Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
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Siamo grati a Nathalie Vernoux per la sua guida e assistenza con gli esperimenti. Vorremmo anche ringraziare i dottori Emmanuel Planel e Serge Rivest per l'uso della loro fluorescenza e microscopi confocali, rispettivamente. Questo lavoro è stato in parte finanziato da borse di studio del Consiglio messicano della scienza e della tecnologia (CONACYT; a F.G.I), Fondation Famille-Choquette e Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; a K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (a M.B.), e Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), così come una sovvenzione Discovery dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) al M.E.T.M.E.T. ha una cattedra di ricerca canadese (livello II) di plasticità neuroimmune in salute e terapia.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in accordo con le linee guida dei comitati istituzionali etici degli animali, in conformità con il Canadian Council on Animal Care e l'Animal Care Committee dell'Università Laval.
1. Immunostaining
<ol><li>Selezionare tre sezioni del cervello del mouse contenenti la regione di interesse (ROI) (cioè l'ippocampo) con l'aiuto di un atlante cerebrale. Collocare le sezioni in una piastra multi-pozza di plastica e coprirle con 350 - L di salin...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Questo protocollo può essere diviso in due parti critiche: la qualità della colorazione e l'analisi. Se la colorazione non è ottimale, non riuscirà a rappresentare adeguatamente le cellule microgliali, influenzando così la densità, la distribuzione e le misurazioni della morfologia. Inoltre, la percentuale di cellule mieloidi periferiche di infiltrazione può essere sottovalutata. Questa è una versione ottimizzata del protocollo di colorazione, ma ci sono diversi fattori che possono provocare immagini non ottimali...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Che sia acuta o cronica, la neuroinfiammazione è strettamente influenzata dalla microglia, i macrofagi residenti del cervello. La visualizzazione della microglia attraverso l'immunostaining è preziosa per lo studio della neuroinfiammazione con l'uso della microscopia leggera, una tecnica altamente accessibile. In condizioni omeostatiche, la microglia è tipicamente distribuita in un modello non sovrapponi, simile a un mosaico. Essi esibiscono piccoli somas che estendono processi ramificati1, che a volte si contattanol'unl'altro 2 . I processi microgliali ramificati esaminano dinamicamente il parenchyma cerebrale, interagendo con neuroni, altre cellule gliali e vasi sanguigni durante le normali condizioni fisiologiche3. Le microglia sono dotate di un arsenale di recettori che consentono loro di eseguire compiti immunologici e rispondere ai cambiamenti nell'ambiente cerebrale, alla morte cellulare o ai danni ai tessuti. Inoltre, esercitano funzioni fisiologiche chiave, in particolare nella formazione sinaptica, manutenzione, ed eliminazione4,5.
Tra i marcatori disponibili utilizzati per studiare la microglia, l'adattatore legante di calcio ionizzato molecola 1 (IBA1) è uno dei più utilizzati. IBA1 è una proteina legante di calcio che fornisce una visualizzazione eccezionale della morfologia microgliale, compresi i processi distale fini, come confermato dalla microscopia elettronica6. Questo strumento è stato determinante nella caratterizzazione della trasformazione microgliale, precedentemente chiamata "attivazione", in una vasta gamma di modelli di malattie animali7,8,9. In presenza di neuroinfiammazione, la risposta microgliale comprende: microgliosi che è definita come un aumento della densità cellulare, cambiamenti nella distribuzione che a volte si traducono in clustering, allargamento del corpo cellulare, così come ispessimento e ispessimento e accorciamento dei processi associati a più forme ameboide10,11,12,13.
L'immunostaining è limitato dalla disponibilità di anticorpi diretti contro marcatori specifici. È importante sottolineare che IBA1 è espresso dalla microglia ma anche dai macrofagi periferici che si infiltrano nel cervello14. Mentre l'osservazione delle cellule iBA1 positive all'interno del cervello è diventata un marcatore di microglia in questo campo di ricerca, l'infiltrazione di macrofagi periferici è stata segnalata in varie condizioni, anche marginalmente nel cervello sano15,16 ,17,18. Di conseguenza, l'uso di IBA1 da solo non consente la visualizzazione selettiva della microglia. Inoltre, i macrofagi adottano caratteristiche molecolari e morfologiche della microglia residente una volta che si sono infiltrati nel cervello, ostacolando così la differenziazione19. Questo rappresenta una sfida quando si studia la funzione della microglia e dell'infiltrazione dei macrofagi.
