Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Vi er takknemlige til Nathalie Vernoux for hennes veiledning og assistanse med eksperimenter. Vi vil også gjerne takke DRS. Emmanuel Planel og Serge Rivest for bruk av deres fluorescens og konfokalmikroskopi mikroskop, henholdsvis. Dette arbeidet ble delvis finansiert av stipend fra Mexican Council of Science and Technology (CONACYT; til F. G. I), Fondation famille-Choquette og Centre thématique de Recherche en Neurosciences (CTRN; til K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (til M.B.), og Shastri Indo-kanadiske Institute (til K.B.), samt en Discovery stipend fra Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC) til M.E.T. M.E.T. har en Canada Research Chair (tier II) av Neuroimmune plastisitet i helse og terapi.

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samråd med retningslinjene for institusjonelle Animal etikk komiteer, i samsvar med den kanadiske Council on Animal Care og Animal Care Committee of Université Laval.
1. Immunostaining
<ol><li>Velg tre mus hjernen deler som inneholder regionen av interesse (ROI) (dvs. hippocampus) ved hjelp av en hjerne Atlas. Plasser delene i en fler brønn plate i plast, og dekk dem med 350 μL av fosfat-bufret saltvann (PBS) (tabell 1). M...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Denne protokollen kan deles i to viktige deler: kvaliteten på farging og analyse. Hvis farging ikke er optimal, vil den ikke representerer mikrogliaaggregater celler tilstrekkelig, og dermed påvirker tettheten, fordelingen, og morfologi målinger. I tillegg kan andelen av infiltrasjon perifere myelogen celler undervurderes. Dette er en optimalisert versjon av farge protokollen, men det er flere faktorer som kan føre til suboptimal bilder. Selv om av dyret ikke er inkludert i denne protokollen, hvis hjernen fiksering e...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Enten akutt eller kronisk, nevroinflammasjon er tett påvirket av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Visualisering mikroglia gjennom immunostaining er verdifullt for studiet av nevroinflammasjon med bruk av lys mikroskopi, en lett tilgjengelig teknikk. I homøostatisk forhold er mikroglia vanligvis fordelt i et nonoverlapping, mosaikk-lignende mønster. De viser små somas som forlenger ramified prosesser1, som noen ganger kontakter hverandre2. Mikrogliaaggregater ramified prosesser dynamisk undersøkelse hjernen parenchyma, i samspill med neurons, andre gliacellene celler, og blodkar under normale fysiologiske forhold3. Mikroglia er utstyrt med et arsenal av reseptorer som tillater dem å utføre immunologiske oppgaver og reagere på endringer i hjernen miljø, til celle død, eller til vevsskade. I tillegg utøver de viktige fysiologiske funksjoner, spesielt i Synaptic formasjon, vedlikehold og eliminering4,5.
Blant de tilgjengelige markører som brukes til å studere mikroglia, ionisert kalsium bindende adapter molekyl 1 (IBA1) er en av de mest brukte. IBA1 er et kalsium bindende protein som gir eksepsjonell visualisering av mikrogliaaggregater morfologi, inkludert fine, klare prosesser, som bekreftet av elektron mikroskopi6. Dette verktøyet har vært medvirkende i karakteriserer mikrogliaaggregater transformasjon, tidligere kalt "aktivisering", i et stort utvalg av dyr sykdom modeller7,8,9. I nærvær av nevroinflammasjon, mikrogliaaggregater respons inkluderer: microgliosis som er definert som en økning i cellulær tetthet, endringer i fordelingen som noen ganger resulterer i klynger, utvidelse av celle kroppen, samt tykkelse og forkortelse av prosesser knyttet til mer ameboid figurer10,11,12,13.
