Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Мы благодарны Натали Верно за ее руководство и помощь в проведении экспериментов. Мы также хотели бы поблагодарить д-р Эммануэль Планель и Серж Ривест за использование их флуоресценции и конфокальных микроскопов, соответственно. Эта работа частично финансировалась за счет стипендий От Мексиканского совета по науке и технике (CONACYT; F.G.I), Фонда Фамиль-Чокетт и Центра тематика де речерче-н-р неврологии (CTRN; к К.П.), Фонды де Рехерче дю Квебек - Санте (до М.Б.), и Шастри Индо-канадский институт (к KB), а также Грант Discovery от естественных наук и инженерных исследований Совета Канады (NSERC) в M.E.T. M.E.T. имеет канадский научно-исследовательский кафедры (Tier II) нейроиммунной пластичности в области здравоохранения и терапии.

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами институциональных комитетов по этике животных в соответствии с Канадским советом по уходу за животными и Комитетом по уходу за животными Университета Лаваля.
1. Иммуностоидинг
<ol><...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Этот протокол можно разделить на две критические части: качество окрашивания и анализа. Если окрашивание не является оптимальным, оно не сможет представлять микроглиальные клетки адекватно, тем самым влияя на плотность, распределение и измерения морфологии. Кроме того, доля инфильтра?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Будь то острое или хроническое, нейровоспаление находится под сильным влиянием микроглии, резидентов макрофагов мозга. Визуализация микроглии с помощью иммуностоинга ценна для изучения нейровоспаления с использованием световой микроскопии, высокодоступной техники. В гомеостастатных условиях, микроглии, как правило, распространяются в nonoverlapping, мозаика, как картина. Они проявляют небольшие сомы, которые расширяют неразрешимые процессы1, которые иногда контактируют друг с другом2. Микроглиальные неразрежденные процессы динамически обследуют паренхиму головного мозга, взаимодействуя с нейронами, другими глиальными клетками и кровеносными сосудами при нормальных физиологических условиях3. Микроглия оснащена арсеналом рецепторов, которые позволяют им выполнять иммунологические задачи и реагировать на изменения в среде мозга, на гибель клеток или на повреждение тканей. Кроме того, они оказывают ключевые физиологические функции, в частности, в синаптической формирования, технического обслуживания и ликвидации4,5.
Среди доступных маркеров, используемых для изучения микроглии, ионизированная молекула адаптера связывания кальция 1 (IBA1) является одним из наиболее широко используемых. IBA1 является кальциевым связывающим белком, который обеспечивает исключительную визуализацию микроглиальной морфологии, включая тонкие дистальные процессы, что подтверждается электронной микроскопией6. Этот инструмент сыграл важную роль в характеристике микроглиальной трансформации, ранее называемой "активацией", в широком спектре моделей болезней животных7,8,9. При наличии нейровоспаления микроглиальный ответ включает в себя: микроглиоз, который определяется как увеличение плотности клеток, изменения в распределении, которые иногда приводят к кластеризации, увеличению тела клетки, а также утолщение и сокращение процессов, связанных с более амибойдформы10,11,12,13.