Mentre le microglia e i macrofagi periferici hanno origini distinte (ad esempio, dal sacco del tuorlo embrionale e dal midollo osseo, rispettivamente20,21), vi è un numero crescente di rilievi che indicano che le due popolazioni di cellule esercitano diversi ruoli nel cervello19. È quindi fondamentale utilizzare metodi che discriminano tra queste due popolazioni senza manipolazioni invasive (cioè chimere di midollo osseo o parabiosi) che possono modularne la densità, la distribuzione, la morfologia e la funzione. Il TMEM119 è emerso come un marcatore specifico della microglia in tutte le condizioni di salute e malattia22. In combinazione con IBA1, questo marcatore diventa utile per differenziare queste cellule dall'infiltrazione di macrofagi, che sono TMEM119-negativi e IBA1-positivi. Mentre è regolamentato dal punto di vista dello sviluppo, TMEM119 è espresso già nei giorni postnatali 3 (P3) e 6 (P6), in costante aumento fino a raggiungere i livelli degli adulti tra P10 e P1422. IBA1 è espresso già come giorno embrionale 10.5 (E10.5)23. Il protocollo di doppia etichettatura proposto è quindi utile per studiare queste due popolazioni per tutta la vita postnatale.
Questo protocollo fornisce una procedura di immunostaining passo-passo che consente la discriminazione tra microglia e macrofagi periferici. Spiega anche come condurre un'analisi quantitativa della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché un'analisi dell'infiltrazione dei macrofaghi periferici. Mentre lo studio di microglia e macrofagi periferici è utile da solo, questo protocollo consente ulteriormente la localizzazione di foyer neuroinfiammatori; quindi, serve anche come piattaforma per identificare aree specifiche da studiare, con l'uso di tecniche complementari (ancora, più dispendiose in termini di tempo e risorse).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Questo è un protocollo per la doppia visualizzazione della microglia e l'infiltrazione di macrofagi nel tessuto cerebrale del topo. TMEM119 (che etichetta la microglia in modo selettivo), se combinato con IBA1 (che fornisce un'eccezionale visualizzazione della loro morfologia), consente di sforare i cambiamenti nella densità, nella distribuzione e nella morfologia. Quantificare questi parametri è importante per fornire informazioni sui ruoli esercitati dalla microglia, i macrofagi residenti del cervello. In condizioni fisiologiche normali, le microglie sono regolarmente distribuite in un modello a mosaico e presentano un piccolo soma con processi ramificati. Tuttavia, come risposta a fattori ambientali (ad esempio, traumi, infezioni, malattie o lesioni), la densità microgliale, la distribuzione e la morfologia vengono alterate in vari modi, a seconda dell'insulto. Inoltre, il metodo di doppia colorazione descritto consente la visualizzazione di macrofagi infiltrati nel cervello in base alla loro espressione di IBA1 e senza colocalizzazione con TMEM119. Questo approccio consente quindi la discriminazione tra microglia e infiltrazione di macrofagi, che è necessaria per fornire informazioni funzionali sul loro distinto coinvolgimento nell'omeostasi cerebrale in vari contesti di salute e malattia. Questo protocollo integra le ultime scoperte in neuroimmunologia relative all'identificazione di marcatori selettivi. Serve anche come strumento utile sia per i neuroimmunologi esperti che per i ricercatori che cercano di integrare la neuroimmunologia nei progetti.

La figura 1 mostra la co-etichettatura della microglia utilizzando IBA1 e TMEM119 in una sezione coronale dell'ippocampo dorsale immagine a 20x dalla microscopia a fluorescenza. Una colorazione di successo rivela i corpi cellulari microgliali e i loro processi fini (Figura 1A-C). Questa colorazione consente la determinazione della densità microgliale e la distribuzione e l'identificazione dei cluster microgliali...

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Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro passo-passo per la costaintura immunofluorescente di IBA1 e TMEM119, oltre all'analisi della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché dell'infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel tessuto cerebrale del topo.

