Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

나탈리 베르누(Nathalie Vernoux)의 지도와 실험에 대한 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 각각 그들의 형광및 공초점 현미경의 사용에 대한 박사 에마누엘 플래넬과 세르지 Rivest에게 감사드립니다. 이 작품은 부분적으로 멕시코 과학 기술 위원회 (CONACYT; F.G.I), 재단 파밀 - 초케트 및 센터 테마티크 드 recherche en 신경 과학 (CTRN; K.P.), 퐁 드 레체체 뒤 퀘벡 - 산테 (M.B.) 장학금에 의해 지원되었다 샤스트리 인도 -캐나다 연구소 (K.B.), 뿐만 아니라 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에서 발견 보조금 (NSERC) M.E.T. M.E.E.E.T.는 건강과 치료에 있는 신경 면역 가소성의 캐나다 연구 의자 (Tier II)를 보유하고 있습니다.

모든 실험 절차는 캐나다 동물 관리 위원회와 라발 대학의 동물 관리 위원회에 따라 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 면역 염색
<ol><li>뇌 지도프로그램의 도움으로 관심 영역(ROI)(즉, 해마)을 포함하는 3개의 마우스 뇌 섹션을 선택합니다. 플라스틱 멀티 웰 플레이트에 섹션을 놓고 인산염 완충 식염수 (PBS)의 350 μL로 덮습니다(표 1). 참?...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

이 프로토콜은 염색 및 분석의 품질이라는 두 가지 중요한 부분으로 나눌 수 있습니다. 염색이 최적이 아닌 경우 미세 교세포를 적절히 나타내지 못하여 밀도, 분포 및 형태 측정에 영향을 미칩니다. 또한, 침윤 말초 골수성 세포의 비율은 과소 평가될 수 있다. 이것은 염색 프로토콜의 최적화된 버전이지만 최적이 아닌 이미지를 초래할 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 동물의 관류가이 프로토?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