Иммуностогирование ограничено наличием антител, направленных против конкретных маркеров. Важно отметить, что IBA1 выражается в микроглии, но и периферических макрофагов, которые проникают в мозг14. В то время как наблюдение IBA1-положительных клеток внутри мозга стало маркером микроглии в этой области исследований, периферийные инфильтрации макрофагов было сообщено в различных условиях, даже незначительно в здоровом мозге15,16 ,17,18. Следовательно, использование IBA1 само по себе не позволяет селективной визуализации микроглии. Кроме того, макрофаги принимают молекулярно-морфологические особенности резидентов микроглии, как только они проникли в мозг, тем самым препятствуя дифференциации19. Это представляет собой проблему при изучении функции как микроглии, так и инфильтрации макрофагов.
В то время как микроглии и периферических макрофагов имеют четкое происхождение (например, от эмбрионального желтка мешок и костный мозг, соответственно20,21), есть все большее число выводов, указывающих, что две популяции клеток оказывают различные роли в мозге19. Поэтому крайне важно использовать методы, которые различают эти две популяции без инвазивных манипуляций (т.е. химер костного мозга или парабиоза), которые могут модулировать их плотность, распределение, морфологию и функции. TMEM119 стал микроглии конкретных маркера через здоровье и болезни условия22. В сочетании с IBA1, этот маркер становится полезным для дифференциирования этих клеток от проникновения макрофагов, которые TMEM119-отрицательный и IBA1-положительный. Хотя это регулируется в развитии, TMEM119 выражается уже в послеродовые дни 3 (P3) и 6 (P6), неуклонно растет до достижения взрослых уровней между P10 и P1422. IBA1 выражается уже в эмбриональный день 10.5 (E10.5)23. Таким образом, предлагаемый протокол двойной маркировки полезен для изучения этих двух популяций на протяжении всей послеродовой жизни.
Этот протокол обеспечивает пошаговую иммуностоинизационную процедуру, которая допускает дискриминацию между микроглией и периферийными макрофагами. В нем также объясняется, как проводить количественный анализ микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также анализ инфильтрации периферических макрофагов. В то время как исследование микроглии и периферических макрофагов полезно само по себе, этот протокол далее позволяет локализацию нейровоспалительных фойе; таким образом, он также служит платформой для определения конкретных регионов для проведения расследований с использованием дополнительных (пока больше времени и затрат) методов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Это протокол для двойной визуализации микроглии и проникновения макрофагов в ткани мозга мыши. TMEM119 (который маркирует микроглию выборочно), в сочетании с IBA1 (который обеспечивает исключительную визуализацию их морфологии), позволяет исследует изменения плотности, распределения и морфологии. Количественная оценка этих параметров имеет важное значение для получения информации о роли, которую играет микроглия, резидентные макрофаги мозга. В нормальных физиологических условиях микроглия регулярно распределяется по мозаичному узору и представляет собой небольшую сому с беспорядочными процессами. Тем не менее, в ответ на экологические факторы (наиболее травмы, инфекции, болезни или травмы), микроглиальная плотность, распределение и морфология изменяются различными способами, в зависимости от оскорбления. Кроме того, описанный метод двойного окрашивания позволяет визуализировать проникновение макрофагов в мозг на основе их экспрессии IBA1 и без колокализации с TMEM119. Таким образом, такой подход позволяет проводить дискриминацию между микроглией и инфильтративающимися макрофагами, что необходимо для обеспечения функционального понимания их явного участия в гомеостазе мозга в различных контекстах здоровья и болезней. Этот протокол интегрирует последние выводы в нейроиммунологии, которые относятся к идентификации селективных маркеров. Он также служит полезным инструментом как для опытных нейроиммунологов, так и для исследователей, стремящихся интегрировать нейроиммунологию в проекты.