Immunofluorescenza Colorazione utilizzando IBA1 e TMEM119 per densità microgliale, morfologia e infiltrazione delle cellule mieloidi periferiche nel cervello del mouse

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Questo protocollo ti mostrerà come macchiare le microglia, eseguire analisi quantitative di densità e morfologia, nonché quantificare l'infiltrazione di macrofagi nel cervello. Questa tecnica consente al ricercatore di misurare i cambiamenti nella distribuzione e nella morfologia delle microglia in modo quantitativo e di differenziare le microglia dai macrofagi infiltrati Questo protocollo di analisi può essere facilmente applicato ad altri modelli animali per misurare i cambiamenti nella distribuzione microgliale e nella morfologia in cui sono disponibili anticorpi anti-IBA1 e anti-TMEM119. Si consiglia vivamente di condurre il conteggio delle cellule e le tracce accecate alla condizione sperimentale e di essere coerenti nel modo in cui viene eseguita questa procedura.Per iniziare questa procedura, aprire un programma di elaborazione delle immagini come Fiji o ImageJ in cui è installato il plug-in di distanza adiacente più vicino. Aprire l'immagine 20X se la scala è contenuta nei metadati del file e non impostata automaticamente dai metadati. Sulla barra dei menu selezionare Analizza, Imposta scala e quindi immettere le informazioni corrette.Per impostare manualmente la scala in base a una scala impressa sull'immagine, selezionare lo strumento Linea retta. Posizionare il cursore sul bordo della scala e mentre si preme MAIUSC, disegnare una linea il più vicino possibile alla scala dell'immagine. Selezionate Analizza (Analyze), Imposta scala (Set Scale).Verrà visualizzata una finestra che metterà la distanza e l'unità di lunghezza note corrette per determinare l'unità di lunghezza del pixel e farà clic su OK. Selezionare Quindi Immagine, Colore, Crea composito per creare un'immagine composita di tutti i canali. Sulla barra dei menu selezionare Analizza, Imposta misure. Controlla area, centroide e perimetro.Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare il file Apri e quindi fare clic su OK. Passare a Immagine, Colore, Strumento Canale per aprire lo strumento Canale. Utilizzate lo strumento Selezione a mano libera per disegnare un perimetro approssimativo attorno alla regione di interesse. Fare doppio clic sullo strumento Ovale sulla barra degli strumenti per abilitare lo strumento Pennello di selezione.Verificare che la casella Abilita pennello selezione sia selezionata e fare clic su OK. Utilizzando il pennello di selezione, regolare il perimetro per adattarlo al meglio all'area di interesse, quindi premere T sulla tastiera in tutta l'area per freccia Y manager. Selezionare Analizza, Misura o Premi il tasto M e verrà visualizzata la finestra Risultati. Copiare e incollare i risultati in una scheda tecnica e salvare le informazioni relative all'area.Dopo aver copiato l'area dell'area di interesse, potete basare le informazioni dalla finestra Risultati facendo clic su di essa e premendo il tasto Backspace. Selezionare la finestra Gestione ROI, selezionare traccia ROI e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic su OK, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sul nuovo nome di Traccia ROI e salvare.Fare doppio clic sull'utensile Pennello nella barra degli strumenti. Selezionare il colore nero e la dimensione Pennello 10. Assicuratevi che l'opzione Disegno sulla sovrapposizione sia deselezionata.Nel canale TMEM119 posizionare con cura un punto nero al centro del soma per ogni microglia positiva TMEM119. Posizionare un punto bianco al centro delle celle che non sono positive per TMEM119. Ripetere la stessa procedura per tutte le celle contenute nell'area di interesse.Quindi, selezionare Immagine, Colore, Canale diviso, verrà visualizzata una finestra per ogni canale. Identificare il canale con le annotazioni punto e chiudere le altre due finestre. Per reindirizzare la nuova immagine del canale diviso, passare a Analizza, Imposta misure.Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare l'immagine di dividi canale e fare clic su OK. Quindi selezionare Immagine, Tipo, otto bit. Passare a Regolazione immagine e selezionare Soglia. Regolare i dispositivi di scorrimento fino a sinistra in entrambe le barre.Questo lascerà solo i punti neri che ora appariranno bianchi. Selezionare l'area di interesse nella finestra Gestione ROI. Nella barra dei menu selezionare Analizza, Analizza particella.Nella casella di testo Dimensioni immettere da uno a 20. La casella per le unità Pixel deve rimanere deselezionata mentre la casella per Risultati di visualizzazione, Riepiloga e Aggiungi a Manager deve essere selezionata. Fare clic su OK per visualizzare la finestra Riepilogo che fornirà il numero di punti.Copiare e incollare queste informazioni nella scheda tecnica. Selezionare quindi nnd plug-in per visualizzare la finestra NND. Ogni numero rappresenta la distanza che ogni microglia ha verso le microglia vicine più vicine.Copiare e incollare tutte queste informazioni nella scheda tecnica. Tornare alla finestra Soglia e regolare il dispositivo di scorrimento superiore fino a destra, che lascerà visibili tutti i punti bianchi, ora appaiono bianchi. Selezionate Analizza (Analyze), Analizza particella (Analyze Particle) per visualizzare la finestra a comparsa Analizza particelle (Analyze Particles).Fare clic su OK per visualizzare la finestra Riepilogo