급성 또는 만성 여부, 신경 염증은 단단히 microglia에 의해 영향을, 뇌의 상주 대 식 세포. 면역 염색을 통해 미세 글리아를 시각화하는 것은 매우 접근 가능한 기술인 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 신경 염증을 연구하는 데 유용합니다. 동종 조건에서, microglia는 일반적으로 비 오버랩, 모자이크 같은 패턴으로 분포된다. 그들은 때때로 서로 접촉 1, ramified 프로세스1을확장 작은 소마를 전시2. Microglial ramified 프로세스는 동적으로 뇌 의 실조를 조사, 뉴런과 상호 작용, 다른 신경교 세포, 정상적인 생리 적 조건 동안 혈관3. Microglia는 면역 학적 작업을 수행하고 뇌 milieu의 변화, 세포 사멸 또는 조직 손상에 반응 할 수있는 수용체의 무기고를 갖추고 있습니다. 또한, 그들은 시냅스 형성, 유지 보수 및 제거4,5에서특히 주요 생리 기능을 발휘합니다.
마이크로글리아를 연구하는 데 사용되는 마커 들 중, 이온화된 칼슘 결합 어댑터 분자 1(IBA1)은 가장 널리 사용되는 것 중 하나이다. IBA1은 전자 현미경6에의해 확인된 바와 같이 미세 원위 과정을 포함하여 미세 교안 형태학의 뛰어난 시각화를 제공하는 칼슘 결합 단백질입니다. 이 도구는 동물 질병 모델7,8,9의광대 한 배열에서 이전에 "활성화"라고 불리는 미세 교어 변환을 특성화하는 데 중요한 역할을했습니다. 신경 염증의 존재, microglial 응답 포함: 세포 밀도의 증가로 정의 되는 microgliosis, 때로는 클러스터링 귀 착되는 분포의 변화, 세포 신체의 확대, 뿐만 아니라 두껍게 하 고 더 ameboid 모양10,11,12,13와관련된 프로세스의 단축 .
면역 염색은 특정 마커에 대하여 지시된 항체의 가용성에 의해 제한됩니다. 중요한 것은, IBA1은 마이크로글리아에 의해뿐만 아니라 뇌에 침투하는 말초 대식세포에 의해 발현된다14. 뇌 내부의 IBA1 양성 세포의 관찰이 연구 분야에서 마이크로 글리아의 마커가되었지만, 말초 대식세포 침투는 건강한 뇌에서 도 미미하게, 다양한 조건하에서 보고되었습니다15,16 ,17,18. 따라서, IBA1 단독의 사용은 마이크로글리아의 선택적 시각화를 허용하지 않는다. 또한, 대식세포는 일단 뇌에 침투하면 상주 마이크로글리아의 분자 및 형태학적 특징을 채택하여 분화19를방해한다. 이것은 microglia의 기능을 조사하고 대식세포에 침투할 때 도전을 나타냅니다.
미세글리아 및 말초 대식세포는 뚜렷한 기원을 가지고 있지만(예를 들어, 배아 노른자 낭과 골수에서 각각20,21),두 세포 집단이 운동한다는 것을 나타내는 발견의 수가 증가하고 있다. 뇌의 다른 역할19. 따라서 그들의 밀도, 분포, 형태학 및 기능을 조절할 수 있는 침략적인 조작 (즉, 골수 키메라 또는 parabiosis) 없이 이 2개의 인구 사이 구별하는 방법을 사용하는 것이 중요합니다. TMEM119는 건강 및 질병 상태22에걸쳐 마이크로글리아 특이적 마커로 나타났다. IBA1와 결합될 때, 이 마커는 TMEM119 음성 및 IBA1 양성인 대식세포에 침투하는 이 세포를 분화하는 데 유용하게 됩니다. TMEM119는 발달조절이 되는 반면, TMEM119는 출생 후 3일(P3) 및 6(P6)으로 일찍 발성되며, P10과 P1422사이의 성인 수준에 도달할 때까지 꾸준히 증가한다. IBA1은 배아일10.5(E10.5)23일부터발현된다. 제안된 이중 표지 프로토콜은 이렇게 출생 후 생활 내내 이 2개의 인구를 공부하는 것이 유용합니다.
이 프로토콜은 마이크로글리아와 말초 대식세포 사이의 차별을 허용하는 단계별 면역 염색 절차를 제공합니다. 또한 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 정량적 분석뿐만 아니라 말초 대식세포 침투의 분석을 수행하는 방법에 대해서도 설명합니다. microglia 및 말초 대식 세포의 조사는 그 자체로 유용하지만,이 프로토콜은 신경 염증성 조련사를 국소화 할 수 있습니다. 따라서 보완적인(아직 더 많은 시간 및 리소스 소모적인) 기술을 사용하여 조사할 특정 지역을 식별하는 플랫폼의 역할도 합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

이것은 microglia의 이중 시각화및 마우스 뇌 조직에 있는 대식세포 침투를 위한 프로토콜입니다. TMEM119(마이크로글리아를 선택적으로 라벨로 표시함)는 IBA1(형태에 대한 탁월한 시각화를 제공함)과 결합될 때 밀도, 분포 및 형태학의 변화를 조사할 수 있습니다. 이러한 매개 변수를 정량화하는 것은 뇌의 상주 대식세포인 microglia가 가하는 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 중요합니다. 정상적인 생리적 조건하에서, microglia는 모자이크 와 같은 패턴으로 정기적으로 분포하고 난폭한 과정으로 작은 소마를 제시합니다. 그럼에도 불구하고, 환경 적 요인 (즉, 외상, 감염, 질병, 또는 상해)에 대한 반응으로서, 미세 교밀도, 분포 및 형태는 모욕에 따라 다양한 방식으로 변경된다. 추가적으로, 기술된 이중 염색 방법은 TMEM119를 가진 공동 현지화 없이 IBA1의 그들의 표현에 근거를 둔 두뇌에 있는 대식세포 침투의 시각화를 허용합니다. 이 접근은 이렇게 건강과 질병의 각종 맥락에서 두뇌 항상성에 있는 그들의 명백한 관여에 기능적인 통찰력을 제공하기 위하여 요구되는 microglia와 침투대식세포 사이 차별을 허용합니다. 이 프로토콜은 선택적 마커의 식별에 관련된 신경 면역학의 최신 연구 결과를 통합합니다. 그것은 또한 프로젝트에 신경 면역학을 통합 하고자 하는 경험이 풍부한 신경 면역 학자와 연구자 모두에 대 한 유용한 도구 역.