Immunostaining er begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer rettet mot spesifikke markører. Viktigere er IBA1 uttrykt ved mikroglia, men også av perifere makrofager som infiltrere hjernen14. Mens observasjon av IBA1-positive celler inne i hjernen har blitt en markør for mikroglia i denne forskningen feltet, perifere macrophage infiltrasjon har blitt rapportert under ulike forhold, selv marginalt i sunn hjernen15,16 ,17,18. Følgelig, bruk av IBA1 alene tillater ikke selektiv visualisering av mikroglia. I tillegg har makrofager vedta molekylære og morfologiske funksjoner av fastboende mikroglia når de har infiltrere hjernen, og dermed hindre differensiering19. Dette representerer en utfordring når man undersøker funksjonen til både mikroglia og infiltrere makrofager.
Mens mikroglia og perifere makrofager har distinkt opprinnelse (f. eks, fra embryonale eggeplomme og benmarg, henholdsvis20,21), det er et økende antall funn som indikerer at de to celle populasjoner utøve ulike roller i hjernen19. Det er derfor avgjørende å bruke metoder som diskriminerer mellom disse to populasjoner uten invasiv manipulasjoner (dvs. benmarg chimeras eller parabiose) som kan modulere deres tetthet, distribusjon, morfologi og funksjon. TMEM119 har dukket opp som en mikroglia-spesifikk markør på tvers av helse og sykdom forhold22. Når det kombineres med IBA1, blir denne markøren nyttig for å skille disse cellene fra infiltrere makrofager, som er TMEM119-negative og IBA1-positive. Mens det er developmentally regulert, er TMEM119 uttrykt så tidlig som postnatal dager 3 (P3) og 6 (P6), stadig økende til de når voksen nivåer mellom P10 og P1422. IBA1 uttrykkes så tidlig som embryonale dagen 10,5 (E 10.5)23. Den foreslåtte dobbel merking protokollen er derfor nyttig å studere disse to populasjoner gjennom postnatal livet.
Denne protokollen gir en trinnvis immunostaining prosedyre som tillater diskriminering mellom mikroglia og perifere makrofager. Det forklarer også hvordan å gjennomføre en kvantitativ analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt analyse av perifere macrophage infiltrasjon. Mens etterforskningen av mikroglia og perifere makrofager er nyttig på egen hånd, tillater denne protokollen videre lokalisering av neuroinflammatory Foyers; dermed fungerer det også som en plattform for å identifisere bestemte regioner for å undersøke, med bruk av komplementære (ennå, mer tid-og ressurskrevende) teknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Dette er en protokoll for den doble visualisering av mikroglia og infiltrere makrofager i mus hjernevev. TMEM119 (som etiketter mikroglia selektivt), kombinert med IBA1 (som gir en eksepsjonell visualisering av morfologi deres), tillater gransking av endringer i tetthet, distribusjon og morfologi. Kvantifisere disse parametrene er viktig for å gi innsikt i de rollene som utøves av mikroglia, bosatt makrofager av hjernen. Under normale fysiologiske forhold, mikroglia er regelmessig fordelt i en mosaikk-lignende mønster og presentere et lite Soma med ramified prosesser. Likevel, som et svar på miljømessige faktorer (dvs. traumer, infeksjon, sykdom, eller skade), mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi er endret i ulike manerer, avhengig av fornærmelse. I tillegg tillater den beskrevne dobbel farge metoden visualisering av infiltrere makrofager i hjernen basert på deres uttrykk for IBA1 og uten colocalization med TMEM119. Denne tilnærmingen tillater dermed diskriminering mellom mikroglia og infiltrere makrofager, som er nødvendig for å gi funksjonell innsikt i deres distinkte engasjement i hjernens homeostase på tvers av ulike kontekster av helse og sykdom. Denne protokollen integrerer de siste funnene i neuroimmunology som gjelder for identifisering av selektive markører. Det fungerer også som et nyttig verktøy for både erfarne neuroimmunologists og forskere som ønsker å integrere neuroimmunology i prosjekter.

