובי TMEM119 microglia חיובי, כמו גם דוגמה של מעקב גוף התא. חשוב להיות עקבי בעת ספירת תאים לשים לב לשני האותות של IBA1 ו TMEM119. טכניקה זו מאפשרת לחוקר לזהות אזורים במוח המושפעים מגירוי מסוים אשר לאחר מכן ניתן ללמוד לעומק יותר עם טכניקות משלימות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

בידוד, קיבוע, Immunofluorescence הדמיה של העכבר בלוטת יותרת הכליה

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...