도 1은 형광 현미경으로 20x에서 촬영된 등쪽 해마의 관상 구간에서 IBA1 및 TMEM119를 이용하여 마이크로글리아의 공동 라벨링을 나타낸다. 성공적인 염색은 미세 교세포 체체와 미세 한 과정을 보여줍니다(그림 1A−C). 이러한 염색은 마이크로교졸 밀도및 분포및 마이크로교암군모의 분포 및 식별을 가능하게<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

이 프로토콜은 미세 glia를 염색하는 방법을 보여줍니다, 양적 밀도 및 형태 분석을 수행뿐만 아니라 뇌에 대식세포 침투를 정량화. 이 기술을 통해 연구원은 미생물 분포 및 형태학의 변화를 정량적 방법으로 측정하고 마이크로글리아를 침투하는 대식세포로부터 분화할 수 있으며, 이 분석 프로토콜은 다른 동물 모델에 쉽게 적용되어 항 IBA1 및 항 TMEM119 항체가 제공되는 마이크로글리아 분포 및 형태학의 변화를 측정할 수 있습니다. 실험 조건에 눈이 멀게 된 세포 수와 흔적을 수행하고 이 절차가 수행되는 방식으로 일관성을 가지는 것이 좋습니다.이 절차를 시작하려면 가장 가까운 이웃 거리 플러그인이 설치된 피지 또는 ImageJ와 같은 이미지 처리 프로그램을 엽니 다. 크기조정이 파일의 메타데이터에 포함되어 있고 메타데이터에서 자동으로 설정되지 않으면 20X 이미지를 엽니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 설정 배율 조정을 선택한 다음 올바른 정보를 입력합니다.이미지에 각인된 배율에 따라 수동으로 배율을 설정하려면 직선 도구를 선택합니다. 커서를 축척 가장자리에 놓고 Shift 키를 누르면 이미지의 배율에 가능한 한 가깝게 선을 그립니다. 분석, 설정 배율 선택창이 튀어나와 길이 단위당 픽셀을 결정하고 확인을 클릭하기 위해 정확한 알려진 거리 와 길이 단위를 배치합니다. 다음으로 이미지, 색상, 컴포지트 만들기를 선택하여 모든 채널의 합성 이미지를 만듭니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 측정 설정 을 선택합니다. 영역, 센트로이드 및 둘레를 확인합니다.리디렉션 투 드롭다운 메뉴에서 열기 파일을 선택한 다음 확인을 클릭합니다. 채널 도구를 열려면 이미지, 색상, 채널 도구로 이동합니다. Freehand 선택 도구를 사용하여 관심 지역 주변의 거친 경계를 그립니다. 도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭하여 선택 브러시 도구를 사용할 수 있습니다.선택 지원 브러시 상자가 선택 확인되어 확인을 클릭했는지 확인합니다. 선택 브러시를 사용하여 관심 영역에 가장 잘 맞게 둘레를 조정한 다음 이 영역 전체의 키보드에서 T를 눌러 Y 관리자화살표로 이동합니다. M 키 분석, 측정 또는 누릅니다. 결과를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣고 영역에 대한 정보를 저장합니다.관심 영역영역을 복사한 후 결과 창에서 정보를 클릭하고 백스페이스 키를 눌러 정보를 기반으로 합니다. ROI 관리자 창을 선택하고 ROI 추적을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름과 일치하도록 이름을 변경합니다. 확인을 클릭한 다음 ROI 추적의 새 이름을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 저장합니다.도구 표시줄에서 브러시 도구를 두 번 클릭합니다. 