Figur 1 viser co-merking av MIKROGLIA bruker IBA1 og TMEM119 i en koronale delen av rygg hippocampus avbildet på 20x av fluorescens mikroskopi. En vellykket farging avslører mikrogliaaggregater celle organer og deres fine prosesser (figur 1A − C). Denne farging tillater bestemmelse av mikrogliaaggregater tetthet og distribusjon og identifisering av mikrogliaaggregater klynger (figur 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Denne protokollen beskriver en trinnvis arbeidsflyt for immunofluorescent costaining av IBA1 og TMEM119, i tillegg til analyse av mikrogliaaggregater tetthet, distribusjon og morfologi, samt perifere myelogen celle infiltrasjon i mus hjernevev.

Immunofluorescence farging bruke IBA1 og TMEM119 for Mikrogliaaggregater Density, morfologi og perifere myelogen Cell infiltrasjon analyse i Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Denne protokollen vil vise deg hvordan du flekker microglia, utføre kvantitativ tetthet og morfologi analyse samt å kvantifisere makrofag infiltrasjon i hjernen. Denne teknikken gjør det mulig for forskeren å måle endringer i mikrogliafordeling og morfologi på en kvantitativ måte, og å skille mikroglia fra infiltrerende makrofager Denne analyseprotokollen kan enkelt brukes på andre dyremodeller for å måle endringer i mikroglial distribusjon og morfologi der anti-IBA1 og anti-TMEM119 antistoffer er tilgjengelige. Det anbefales sterkt å gjennomføre celletellinger og spor blindet til eksperimentell tilstand og å være konsekvent i måten denne prosedyren utføres på.For å starte denne prosedyren, åpne et bildebehandlingsprogram som Fiji eller ImageJ som har nærmeste nabo avstand plug-in installert. Åpne 20X-bildet hvis skalaen finnes i metadataene til filen og ikke angis automatisk fra metadataene. Velg Analyser, Angi skala på menylinjen, og angi deretter riktig informasjon.Hvis du vil angi skalaen manuelt basert på en skala som er trykt på bildet, velger du rett linje-verktøyet. Plasser markøren på kanten av skalaen, og mens du trykker skifttasten, tegner du en linje så nær skalaen på bildet som mulig. Velg Analyser, Angi skala.Et vindu vil dukke opp og sette riktig kjent avstand og enhet av lengde for å bestemme pikselen per lengde enhet og klikk OK. Deretter velger du Bilde, Farge, Lag kompositt for å opprette et sammensatt bilde av alle kanaler. Velg Analyser, Angi målinger på menylinjen. Sjekk området, Centroid og Perimeter.Velg Åpne fil på rullegardinmenyen Omadresser til, og klikk deretter OK. Gå til Bilde, Farge, Kanalverktøy for å åpne kanalverktøyet. Bruk frihåndsvalgverktøyet til å tegne en grov omkrets rundt interesseområdet. Dobbeltklikk på det ovale verktøyet på verktøylinjen for å aktivere markeringsverktøyet for pensel.Kontroller at det er merket av for Aktiver utvalgspensel, og klikk OK. Bruk markeringsbørsten til å justere omkretsen slik at den passer best til interesseområdet, og trykk deretter T på tastaturet i hele dette området til pil Y-lederen. Velg Analyser, Mål eller Trykk på M-tasten, så vises Resultat-vinduet. Kopier og lim inn resultatene i et dataark, og lagre informasjonen om området.Når du har kopiert området i interesseområdet, baserer du informasjonen fra Resultater-vinduet ved å klikke på den og trykke Tilbake-tasten. Velg ROI Manager-vinduet, velg ROI Trace og endre navnet slik at det samsvarer med bildets navn ved å trykke Gi nytt navn. Klikk OK, høyreklikk deretter det nye navnet på ROI Trace og lagre.Dobbeltklikk penselverktøyet på verktøylinjen. Velg fargen svart og penselstørrelsen på 10. Kontroller at det ikke er merket av for Alternativet Paint på overlegg.I TMEM119-kanalen plasserer du forsiktig en svart prikk i midten av soma for hver TMEM119 positiv mikroglia. Plasser en hvit prikk midt i cellene som ikke er positive for TMEM119. Gjenta den samme fremgangsmåten for alle celler i interesseområdet.Deretter velger du Bilde, Farge, Del kanal, et vindu for hver kanal vises. Identifiser kanalen som har punktmerknadene, og lukk de to andre vinduene. Hvis du vil omdirigere det nye bildet for delt kanal, går du til Analyser, Angi målinger.Velg Del kanalbilde i rullegardinmenyen Omdiriger for å gå om, og klikk ok. Velg deretter Bilde, Type, åtte-biters. Gå til Bildejustering, og velg Terskel. Juster glidebryterne helt til venstre i begge stolpene.Dette vil etterlate bare de svarte prikkene som nå vil vises hvite. Velg interesseområdet i ROI Manager-vinduet. Velg Analyser, Analyser partikkel på menylinjen.Skriv inn én til 20 i tekstboksen for Størrelse. Boksen for Pixel-enheter skal være ukontrollert mens boksen som er for Visningsresultater, Summer og Legg til i Manager bør være merket. Klikk OK for å vise Sammendrag-vinduet som vil gi antall poeng.Kopier og lim inn denne informasjonen i dataarket. Velg deretter plugin-moduler NND for å vise NND-vinduet. Hvert tall representerer avstanden hver microglia har til nærmeste nærliggende microglia.Kopier og lim inn all denne informasjonen i dataarket. Gå tilbake til Terskel-vinduet og juster den øverste glidebryteren helt til høyre, noe som gjør alle de hvite