Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
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Agradecemos a Nathalie Vernoux por su orientación y ayuda con los experimentos. También queremos dar las gracias a los Doctores Emmanuel Planel y Serge Rivest por el uso de su fluorescencia y microscopios confocales, respectivamente. Este trabajo fue financiado en parte con becas del Consejo Mexicano de Ciencia y Tecnología (CONACYT; a F.G.I), Fundación Famille-tette y Centre thématique de recherche en neurosciences (CTRN; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (a M.B.), y Choqueté Shastri Indo-Canadian Institute (a K.B.), así como una beca Discovery del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) a M.E.T. M.E.T. tiene una Cátedra de Investigación de Canadá (Nivel II) de Plasticidad Neuroinmune en Salud y Terapia.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los comités institucionales de ética animal, de conformidad con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Laval.
1. Inmunomanchación
<ol><li>Seleccione tres secciones del cerebro del ratón que contengan la región de interés (ROI) (es decir, el hipocampo) con la ayuda de un atlas cerebral. Coloque las secciones en una placa de plástico mu...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Este protocolo se puede dividir en dos partes críticas: calidad de la tinción y análisis. Si la tinción no es óptima, no representará adecuadamente las células microgliales, afectando así las mediciones de densidad, distribución y morfología. Además, se puede subestimar la proporción de células mieloides periféricas de infiltración. Esta es una versión optimizada del protocolo de tinción, pero hay varios factores que pueden resultar en imágenes subóptimas. A pesar de que la perfusión del animal no est...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Ya sea aguda o crónica, la neuroinflamación está fuertemente influenciada por la microglia, los macrófagos residentes del cerebro. Visualizar la microglia a través de la inmunomancha es valioso para el estudio de la neuroinflamación con el uso de microscopía de luz, una técnica altamente accesible. En condiciones homeostáticas, la microglia se distribuye típicamente en un patrón no superpuesto, similar a un mosaico. Exhiben pequeños somas que se extienden procesos ramificados1, que a veces se ponen en contacto entre sí2. Los procesos ramificados microgliales examinan dinámicamente el parénquima cerebral, interactuando con las neuronas, otras células gliales y los vasos sanguíneos durante las condiciones fisiológicas normales3. Microglia están equipadas con un arsenal de receptores que les permiten realizar tareas inmunológicas y responder a los cambios en el entorno cerebral, a la muerte celular o al daño tisular. Además, ejercen funciones fisiológicas clave, especialmente en la formación sináptica, mantenimiento, y eliminación4,5.
Entre los marcadores disponibles utilizados para estudiar la microglia, la molécula de adaptador de calcio ionizado 1 (IBA1) es una de las más utilizadas. IBA1 es una proteína de unión al calcio que proporciona una visualización excepcional de la morfología microglial, incluidos los procesos distales finos, como lo confirma la microscopía electrónica6. Esta herramienta ha sido fundamental para caracterizar la transformación microglial, anteriormente llamada "activación", en una amplia gama de modelos de enfermedades animales7,8,9. En presencia de neuroinflamación, la respuesta microglial incluye: microgliosis que se define como un aumento de la densidad celular, cambios en la distribución que a veces resultan en clustering, agrandamiento del cuerpo celular, así como engrosamiento y acortamiento de procesos asociados con formas más ameboideas10,11,12,13.
La inmunomancha está limitada por la disponibilidad de anticuerpos dirigidos contra marcadores específicos. Es importante destacar que IBA1 se expresa mediante microglia, pero también por macrófagos periféricos que se infiltran en el cerebro14. Mientras que la observación de células IBAN1 positivas dentro del cerebro se ha convertido en un marcador de microglia en este campo de investigación, la infiltración de macrófagos periféricos se ha reportado bajo diversas condiciones, incluso marginalmente en el cerebro sano15,16 ,17,18. En consecuencia, el uso de IBA1 por sí solo no permite la visualización selectiva de microglia. Además, los macrófagos adoptan características moleculares y morfológicas de la microglia residente una vez que se han infiltrado en el cerebro, lo que dificulta la diferenciación19. Esto representa un desafío a la hora de investigar la función de la microglia y de la infiltración de macrófagos.