На рисунке 1 показана сомаркировка микроглии с использованием IBA1 и TMEM119 в корональном разделе суставного гиппокампа, изображенного в 20x флуоресценционной микроскопией. Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процесс...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Этот протокол описывает пошаговой рабочий процесс для иммунофлуоресцентного костейни IBA1 и TMEM119, в дополнение к анализу микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также периферической миелоидной инфильтрации в ткани мозга мыши.

Иммунофлуоресценция пятно использованием IBA1 и TMEM119 для микроглиальной плотности, морфологии и периферической миелоидной клеточной инфильтрации анализа в мышиный мозг

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Этот протокол покажет вам, как испачкать микроглию, выполнить количественный анализ плотности и морфологии, а также количественно макрофаг инфильтрации в мозг. Этот метод позволяет исследователю измерять изменения в распределении микроглии и морфологии в количественном отношении и дифференцировать микроглии от проникновения макрофагов Этот протокол анализа может быть легко применен к другим моделям животных для измерения изменений в микроглиальной распределения и морфологии, где анти-IBA1 и анти-TMEM119 антител доступны. Настоятельно рекомендуется проводить количество клеток и следы, ослепленные экспериментальным состоянием, и быть последовательными в том, как эта процедура выполняется.Чтобы начать эту процедуру, откройте программу обработки изображений, такую как Fiji или ImageJ, которая имеет ближайший сосед расстояние плагин установлен. Откройте изображение 20X, если шкала содержится в метаданных файла, а не автоматически устанавливается из метаданных. В баре меню выберите Analyze, Set Scale, а затем введите правильную информацию.Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, запечатленной на изображении, выберите инструмент «Прямая линия». Поместите курсор на край шкалы и при нажатии клавиши Shift нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении. Выберите анализ, установите шкалу.Окно всплывает и положить правильное известное расстояние и единицу длины, чтобы определить пиксель в длину единицы и нажмите OK. Далее выберите изображение, цвет, сделать композитный для создания композитного изображения всех каналов. В баре меню выберите Анализ, Установите измерения. Проверьте площадь, центроидов и периметр.В меню Перенаправление для высадки выберите открытый файл, а затем нажмите OK. Перейти к изображению, цвету, каналу инструмент, чтобы открыть инструмент канала. Используйте инструмент Freehand Selection, чтобы нарисовать грубый периметр вокруг области интересов. Дважды нажмите Овальный инструмент на бар инструментов, чтобы включить инструмент выбора кисти.Убедитесь, что поле Кисти Выбора Enable проверяется и нажмите OK. Используя кисть выбора, отрегулируйте периметр, чтобы наилучшим образом соответствовать области интереса, а затем нажмите T на клавиатуре по всей этой области, чтобы стрелка Y менеджера. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M, и окно результатов будет всплывающее. Копировать и вставлять результаты в лист данных и сохранить информацию о области.После копирования области, представляющих интерес, вы основой информации из окна Результаты, нажав на него и нажав на клавишу Backspace. Выберите окно ROI Manager, выберите трассу ROI и измените имя в нужное время, чтобы соответствовать имени изображения, нажав на Rename. Нажмите OK, а затем нажмите кнопку "Новое имя roi Trace" и сохраните.Дважды нажмите на инструмент Brush в баре инструментов. Выберите черный цвет и размер кисти 10. Убедитесь, что опция Paint on overlay не проверена.В канале TMEM119 аккуратно поместите черную точку в центр сомы для каждой положительной микроглии TMEM119. Поместите белую точку на центр клеток, которые не являются положительными для TMEM119. Повторите ту же процедуру для всех ячеек, содержащихся в области интересов.Далее будут отображаться изображение, цвет, канал Сплит, окно для каждого канала. Определите канал, который имеет точечные аннотации, и закройте два других окна. Чтобы перенаправить новое изображение сплит-канала, перейдите на анализ, установите измерения.В перенаправлении Чтобы отказаться от меню, выберите изображение сплит-канала и нажмите OK. Затем выберите Изображение, Тип, восьми-битный. Перейти к настройке изображения и выбрать порог. Отрегулируйте ползунки влево в обоих барах.Это оставит только черные точки, которые теперь будут появляться белыми. Выберите область интереса в окне ROI Manager. В баре меню выберите Анализ, Анализируйте частицу.В текстовом поле для размера ввемите от одного до 20. Коробка для единиц Pixel должна оставаться неконтролируемой, в то время как окно, которое для результатов отображения, суммировать и добавить к менеджеру должны быть проверены. Нажмите OK, чтобы отобразить окно Summary, которое даст количество очков.Копировать и вставлять эту информацию на лист данных. Затем выберите плагины NND, чтобы показать окно NND. Каждое число представляет расстояние, которое каждая микроглия имеет до ближайшей соседней микроглии.Копировать и вставлять всю эту информацию на лист данных. Вернитесь к окну Порога и отрегулируйте верхний ползунок вправо, который оставит все белые точки видимыми, теперь появляющимися белыми. Выберите анализ, анализ частиц для отображения окна analyze Particles.