색상 검정색과 브러시 크기가 10을 선택합니다. 오버레이에 페인트 옵션을 선택하지 않았는지 확인합니다.TMEM119 채널에서는 각 TMEM119 포지티브 마이크로글리아에 대해 소마 중앙에 검은 점을 조심스럽게 배치합니다. TMEM119에 대해 긍정적이지 않은 셀의 중앙에 흰색 점을 놓습니다. 관심 영역에 포함된 모든 셀에 대해 동일한 절차를 반복합니다.다음으로 이미지, 색상, 분할 채널을 선택하면 각 채널에 대한 창이 나타납니다. 점 주석이 있는 채널을 식별하고 다른 두 창을 닫습니다. 새 분할 채널 이미지를 리디렉션하려면 측정 을 설정하여 분석으로 이동합니다.리디렉션에서 드롭다운 메뉴에서 분할 채널 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 이미지, 유형, 8비트를 선택합니다. 이미지 조정으로 이동하여 임계값을 선택합니다. 슬라이더를 두 막대의 왼쪽끝까지 조정합니다.이렇게 하면 이제 흰색으로 표시되는 검은 점만 남게 됩니다. ROI 관리자 창에서 관심 영역을 선택합니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 파티클 분석 을 선택합니다.크기에 대한 텍스트 상자에 입력하여 20까지 입력합니다. 픽셀 단위의 상자는 디스플레이 결과, 요약 및 관리자 추가에 대한 상자를 선택해야 하는 동안 선택 되지 않은 상태로 유지 해야 합니다. 확인을 클릭하여 포인트 수를 줄 요약 창을 표시합니다.이 정보를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. 그런 다음 NND 창을 표시하려면 플러그인 NND를 선택합니다. 각 숫자는 각 마이크로글리아가 가장 가까운 이웃 마이크로글리아에 가하는 거리를 나타냅니다.이 모든 정보를 데이터 시트에 복사하여 붙여 넣습니다. 임계값 창으로 돌아가 서 오른쪽끝까지 상단 슬라이더를 조정하면 모든 흰색 점이 표시되고 흰색점이 모두 표시됩니다. 분석, 분석 파티클 분석 을 선택하여 파티클 분석 창이 나타납니다.확인을 클릭하여 점 수를 제공하는 요약 창을 표시합니다. 이 정보를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. ROI 관리자로 이동하여 모든 포인트를 선택합니다.그런 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이미지 이름으로 저장합니다. 이렇게 하면 ZIP 파일의 모든 점을 절약할 수 있습니다. 먼저 4DX 이미지 파일을 엽니다.스택에서 이미지를 열지 묻는 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 다음으로 이미지, 스택, ZProject를 선택하여 Z 프로젝션 창을 엽니다. 첫 번째 슬라이스부터 마지막 슬라이스까지 의 모든 슬라이스를 포함합니다.프로젝션 유형에서 최대 강도가 선택되었는지 확인하고 확인을 클릭합니다. ZProject가 포함된 새 창을 클릭합니다. 이미지, 색상, 분할 채널을 선택하고 IBA1 채널의 이미지에 대한 추적을 수행합니다. 메뉴 표시줄에서 분석, 측정 설정 을 선택합니다.영역, 센트로이드 및 둘레를 확인합니다. 리디렉션에서 드롭다운 메뉴에서 열린 파일을 선택하고 확인을 클릭합니다. 이미지에 각인된 배율에 따라 수동으로 배율을 설정하려면 직선 도구를 선택합니다. 커서를 축척 가장자리에 놓고 Shift 키를 누르면 이미지의 배율에 가능한 한 가깝게 선을 그립니다.분석, 설정 배율 선택 창이 나타납니다. 