prikkene synlige, og som nå vises hvite. Velg Analyser, analyser partikkel for å vise popup-vinduet Analyser partikler.Klikk OK for å vise Sammendrag-vinduet som inneholder antall poeng. Kopier og lim inn denne informasjonen i dataarket. Gå til ROI Manager, og velg alle punktene.Høyreklikk deretter og Lagre med bildets navn. Dette vil tillate lagring av alle punktene i en ZIP-fil. Først åpner du 4DX-bildefilene.Et popup-vindu vises og spør om bildene skal åpnes i en stabel. Klikk OK. Deretter velger du Bilde, Stabler, ZProject for å åpne Z Projeksjon-vinduet. Inkluder alle skiver fra første til siste skive.Kontroller at maksintensitet er valgt under Projeksjonstype, og klikk OK. Klikk på det nye vinduet som inneholder ZProject. Velg Bilde, Farger, Del kanaler og utuk sporene på bildene av IBA1-kanalen. Velg Analyser, Angi målinger på menylinjen.Sjekk området, Centroid og Perimeter. Velg den åpne filen i rullegardinmenyen Omadresser til, og klikk OK. Hvis du vil angi skalaen manuelt basert på en skala som er trykt på bildet, velger du rett linje-verktøyet. Plasser markøren på kanten av skalaen, og mens du trykker skifttasten, tegner du en linje så nær skalaen på bildet som mulig.Velg Analyser, Angi skala. Et vindu vil dukke opp. Skriv inn riktig kjent avstand og lengdeenhet for å bestemme piksler per lengde-enhet, og klikk OK. For å måle soma-størrelsen i IBA1-kanalen, tegn en grov omkrets av soma med Freehand Selection-verktøyet.Dobbeltklikk på det ovale verktøyet på verktøylinjen for å aktivere markeringspenselverktøyet. Kontroller at det er merket av for Aktiver utvalgspensel, og klikk OK. Juster sporet slik at den passer best til soma. Zooming inn vil muliggjøre presisjon i løpet av dette trinnet.Deretter trykker du på T-tasten for å legge til soma-sporet i ROI Manager. Velg Analyser, mål eller trykk M-tasten for å vise resultatene. Kopier og lim inn disse resultatene i et dataark.Gå til ROI Manager-vinduet, velg interesseområdet og endre navnet slik at det samsvarer med bildets navn ved å trykke Gi nytt navn. Høyreklikk på det nye interesseområdet og klikk Lagre. Kontroller at navnet angir at sporingen er for soma, og lagre filen.Hvis du vil måle arboriseringsområdet i IBA1-kanalen, velger du først polygonvalgverktøyet. Klikk på mikroglial prosess ekstremitet med verktøyet for å starte polygonformen. Gå rundt microglia ved å klikke på tuppen av hver prosess ekstremitet for å danne en polygon som best representerer området dekket av mikroglial arborizations.Når polygonet er fullført, klikker du på utgangspunktet for å lukke den. Trykk deretter T-tasten for å legge til sporingen i ROI Manager. Velg Analyser, mål eller trykk M-tasten for å legge til dataene i Resultater-vinduet.Kopier og lim inn disse dataene i dataarket. Hvis du vil lagre informasjonen om arboriseringsområdet, går du til ROI Manager-vinduet, velger interesseområdet og endrer navnet slik at det samsvarer med bildets navn ved å trykke Gi nytt navn. Høyreklikk på det nye interesseområdet og klikk Lagre.Kontroller at navnet angir at sporingen er for arborisering og lagre filen. Denne studien beskrev den trinnvise arbeidsflyten for immunofluorescent co-farging av IBA1 og TMEM119 og for analyse av mikroglial tetthet, distribusjon og morfologi samt perifer myeloid celle infiltrasjon i mus hjernevev. Fluorescensmikroskopi brukes til å avbilde samtidig merking av microglia ved hjelp av IBA1 og TMEM119 i koronardelen av den dorsale hippocampus ved 20X forstørrelse.En vellykket farging avslører mikrogliale cellelegemer og deres fine prosesser. Fargingen gjør det mulig å bestemme mikroglial tetthet og distribusjon og for identifisering av mikrogliale klynger og infiltrerende makrofager. Konfokal mikroskopi brukes til å bilde den trinnvise mikrogliale arboriseringssporingsprosedyren ved 40X forstørrelse.Disse representative resultatene viser IBA1 positive og TMEM119 positiv microglia samt et eksempel på celle kroppssporing. Det er viktig å være konsekvent når du teller celler og å ta hensyn til begge signalene fra IBA1 og TMEM119. Denne teknikken gjør det mulig for forskeren å identifisere områder av hjernen som påvirkes av en bestemt stimulans som deretter kan studeres mer dyptgående med komplementære teknikker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloid dendrittiske celler og Epitelceller fra Menneskelig Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdere Netthinne microglial fagocyttfunksjon<em&gt; I Vivo</em&gt; Ved hjelp av en flowcytometrisystemer basert analyse

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage av Murine Lunger å analysere inflammatorisk celleinfiltrasjon

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolasjon, fiksering og Immunofluorescence avbildning av musen binyrene

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analyse av SAMHD1-restriksjon ved flowcytometri i humane myeloide U937-celler

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Separasjon av immuncellepopulasjoner i perifere blodprøver fra barn med infeksiøs mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...