che fornisce il numero di punti. Copiare e incollare queste informazioni nella scheda tecnica. Vai a ROI Manager e seleziona tutti i punti.Quindi fai clic con il pulsante destro del mouse e salva con il nome dell'immagine. Ciò consentirà il salvataggio di tutti i punti in un file ZIP. Per prima cosa, apri i file di immagine 4DX.Apparirà una finestra pop-up che chiede se le immagini devono essere aperte in una pila. Fare clic su OK. Selezionare Quindi Immagine, Stack, ZProject per aprire la finestra Proiezione Z. Includere tutte le sezioni dalla prima all'ultima sezione.Assicurate che l'intensità massima sia selezionata in Tipo proiezione (Projection Type) e fate clic su OK. Fare clic sulla nuova finestra contenente ZProject. Selezionare Immagine, Colori, Dividi canali e condurre le tracce sulle immagini del canale IBA1. Nella barra dei menu selezionare Analizza, Imposta misure.Controlla l'area, il centroide e il perimetro. Nel menu a discesa Reindirizza a selezionare il file aperto e fare clic su OK. Per impostare manualmente la scala in base a una scala impressa sull'immagine, selezionare lo strumento Linea retta. Posizionare il cursore sul bordo della scala e mentre si preme MAIUSC, disegnare una linea il più vicino possibile alla scala dell'immagine.Selezionate Analizza (Analyze), Imposta scala (Set Scale). Apparirà una finestra. Immettere la distanza e l'unità di lunghezza note corrette per determinare i pixel per unità di lunghezza e fare clic su OK. Per misurare le dimensioni del soma nel canale IBA1, disegnate un perimetro approssimativo del soma con lo strumento Selezione a mano libera.Fare doppio clic sullo strumento Ovale sulla barra degli strumenti per abilitare lo strumento Pennello selezione. Verificare che la casella Abilita pennello selezione sia selezionata e fare clic su OK. Utilizzando il pennello selezione, regolate la traccia per adattarla al meglio al soma. Lo zoom avanti consentirà la precisione durante questo passaggio.Quindi, premere il tasto T per aggiungere la traccia soma a ROI Manager. Selezionare Analizza, Misura o premere M per visualizzare i risultati. Copiare e incollare questi risultati in una scheda tecnica.Passare alla finestra Gestione ROI, selezionare l'area di interesse e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse rinominata e scegliere Salva. Assicurarsi che il nome specifichi che la traccia è per soma e salvare il file.Per misurare l'area di arborizzazione nel canale IBA1, selezionare innanzitutto lo strumento Selezione poligono. Fare clic sull'estremità del processo microgliale con lo strumento per avviare la forma poligonale. Gira intorno alla microglia cliccando sulle punte di ogni estremità del processo per formare un poligono che meglio rappresenta l'area coperta dalle arborizzazioni microgliali.Al termine del poligono, fare clic sul punto di partenza per chiuderlo. Quindi, premere il tasto T per aggiungere la traccia a ROI Manager. Selezionare Analizza, Misura o premere M per aggiungere i dati alla finestra Risultati.Copiare e incollare questi dati nella scheda tecnica. Per salvare le informazioni relative all'area di arborizzazione, passare alla finestra Gestione ROI, selezionare l'area di interesse e modificare il nome in modo che corrisponda al nome dell'immagine premendo Rinomina. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area di interesse rinominata e scegliere Salva.Assicurarsi che il nome specifichi che la traccia è per l'arborizzazione e salvare il file. Questo studio ha descritto il flusso di lavoro passo-passo per la co-colorazione immunofluorescente di IBA1 e TMEM119 e per l'analisi della densità microgliale, della distribuzione e della morfologia, nonché dell'infiltrazione di cellule mieloidi periferiche nel tessuto cerebrale del topo. La microscopia a fluorescenza viene utilizzata per l'immagine della co-etichettatura delle microglia usando IBA1 e TMEM119 nella sezione coronale dell'ippocampo dorsale con ingrandimento 20X.Una colorazione di successo rivela i corpi cellulari microgliali e i loro processi fini. La colorazione consente la determinazione della densità e della distribuzione microgliale e l'identificazione di ammassi microgliali e macrofagi infiltrarsi. La microscopia confocale viene utilizzata per l'immagine della procedura di tracciamento dell'arborizzazione microgliale graduale con ingrandimento 40X.Questi risultati rappresentativi mostrano microglia positiva IBA1 e TMEM119, nonché un esempio di tracciamento del corpo cellulare. È importante essere coerenti nel conteggio delle cellule e prestare attenzione a entrambi i segnali di IBA1 e TMEM119. Questa tecnica consente al ricercatore di identificare le regioni del cervello che sono interessate da un particolare stimolo che può quindi essere studiato più approfonditamente con tecniche complementari.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e analisi citofluorimetrica di-Glioma infiltrazione sangue periferico mononucleari Cellule

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolamento, fissazione e immunofluorescenza Imaging delle ghiandole adrenali Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analisi della restrizione di SAMHD1 mediante citometria a flusso in cellule mieloidi umane U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Separazione delle sottopopolazioni di cellule immunitarie nei campioni di sangue periferico da bambini con mononucleosi infettiva

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...