Нажмите OK, чтобы показать окно Резюме, которое предоставляет количество очков. Копировать и вставлять эту информацию в лист данных. Перейдите к менеджеру по рентабельности инвестиций и выберите все баллы.Затем нажмите правой кнопкой мыши и сохраните имя изображения. Это позволит сохранить все точки в файле qIP. Во-первых, откройте файлы изображений 4DX.Всплывающее окно появится с просьбой, если изображения должны быть открыты в стеке. Нажмите OK. Далее выберите Изображение, Стеки, «Проект», чтобы открыть окно проекции. Включите все ломтики от первого до последнего ломтика.Убедитесь, что максимальная интенсивность выбрана под тип проекции и нажмите OK. Нажмите на новое окно, которое содержит «Проект». Выберите изображения, цвета, сплит-каналы и проведите следы на изображениях канала IBA1. В баре меню выберите Анализ, Установите измерения.Проверьте площадь, центроидов и периметр. В меню Redirect Чтобы отказаться от меню, выберите открытый файл и нажмите OK. Чтобы установить шкалу вручную на основе шкалы, запечатленной на изображении, выберите инструмент «Прямая линия». Поместите курсор на край шкалы и при нажатии клавиши Shift нарисуйте линию как можно ближе к шкале на изображении.Выберите анализ, установите шкалу. Окно всплывает. Вввените правильное известное расстояние и единицу длины, чтобы определить пиксели на единицу длины и нажмите OK. Чтобы измерить размер сомы в канале IBA1, нарисуйте грубый периметр сомы с помощью инструмента Freehand Selection.Дважды нажмите Овальный инструмент на панели инструментов, чтобы включить инструмент выбор кисти. Убедитесь, что поле Кисти Выбора Enable проверяется и нажмите OK. Используя кисть выбора, отрегулируйте трассировку, чтобы лучше всего соответствовать соме. Масштабирование позволит точность на этом этапе.Далее нажмите клавишу T, чтобы добавить след сомы к менеджеру roi. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M для отображения результатов. Копировать и вставлять эти результаты в лист данных.Перейдите в окно ROI Manager, выберите область интереса и измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, нажав rename. Нажмите правой кнопкой мыши на переименованном регионе, представляющих интерес, и нажмите Сохранить. Убедитесь, что имя указывает, что след для сомы и сохранить файл.Для измерения площади арборизации в канале IBA1 сначала выберите инструмент Polygon Selection. Нажмите на микроглиальный процесс конечности с инструментом, чтобы начать форму полигона. Обоймите микроглию, нажав на кончики каждой конечности процесса, чтобы сформировать полигон, который наилучшим образом представляет область, покрытую микроглиальными арборизациями.Когда полигон будет завершен, нажмите на отправную точку, чтобы закрыть его. Затем нажмите клавишу T, чтобы добавить след в roi Manager. Выберите анализ, измерение или нажмите клавишу M, чтобы добавить данные в окно Результатов.Копировать и вставлять эти данные в лист данных. Чтобы сохранить информацию о области арборизации, перейдите в окно ROI Manager, выберите область интереса и измените имя, чтобы соответствовать имени изображения, нажав rename. Нажмите правой кнопкой мыши на переименованном регионе, представляющих интерес, и нажмите Сохранить.Убедитесь, что имя указывает, что след для арборизации и сохранить файл. Это исследование описало пошаговый рабочий процесс для иммунофлюоресцентного совместного окрашивания IBA1 и TMEM119 и для анализа микроглиальной плотности, распределения и морфологии, а также инфильтрации периферических миелоидных клеток в ткани мозга мыши. Микроскопия флуоресценции используется для изображения совместной маркировки микроглии с помощью IBA1 и TMEM119 в корональной части спинного гиппокампа при увеличении 20X.Успешное окрашивание показывает микроглиальные клеточные тела и их тонкие процессы. Окрашивание позволяет определить плотность и распределение микроглий, а также определить микроглиальные кластеры и проникновение макрофагов. Конфокальная микроскопия используется для изображения пошаговой процедуры отслеживания микроглиальной арборизации при увеличении 40X.Эти репрезентативные результаты показывают положительные результаты IBA1 и TMEM119 положительные микроглии, а также пример отслеживания клеток тела. Важно быть последовательным при подсчете ячеек и обращать внимание на оба сигнала IBA1 и TMEM119. Этот метод позволяет исследователю определить области мозга, которые страдают от конкретного стимула, который затем может быть изучен более углубленно с дополнительными методами.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Изоляция миелоидных дендритных клеток и эпителиальных клеток из человеческого тимуса

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Бронхоальвеолярное спазмы легких у мышей для анализа воспалительной клеточной инфильтрации

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Изоляция, фиксации и изображений иммунофлюоресценции мыши надпочечников

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Анализ ограничения SAMHD1 с помощью проточной цитометрии в миелоидных клетках человека U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Отделение субпопуляций иммунных клеток в образцах периферической крови у детей с инфекционным мононуклеозом

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...