Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
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ナタリー・ヴェルヌーの指導と実験への支援に感謝しています。また、エマニュエル・プラネル博士とセルジュ・リヴェスト博士の蛍光顕微鏡と共焦点顕微鏡の使用に感謝申し上げたい。この作品の一部は、メキシコ科学技術評議会(CONACYT;to F.G.I)、フォンダシオン・ファミーユ・チョケット、センター・テマティック・ド・レッシェルシュ・エン・ニューロサイエンス(CTRN;to K.P.)、フォン・ド・レッシェルシュ・デュ・ケベック-サンテ(M.B.)の奨学金によって資金提供されました。シャストリ・インド・カナダ研究所(K.B.へ)のほか、カナダ自然科学・工学研究評議会(NSERC)からM.E.T.M.E.T.へのディスカバリー・グラントは、カナダの健康と治療における神経可塑性の研究委員長(Tier II)を保有しています。

すべての実験手順は、カナダ動物ケア評議会およびラバル大学動物ケア委員会に従って、制度動物倫理委員会のガイドラインに従って行われました。
1. 免疫染色
<ol><li>脳アトラスの助けを借りて、対象領域(ROI)(海馬)を含む3つのマウス脳セクションを選択します。セクションをプラスチック製のマルチウェルプレートに入れ、350 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で覆いま?...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

このプロトコルは、染色と分析の品質という2つの重要な部分に分けることができます。染色が最適でない場合、マイクログリア細胞を適切に表現できず、密度、分布、および形態測定に影響を与えます。また、浸潤末末性骨髄細胞の割合は過小評価され得る。これは染色プロトコルの最適化されたバージョンですが、最適でない画像につながる可能性のあるいくつかの要因があります。動物...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
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Maude&#160;Bordeleau

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Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

急性か慢性かにかかわらず、神経炎症はミクログリア、脳の常駐マクロファージによって密接に影響される。免疫染色を通じてミクログリアを可視化することは、光顕微鏡を用いた神経炎症の研究に役立つもので、非常にアクセスしやすい技術である。ホメオスタティック条件では、ミクログリアは通常、重なり合わないモザイク状のパターンで分布します。彼らは時々互いに接触する、ラミズされたプロセス1を拡張する小さなソマを示しています。微小グリアの突起プロセスは、正常な生理学的状態の間にニューロン、他のグリア細胞、および血管と相互作用する脳性毛腫を動的に調査する3。ミクログリアは、免疫学的タスクを実行し、脳のミリュー、細胞死、または組織損傷の変化に応答することを可能にする受容体の武器を備えています。加えて、それらは主要な生理学的機能を発揮し、特にシナプス形成、維持、および排除4、5で行う。
ミクログリアの研究に用いられる利用可能なマーカーの中でも、イオン化カルシウム結合アダプター分子1(IBA1)が最も広く用いられているものの1つである。IBA1は、電子顕微鏡6によって確認された微細遠位プロセスを含む微小グリア形態の例外的な可視化を提供するカルシウム結合タンパク質である。このツールは、以前は「活性化」と呼ばれていた微小グリア変換を、動物疾患モデル7、8、9の広大な配列で特徴付けるのに役立ちました。神経炎症の存在下で、微小グリア応答は、細胞密度の増加として定義される微小グリア症、時にはクラスタリング、細胞体の拡大、ならびに肥厚をもたらす分布の変化を含む。より多くのアメボイド形状10、11、12、13に関連するプロセスの短縮。
免疫染色は、特定のマーカーに対する抗体の入手可能性によって制限される。重要なことに、IBA1はミクログリアによって発現されるが、また脳14に浸潤する末梢マクロファージによって発現される。脳内のIBA1陽性細胞の観察は、この研究分野においてミクログリアのマーカーとなっているが、末梢マクロファージ浸潤は様々な条件下で報告されており、健康な脳15、16においてもわずかに 、17、18.したがって、IBA1単独の使用は、ミクログリアの選択的可視化を可能にしません。さらに、マクロファージは、いったん脳に侵入したミクログリアの分子的および形態学的特徴を採用し、したがって分化を妨げる19。これは、ミクログリアと浸潤マクロファージの両方の機能を調査する際の課題を表しています。
ミクログリアおよび末梢マクロファージは異なる起源を有するが(例えば、胚黄嚢および骨髄から、それぞれ20、21)、2つの細胞集団が発揮することを示す所見の数が増加している。脳内の異なる役割19.したがって、侵襲的な操作(すなわち、骨髄キメラまたはパラバイオシス)を伴わずに、密度、分布、形態、および機能を調節することができるこれらの2つの集団を区別する方法を使用することが重要です。TMEM119は、健康および疾患状態22にわたるミクログリア特異的マーカーとして出現した。IBA1と組み合わせると、このマーカーは、TMEM119陰性およびIBA1陽性である浸潤マクロファージからこれらの細胞を区別するのに有用となる。発達的に規制されている間、TMEM119は出生後3(P3)および6(P6)と早くも発現し、P10とP1422の間で成人レベルに達するまで着実に増加する。IBA1は胚の日10.5(E10.5)23と早くも表される。提案された二重標識プロトコルは、したがって、出生後の生活を通じてこれらの2つの集団を研究するのに有用である。
このプロトコルは、ミクログリアと末梢マクロファージ間の判別を可能にする段階的な免疫染色手順を提供する。また、ミクログリア密度、分布、形態の定量的分析や、末梢マクロファージ浸潤の解析を行う方法についても説明します。ミクログリアおよび末梢マクロファージの調査はそれ自体で有用であるが、このプロトコルはさらに神経炎症性ホワイエの局在化を可能にする。したがって、補完的な (まだ、より時間とリソースを消費する) 技術を使用して、調査する特定の領域を識別するプラットフォームとしても機能します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

