Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
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Somos gratos a Nathalie Vernoux por sua orientação e assistência com os experimentos. Gostaríamos também de agradecer aos Drs. Emmanuel Planel e Serge Rivest pelo uso de sua fluorescência e microscópios confocais, respectivamente. Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de estudo do Conselho Mexicano de Ciência e Tecnologia (CONACYT; a F.G.I), Fondation Famille-Choquette e Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (a M.B.), e Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), bem como uma concessão discovery do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) para M.E.T. M.E.T. detém uma cadeira de pesquisa do Canadá (Nível II) de Plasticidade Neuroimune em Saúde e Terapia.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos comitês institucionais de Ética Animal, em conformidade com o Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e o Comitê de Cuidados Com Animais da Université Laval.
1. Imunomanchas
<ol><li>Selecione três seções cerebrais de camundongos contendo a região de interesse (ROI) (ou seja, o hipocampo) com a ajuda de um atlas cerebral. Coloque as seções em uma placa de plástico multi-poço e cubra-os com 350...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Este protocolo pode ser dividido em duas partes críticas: qualidade da coloração e análise. Se a coloração não for ideal, ela não representará adequadamente as células microgliais, afetando assim as medições de densidade, distribuição e morfologia. Além disso, a proporção de células mieloides periféricas de infiltração pode ser subestimada. Esta é uma versão otimizada do protocolo de coloração, mas existem vários fatores que podem resultar em imagens abaixo do ideal. Mesmo que a perfusão do ani...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Se aguda ou crônica, neuroinflamação é fortemente influenciada pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Visualizar a microglia através da imunocoloração é valioso para o estudo da neuroinflamação com o uso de microscopia de luz, uma técnica altamente acessível. Em condições homeostáticas, a microglia é normalmente distribuída em um padrão não sobreposto, semelhante a um mosaico. Eles exibem pequenas somas que estendem os processos ramificados1, que às vezes entram em contato uns com os outros2. Os processos microgliais ramified examinam dinamicamente o parenchyma do cérebro, interagindo com os neurônios, outras pilhas gliais, e vasos sanguíneos durante circunstâncias physiological normais3. Microglia são equipados com um arsenal de receptores que lhes permitem realizar tarefas imunológicas e responder a mudanças no meio do cérebro, a morte celular, ou a danos nos tecidos. Além disso, eles exercem funções fisiológicas fundamentais, nomeadamente na formação sináptica, manutenção e eliminação4,5.
Entre os marcadores disponíveis usados para estudar a microglia, a molécula de adaptação de ligação ionizada de cálcio 1 (IBA1) é uma das mais utilizadas. Iba1 é uma proteína de ligação ao cálcio que fornece visualização excepcional da morfologia microglial, incluindo processos distais finos, como confirmado pela microscopia eletrônica6. Esta ferramenta tem sido fundamental na caracterização da transformação microglial, anteriormente chamada de "ativação", em uma vasta gama de modelos de doenças animais7,8,9. Na presença de neuroinflamação, a resposta microglial inclui: microgliosis que é definido como um aumento na densidade celular, alterações na distribuição que às vezes resultam em agrupamento, ampliação do corpo celular, bem como espessamento e espessamento e encurtamento dos processos associados com formas mais ameboid10,11,12,13.
A imunomancha é limitada pela disponibilidade de anticorpos direcionados contra marcadores específicos. Importante, IBA1 é expressa por microglia, mas também por macrófagos periféricos que se infiltram no cérebro14. Enquanto a observação de células IBA1-positivas dentro do cérebro tornou-se um marcador de microglia neste campo de pesquisa, infiltração de macrófagos periféricos tem sido relatada várias condições, mesmo marginalmente no cérebro saudável15,16 17,18. Consequentemente, o uso do IBA1 por si só não permite a visualização seletiva da microglia. Além disso, macrófagos adotar características moleculares e morfológicas da microglia residente, uma vez que se infiltraram no cérebro, impedindo assim a diferenciação19. Isso representa um desafio ao investigar a função da microglia e infiltrar macrófagos.