길이 단위당 픽셀을 결정하고 확인을 클릭하여 올바른 알려진 거리 및 길이 단위를 입력합니다. IBA1 채널에서 소마 크기를 측정하려면 프리핸드 선택 도구를 사용하여 소마의 거친 둘레를 그립니다.도구 모음의 타원형 도구를 두 번 클릭하여 선택 브러시 도구를 활성화합니다. 선택 지원 브러시 상자가 선택 확인되어 확인을 클릭했는지 확인합니다. 선택 브러시를 사용하여 추적을 조정하여 소마에 가장 잘 맞춥습니다. 확대하면 이 단계에서 정밀도가 가능합니다.다음으로 T 키를 눌러 ROI 관리자에 소마 흔적을 추가합니다. 결과를 표시하려면 M 키 분석, 측정 또는 누릅니다. 이러한 결과를 데이터 시트에 복사하여 붙여넣습니다.ROI 관리자 창으로 이동하여 관심 영역을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름에 맞게 이름을 변경합니다. 이름이 변경된 관심 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 저장을 클릭합니다. 이름이 추적이 소마에 대한 것인지 지정하고 파일을 저장해야 합니다.IBA1 채널에서 중단 영역을 측정하려면 먼저 다각형 선택 도구를 선택합니다. 다각형 모양을 시작하는 도구를 사용하여 마이크로글리아 프로세스 극단을 클릭합니다. 각 공정 말단의 끝을 클릭하여 마이크로글리아 를 돌아다니며 미세 글리아 소각으로 덮인 영역을 가장 잘 나타내는 다각형을 형성하십시오.다각형이 완료되면 시작 지점을 클릭하여 닫습니다. 그런 다음 T 키를 눌러 ROI 관리자에 흔적을 추가합니다. M 키 분석, 측정 또는 누릅니다.이 데이터를 복사하여 데이터 시트에 붙여 넣습니다. 중단 영역에 대한 정보를 저장하려면 ROI 관리자 창으로 이동하여 관심 영역을 선택하고 이름 바꾸기를 눌러 이미지 이름에 맞게 이름을 변경합니다. 이름이 변경된 관심 영역을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 저장을 클릭합니다.이름이 추적이 중단을 위한 것인지 지정하고 파일을 저장해야 합니다. 이 연구는 IBA1 및 TMEM119의 면역 형광 공동 염색및 마이크로글리아밀도, 분포 및 형태학뿐만 아니라 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투의 분석을 위한 단계별 워크플로우를 기술했다. 형광 현미경 검사는 20배율에서 등쪽 해마의 관상 섹션에서 IBA1 및 TMEM119를 사용하여 마이크로글리아의 공동 라벨링을 이미지화하는 데 사용됩니다.성공적인 염색은 마이크로글리아 세포 체와 그들의 미세한 과정을 보여줍니다. 염색은 마이크로글리아밀도 및 분포의 측정과 마이크로글리아 클러스터의 식별 및 침투 대식세포에 대한 수 있습니다. 공초점 현미경 검사는 40X 배율에서 단계적 미세glial 석습 추적 절차를 이미지하는 데 사용됩니다.이러한 대표적인 결과는 IBA1 양성 및 TMEM119 양성 마이크로글리아뿐만 아니라 세포 체추적의 예를 보여줍니다. 세포를 계산할 때 일관성을 유지해야 하며 IBA1 과 TMEM119의 두 신호모두에 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구원이 상호 보완적인 기술로 더 깊이 공부할 수 있는 특정 자극에 의해 영향을 받는 두뇌의 지구를 확인하는 것을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

쥐 폐의 기관지 폐포 세척은 염증성 세포의 침윤을 분석하는

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...