これは、ミクログリアの二重可視化とマウス脳組織におけるマクロファージへの浸潤のためのプロトコルである。TMEM119(ミクログリアに選択的にラベルを付ける)をIBA1(形態の例外的な可視化を提供する)と組み合わせることで、密度、分布、形態の変化を調査することができます。これらのパラメータを定量化することは、脳の常駐マクロファージであるミクログリアによって引き起こされる役割に関する洞察を提供する上で重要である。正常な生理学的条件下では、ミクログリアはモザイク状のパターンで定期的に分布し、ラミズプロセスを有する小さなソーマを提示する。それにもかかわらず、環境要因(すなわち、外傷、感染、疾患、または傷害)に対する応答として、微小グリア密度、分布、および形態は、侮辱に応じて様々な方法で変化する。さらに、記載された二重染色法は、IBA1の発現に基づいて脳内のマクロファージに浸潤し、TMEM119との共振を伴わずに可視化することを可能にする。このようにこのアプローチは、ミクログリアと浸潤マクロファージとの間の差別を可能にし、健康と疾患の様々な文脈にわたって脳恒常性に対する彼らの明確な関与に対する機能的な洞察を提供するために必要とされる。このプロトコルは、選択的マーカーの同定に関連する神経免疫学の最新の知見を統合する。また、経験豊富な神経免疫学者とプロジェクトに神経免疫学を統合しようとする研究者の両方のための有用なツールとして機能します。

図1は、蛍光顕微鏡により20x画像化された後方海馬の冠状部におけるIBA1およびTMEM119を用いたミクログリアの共標識を示す。染色が成功すると、微小グリア細胞体とその微細なプロセスが明らかになります(図1A-C)。この染色により、ミクログリア密度の測定とミクログリアクラスターの分布と同定(<strong class="xfig...

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Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