Enquanto microglia e macrófagos periféricos têm origens distintas (por exemplo, a partir do saco de gema embrionária e medula óssea, respectivamente20,21), há um número crescente de achados indicando que as duas populações celulares exercem diferentes papéis no cérebro19. Assim, é crucial o uso de métodos que discriminem entre essas duas populações sem manipulações invasivas (ou seja, quimeras de medula óssea ou parabiose) que possam modular sua densidade, distribuição, morfologia e função. TMEM119 emergiu como um marcador específico da microglia em condições de saúde e doença22. Quando combinado com iba1, este marcador torna-se útil para diferenciar essas células de infiltrar macrófagos, que são TMEM119-negativo e IBA1-positivo. Embora seja regulada de desenvolvimento, o TMEM119 é expresso tão cedo quanto os dias pós-natais 3 (P3) e 6 (P6), aumentando constantemente até atingir os níveis adultos entre P10 e P1422. Iba1 é expresso tão cedo quanto o dia embrionário 10.5 (E10.5)23. O protocolo de rotulagem dupla proposto é, portanto, útil para estudar essas duas populações ao longo da vida pós-parto.
Este protocolo fornece um procedimento de imunocoloração passo a passo que permite a discriminação entre microglia e macrófagos periféricos. Também explica como realizar uma análise quantitativa da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como a análise da infiltração periférica de macrófagos. Embora a investigação de microglia e macrófagos periféricos seja útil por si só, este protocolo permite ainda a localização de foyers neuroinflamatórios; assim, também serve como uma plataforma para identificar regiões específicas para investigar, com o uso de técnicas complementares (ainda, mais demoradas e consumidoras de recursos).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Este é um protocolo para a visualização dupla de microglia e infiltração de macrófagos no tecido cerebral do rato. TMEM119 (que rotula microglia seletivamente), quando combinado com IBA1 (que fornece uma visualização excepcional de sua morfologia), permite a investigação de mudanças na densidade, distribuição e morfologia. Quantificar esses parâmetros é importante para fornecer insights sobre os papéis exercidos pela microglia, os macrófagos residentes do cérebro. Em condições fisiológicas normais, a microglia é regularmente distribuída em um padrão semelhante ao mosaico e apresenta uma pequena soma com processos ramificados. No entanto, como resposta a fatores ambientais (ou seja, trauma, infecção, doença ou lesão), densidade microglial, distribuição e morfologia são alterados de várias maneiras, dependendo do insulto. Além disso, o método de coloração dupla descrito permite a visualização de macrófagos infiltrados no cérebro com base em sua expressão de IBA1 e sem colocalização com TMEM119. Esta abordagem permite assim a discriminação entre microglia e macrófagos infiltrados, que é necessário para fornecer insights funcionais sobre o seu envolvimento distinto na homeostase cerebral em vários contextos de saúde e doença. Este protocolo integra os resultados os mais atrasados na neuroimunologia que pertence à identificação de marcadores seletivos. Ele também serve como uma ferramenta útil para neuroimunologistas experientes e pesquisadores que procuram integrar a neuroimunologia em projetos.

A figura 1 mostra a co-rotulagem da microglia usando IBA1 e TMEM119 em uma seção coronal do hipocampo dorsal imaged em 20x pela microscopia da fluorescência. Uma coloração bem sucedida revela corpos de células microgliais e seus processos finos (Figura 1A-C). Esta coloração permite a determinação da densidade microglial e distribuição e identificação de aglomerados microgliais(F...

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Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a costainização imunofluorescente de IBA1 e TMEM119, além da análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como infiltração periférica de células mieloides no tecido cerebral do rato.

Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Este protocolo mostrará como manchar microglia, realizar análises quantitativas de densidade e morfologia, bem como quantificar a infiltração de macrófagos no cérebro. Esta técnica permite ao pesquisador medir mudanças na distribuição e morfologia de microglia de forma quantitativa e diferenciar microglia de macrófagos infiltrados Este protocolo de análise pode ser facilmente aplicado a outros modelos animais para medir mudanças na distribuição e morfologia microglial onde anticorpos anti-IBA1 e anti-TMEM119 estão disponíveis. É altamente recomendável realizar a contagem celular e traços cegos à condição experimental e ser consistente na forma como este procedimento é realizado.Para iniciar este procedimento, abra um programa de processamento de imagens como Fiji ou ImageJ que tenha o plug-in de distância do vizinho mais próximo instalado. Abra a imagem 20X se a escala estiver contida nos metadados do arquivo e não definir automaticamente a partir dos metadados. Na barra de menu, selecione Analisar, Definir escala e digite as informações corretas.Para definir a escala manualmente com base em uma escala impressa na imagem, selecione a ferramenta Linha Reta. Coloque o cursor na borda da escala e pressionando a tecla Shift, desenhe uma linha o mais perto possível da escala na imagem. Selecione Analisar, definir escala.Uma janela aparecerá e colocará a distância e a unidade de comprimento corretas conhecidas para determinar a unidade por comprimento do pixel e clicar em OK. Em seguida, selecione Imagem, Cor, Faça Composto para criar uma imagem composta de todos os canais. Na barra de menu, selecione Analisar, Definir Medidas. Área de Verificação, Centroid e Perímetro.No menu Redirecionar Para dropdown, selecione o arquivo Abrir e clique em OK. Vá para Imagem, Cor, Ferramenta de Canal para abrir a ferramenta Canal. Use a ferramenta Seleção à Mão Livre para desenhar um perímetro áspero em torno da região de interesse. Clique duas vezes na ferramenta Oval na barra de ferramentas para habilitar a ferramenta 'Pincel de seleção'.Certifique-se de que a caixa 'Habilitar pincel' está verificada e clique em OK. Usando o pincel de seleção, ajuste o perímetro para melhor se encaixar na região de interesse, em seguida, pressione T no teclado por toda esta área para seta Y manager. Selecione Analisar, Medir ou Pressionar a tecla M e a janela Resultados aparecerá. Copie e cole os resultados em uma folha de dados e salve as informações sobre a área.Depois de copiar a área da região de interesse, você baseia as informações da janela Resultados clicando nela e pressionando a tecla Backspace. Selecione a janela ROI Manager, selecione o ROI Trace e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique em OK e clique com o botão direito do mouse no novo nome do ROI Trace e salve.Clique duas vezes na ferramenta Pincel na barra de ferramentas. Selecione a cor preta e o tamanho do pincel de 10. Certifique-se de que a opção Pintura na sobreposição não está controlada.No canal TMEM119, coloque cuidadosamente um ponto preto no centro da soma para cada microglia positiva TMEM119. Coloque um ponto branco no centro das células que não são positivas para TMEM119. Repita o mesmo procedimento para todas as células contidas na região de interesse.Em seguida, selecione Imagem, Cor, Canal Dividido, uma janela para cada canal será exibida. Identifique o canal que tem anotações de ponto e feche as outras duas janelas. Para redirecionar a nova imagem do canal dividido, vá para Analisar, definir medidas.No menu Redirecionar Para soltar, selecione a Imagem do Canal Dividido e clique em OK. Em seguida, selecione Imagem, Tipo, oito bits. Vá para Ajustar a imagem e selecione Limiar. Ajuste os controles deslizantes até a esquerda em ambas as barras.Isso deixará apenas os pontos pretos que agora vão parecer brancos. Selecione a região de interesse na janela ROI Manager. Na barra Menu, selecione Analisar, Analisar partículas.Na caixa de texto para Tamanho, entrada de um a 20. A caixa para unidades Pixel deve permanecer desmarcada enquanto a caixa que é para os resultados de Exibição, Resumo e Adicionar ao Gerente deve ser verificada. Clique em OK para exibir a janela Resumo que dará o número de pontos.Copie e cole essas informações na ficha técnica. Em seguida, selecione plug-ins NND para mostrar a janela NND. Cada número representa a distância que cada microglia tem à microglia vizinha mais próxima.Copie e cole todas essas informações na ficha técnica. Volte para a janela Limiar e ajuste o controle deslizante superior todo o caminho para a direita, o que deixará todos os pontos brancos visíveis, agora aparecendo branco. Selecione Analisar, analisar partículas para exibir a janela Analisar partículas.Clique em OK para mostrar a janela Resumo que fornece o número de pontos. Copie e cole essas informações na ficha