このプロトコルは、ミクログリアを染色し、定量密度と形態解析を行うだけでなく、脳へのマクロファージ浸潤を定量化する方法を示します。この技術により、研究者はミクログリア分布と形態の変化を定量的に測定し、ミクログリアをマクロファージの浸潤から区別することができます この分析プロトコルは、他の動物モデルに簡単に適用して、抗IBA1および抗TMEM119抗体が利用可能な微小グリア分布および形態の変化を測定することができます。実験条件に対して失明した細胞数と痕跡を行い、この手順の実行方法に一貫性を持たせたい。この手順を開始するには、最寄りの近傍距離プラグインがインストールされているフィジーまたは ImageJ などの画像処理プログラムを開きます。スケールがファイルのメタデータに含まれ、メタデータから自動的に設定されていない場合は、20X イメージを開きます。メニューバーで[分析]、[尺度の設定]の順に選択し、正しい情報を入力します。イメージに刻印された縮尺に基づいて手動で尺度を設定するには、[直線] ツールを選択します。スケールの端にカーソルを置き、Shift キーを押しながら、イメージ上のスケールにできるだけ近い線を描画します。[分析]、[尺度の設定] の順に選択します。ウィンドウがポップアップし、ピクセルの長さ単位あたりの距離を決定するために、正しい既知の距離と長さの単位を配置し、[OK]をクリックします。次に、[イメージ]、[色]、[合成を作成] を選択して、すべてのチャネルの合成イメージを作成します。メニュー バーで、[分析]、[測定の設定] の順に選択します。領域、中心心、周囲を確認します。[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、[ファイルを開く] を選択して [OK] をクリックします。[画像]、[色]、[チャンネル ツール] に移動してチャネル ツールを開きます。フリーハンド選択ツールを使用して、対象領域の周囲に大まかな周囲を描画します。ツール バーの [楕円] ツールをダブルクリックして、選択ブラシ ツールを有効にします。[選択ブラシを有効にする]ボックスがオンになっていることを確認し、[OK]をクリックします。選択ブラシを使用して、対象領域に最適に合うように周長を調整し、この領域全体のキーボードの T キーを押して Y マネージャを矢印します。[分析]、[測定]または[M キーを押す]を選択すると、[結果]ウィンドウがポップアップ表示されます。結果をコピーしてデータシートに貼り付け、その領域に関する情報を保存します。対象領域の領域をコピーした後、その情報をクリックして Backspace キーを押すと、[結果] ウィンドウの情報が基になります。ROI マネージャ ウィンドウを選択し、ROI トレースを選択し、[名前の変更] をクリックしてイメージの名前に一致するように名前を変更します。[OK]をクリックし、ROI トレースの新しい名前を右クリックして保存します。ツールバーのブラシツールをダブルクリックします。黒色とブラシサイズを10個選択します。[オーバーレイにペイント]オプションがオフになっていることを確認します。TMEM119チャンネルでは、TMEM119陽性ミクログリアごとに、ソーマの中心に黒い点を慎重に配置します。TMEM119 の場合は、正のセルの中央に白い点を配置します。対象領域に含まれるすべてのセルに対して同じ手順を繰り返します。次に、各チャンネルのウィンドウが表示されます。.ドット注釈を持つチャネルを識別し、他の 2 つのウィンドウを閉じます。新しいスプリットチャンネルイメージをリダイレクトするには、分析、測定の設定に進みます。[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、[チャンネル イメージの分割] を選択し、[OK] をクリックします。次に、[イメージ]、[タイプ]、[8 ビット] の順に選択します。[画像調整] に移動し、[しきい値] を選択します。両バーの左端までスライダーを調整します。これで、白く表示される黒い点のみが残ります。[ROI マネージャ]ウィンドウで、対象地域を選択します。メニューバーで、分析、パーティクルの解析を選択します。[サイズ] のテキスト ボックスに 1 ~ 20 を入力します。ピクセル単位のボックスはオフの状態に保たれますが、[結果の表示]、[集計]、[マネージャーに追加] のチェックボックスをオンにする必要があります。[OK]をクリックすると、ポイント数を示す[概要]ウィンドウが表示されます。この情報をコピーしてデータシートに貼り付けます。次に、プラグイン NND を選択して、NND ウィンドウを表示します。各数値は、各ミクログリアが最も近い微小グリアまでの距離を表します。この情報をすべてコピーして、データシートに貼り付けます。[しきい値] ウィンドウに戻り、上部のスライダーを右に調整すると、すべての白い点が表示され、白く表示されます。[解析]、[パーティクルの解析]を選択して、[パーティクルを解析]ポップアップ ウィンドウを表示します。[OK] をクリックして、ポイント数を示す [概要] ウィンドウを表示します。