técnica. Vá até o GERENCIADOr de ROI e selecione todos os pontos.Em seguida, clique com o botão direito do mouse e Salve com o nome da imagem. Isso permitirá a salvação de todos os pontos em um arquivo ZIP. Primeiro, abra os arquivos de imagem 4DX.Uma janela pop-up aparecerá perguntando se as imagens devem ser abertas em uma pilha. Clique em OK. Em seguida, selecione Imagem, Pilhas, ZProject para abrir a janela de Projeção Z. Inclua todas as fatias da primeira até a última fatia.Certifique-se de que a Intensidade Máxima está selecionada em Tipo de Projeção e clique em OK. Clique na nova janela que contém o ZProject. Selecione Imagem, Cores, Canais Divididos e realize os traços nas imagens do canal IBA1. Na barra Menu, selecione Analisar, Definir Medidas.Verifique a Área, Centroid e Perímetro. No menu Redirecionar Para soltar, selecione o arquivo aberto e clique em OK. Para definir a escala manualmente com base em uma escala impressa na imagem, selecione a ferramenta Linha Reta. Coloque o cursor na borda da escala e pressionando a tecla Shift, desenhe uma linha o mais perto possível da escala na imagem.Selecione Analisar, definir escala. Uma janela vai aparecer. Insira a distância e a unidade de comprimento conhecidas corretas para determinar os Pixels por unidade de comprimento e clique em OK. Para medir o tamanho da soma no canal IBA1, desenhe um perímetro áspero da soma com a ferramenta Seleção à Mão Livre.Clique duas vezes na ferramenta Oval na barra de ferramentas para habilitar a ferramenta Pincel de Seleção. Certifique-se de que a caixa 'Habilitar pincel' está verificada e clique em OK. Usando o pincel de seleção, ajuste o traço para melhor se encaixar na soma. O zoom permitirá a precisão durante esta etapa.Em seguida, pressione a tecla T para adicionar o traço soma ao ROI Manager. Selecione Analisar, Medir ou pressione a tecla M para exibir os resultados. Copie e cole esses resultados em uma folha de dados.Vá para a janela ROI Manager, selecione a região de interesse e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique com o botão direito do mouse na região renomeada de interesse e clique em Salvar. Certifique-se de que o nome especifica que o rastreamento é para soma e salvar o arquivo.Para medir a área de arborização no canal IBA1, selecione primeiro a ferramenta Seleção de Polígono. Clique na extremidade do processo microglial com a ferramenta para iniciar a forma do polígono. Vá ao redor da microglia clicando nas pontas de cada extremidade do processo para formar um polígono que melhor representa a área coberta pelas arborizações microgliais.Quando o polígono estiver completo, clique no ponto de partida para fechá-lo. Em seguida, pressione a tecla T para adicionar o rastreamento ao ROI Manager. Selecione Analisar, Medir ou pressione a tecla M para adicionar os dados à janela Resultados.Copie e cole esses dados na ficha técnica. Para salvar as informações relativas à área de arborização, acesse a janela ROI Manager, selecione a região de interesse e altere o nome para corresponder ao nome da imagem pressionando Rename. Clique com o botão direito do mouse na região renomeada de interesse e clique em Salvar.Certifique-se de que o nome especifica que o rastreamento é para arborização e salve o arquivo. Este estudo descreveu o fluxo de trabalho passo a passo para a co-coloração imunofluorescente de IBA1 e TMEM119 e para a análise da densidade microglial, distribuição e morfologia, bem como de infiltração de células mieloides periféricas no tecido cerebral do camundongo. A microscopia de fluorescência é usada para imagem da co-rotulagem de microglia usando IBA1 e TMEM119 na seção coronal do hipocampo dorsal na ampliação de 20X.Uma coloração bem sucedida revela corpos de células microgliais e seus belos processos. A coloração permite a determinação da densidade e distribuição de microgliais e para a identificação de aglomerados microgliais e macrófagos infiltrados. A microscopia confocal é usada para imaginar o procedimento de rastreamento de arborização microglial stepwise na ampliação de 40X.Esses resultados representativos mostram a microglia positiva IBA1 e TMEM119, bem como um exemplo de rastreamento corporal celular. É importante ser consistente na contagem de células e prestar atenção aos dois sinais de IBA1 e TMEM119. Essa técnica permite ao pesquisador identificar regiões do cérebro afetadas por um estímulo particular que pode então ser estudado mais aprofundado com técnicas complementares.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Imunologia e Infecção

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavagem Broncoalveolar de Pulmões Murinos para Analisar a Infiltração de Células Inflamatórias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Análise da Restrição de SAMHD1 por Citometria de Fluxo em Células U937 Mieloides Humanas

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...