この情報をコピーしてデータシートに貼り付けます。ROI マネージャに移動し、すべてのポイントを選択します。次に、右クリックして画像の名前を付けて保存します。これにより、ZIP ファイル内のすべてのポイントを保存できます。まず、4DXイメージファイルを開きます。画像をスタックで開くかどうかを尋ねるポップアップウィンドウが表示されます。[OK] をクリックします。次に、[イメージ]、[スタック]、[Z プロジェクト] を選択して、[Z 投影] ウィンドウを開きます。最初から最後のスライスまでのすべてのスライスを含めます。[投影タイプ]で[最大強度]が選択されていることを確認し、[OK]をクリックします。Z プロジェクトを含む新しいウィンドウをクリックします。画像、色、スプリットチャンネルを選択し、IBA1チャンネルの画像にトレースを実行します。メニューバーで、分析、測定の設定を選択します。エリア、中心点、周囲を確認します。[リダイレクト先] ドロップダウン メニューで、開いているファイルを選択し、[OK] をクリックします。イメージに刻印された縮尺に基づいて手動で尺度を設定するには、[直線] ツールを選択します。スケールの端にカーソルを置き、Shift キーを押しながら、イメージ上のスケールにできるだけ近い線を描画します。[分析]、[尺度の設定] の順に選択します。ウィンドウがポップアップします。正しい既知の距離と長さの単位を入力して、長さごとのピクセル単位を決定し、[OK]をクリックします。IBA1チャネルの相馬サイズを測定するには、フリーハンド選択ツールで相馬の大まかな周囲を描きます。ツールバーの [楕円] ツールをダブルクリックして、選択ブラシ ツールを有効にします。[選択ブラシを有効にする]ボックスがオンになっていることを確認し、[OK]をクリックします。選択ブラシを使用して、ソーマに最適なトレースを調整します。ズームインすると、このステップの間に精度が有効になります。次に、T キーを押して、ソーマ トレースを ROI マネージャに追加します。[分析]、[測定]を選択するか、M キーを押して結果を表示します。これらの結果をコピーしてデータシートに貼り付けます。ROI マネージャ ウィンドウに移動し、対象の地域を選択し、[名前の変更] をクリックしてイメージの名前に一致するように名前を変更します。名前を変更したリージョンを右クリックし、[保存]をクリックします。名前が、トレースがソーマ用であることを指定し、ファイルを保存することを確認します。IBA1 チャネルのアーバライゼーション領域を測定するには、まずポリゴン選択ツールを選択します。ツールでマイクログリアプロセスの四肢をクリックしてポリゴンシェイプを開始します。各プロセスの先端をクリックしてミクログリアを回り、マイクログリアの樹状化で覆われた領域を最もよく表すポリゴンを形成します。ポリゴンが完成したら、始点をクリックして閉じます。次に、T キーを押して、トレースを ROI マネージャに追加します。[分析]、[測定]を選択するか、Mキーを押して、データを結果ウィンドウに追加します。このデータをコピーして、データシートに貼り付けます。樹状化領域に関する情報を保存するには、ROI マネージャ ウィンドウに移動し、対象の領域を選択し、名前を変更して、イメージの名前に一致するように変更します。名前を変更したリージョンを右クリックし、[保存]をクリックします。名前で、トレースがアーバーリゼーション用であることを指定し、ファイルを保存してください。本研究では、IBA1とTMEM119の免疫蛍光共染色と、マウス脳組織における微小グリア密度、分布および形態、ならびに末梢骨髄細胞浸潤の分析のためのステップバイステップのワークフローについて説明した。蛍光顕微鏡は、20倍の拡大で側海馬のコロナ部でIBA1とTMEM119を使用してミクログリアの共標識を画像化するために使用されます。成功した染色は、微小グリア細胞体とその微細なプロセスを明らかにします。染色により、ミクログリア密度と分布の決定と、ミクログリアクラスターの同定とマクロファージの浸潤が可能になります。共焦点顕微鏡は、40倍倍の段階的な微小合合部の集水追跡手順を画像化するために使用されます。これらの代表的な結果は、IBA1陽性およびTMEM119陽性ミクログリアならびに細胞体トレースの例を示す。細胞を数えるときに一貫性を持ち、IBA1とTMEM119の両方の信号に注意を払うことが重要です。この技術は、研究者が補完的な技術でより詳細に研究することができる特定の刺激によって影響を受ける脳の領域を識別することができます。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

虚血性マウス脳からの免疫細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

ヒト骨髄性U937細胞におけるフローサイトメトリーによるSAMHD1制限の解析

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...