Si bien los macrófagos periféricos y microglia tienen orígenes distintos (por ejemplo, del saco de yema embrionaria y la médula ósea, respectivamente20,21), hay un número cada vez mayor de hallazgos que indican que las poblaciones de dos células ejercen diferentes roles en el cerebro19. Por lo tanto, es crucial utilizar métodos que discriminen entre estas dos poblaciones sin manipulaciones invasivas (es decir, quimeras de médula ósea o parabiosis) que puedan modular su densidad, distribución, morfología y función. TMEM119 ha surgido como un marcador específico de microglia en todas las condiciones de salud y enfermedad22. Cuando se combina con IBA1, este marcador se vuelve útil para diferenciar estas células de los macrófagos infiltrados, que son TMEM119-negativo e IBA1-positivo. Si bien está regulada por el desarrollo, TMEM119 se expresa ya en los días postnatales 3 (P3) y 6 (P6), aumentando constantemente hasta alcanzar los niveles adultos entre P10 y P1422. Iba1 se expresa desde el día embrionario 10.5 (E10.5)23. Por lo tanto, el protocolo de doble etiquetado propuesto es útil para estudiar estas dos poblaciones a lo largo de la vida posnatal.
Este protocolo proporciona un procedimiento de inmunostainización paso a paso que permite la discriminación entre la microglia y los macrófagos periféricos. También explica cómo realizar un análisis cuantitativo de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como el análisis de la infiltración de macrófagos periféricos. Si bien la investigación de microglia y macrófagos periféricos es útil por sí sola, este protocolo permite además la localización de vestíbulos neuroinflamatorios; por lo tanto, también sirve como plataforma para identificar regiones específicas para investigar, con el uso de técnicas complementarias (aún, más lentas y que consumen recursos).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Este es un protocolo para la visualización dual de microglia e infiltración de macrófagos en el tejido cerebral del ratón. TMEM119 (que etiqueta la microglia selectivamente), cuando se combina con IBA1 (que proporciona una visualización excepcional de su morfología), permite investigar los cambios en la densidad, distribución y morfología. La cuantificación de estos parámetros es importante para proporcionar información sobre los roles ejercidos por la microglia, los macrófagos residentes del cerebro. En condiciones fisiológicas normales, la microglia se distribuye regularmente en un patrón similar a un mosaico y presenta un pequeño soma con procesos ramificados. Sin embargo, como respuesta a factores ambientales (es decir, trauma, infección, enfermedad o lesión), la densidad microglial, la distribución y la morfología se alteran de diversas maneras, dependiendo del insulto. Además, el método de doble tinción descrito permite la visualización de macrófagos infiltrados en el cerebro en función de su expresión de IBA1 y sin colocalización con TMEM119. Por lo tanto, este enfoque permite la discriminación entre la microglia y la infiltración de macrófagos, que se requiere para proporcionar información funcional sobre su participación distinta en la homeostasis cerebral en diversos contextos de salud y enfermedad. Este protocolo integra los últimos hallazgos en neuroinmunología que se refieren a la identificación de marcadores selectivos. También sirve como una herramienta útil tanto para los neuroinmólogos experimentados como para los investigadores que buscan integrar la neuroinmunología en los proyectos.

La Figura 1 muestra el coetiquetado de microglia utilizando IBA1 y TMEM119 en una sección coronal del hipocampo dorsal que se muestra a 20 veces mediante microscopía de fluorescencia. Una tinción exitosa revela cuerpos celulares microgliales y sus procesos finos(Figura 1A-C). Esta tinción permite determinar la densidad microglial y la distribución e identificación de los cúmulos microgliales<strong class="...

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Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Este protocolo le mostrará cómo manchar la microglia, realizar análisis cuantitativos de densidad y morfología, así como cuantificar la infiltración de macrófagos en el cerebro. Esta técnica permite al investigador medir los cambios en la distribución y morfología de la microglia de forma cuantitativa y diferenciar la microglia de la infiltración de macrófagos Este protocolo de análisis se puede aplicar fácilmente a otros modelos animales para medir los cambios en la distribución microgliaal y la morfología donde se dispone de anticuerpos anti-IBA1 y anti-TMEM119. Se recomienda llevar a cabo los recuentos celulares y trazas cegadas a la condición experimental y ser consistente en la forma en que se realiza este procedimiento.Para comenzar este procedimiento, abra un programa de procesamiento de imágenes como Fiji o ImageJ que tenga instalado el complemento de distancia de vecino más cercano. Abra la imagen 20X si la escala está contenida en los metadatos del archivo y no se establece automáticamente a partir de los metadatos. En la barra de menús, seleccione Analizar, Establecer escala y, a continuación, introduzca la información correcta.Para establecer la escala manualmente en función de una escala impresa en la imagen, seleccione la herramienta Línea recta. Coloque el cursor en el borde de la escala y mientras presiona la tecla Mayús, dibuje una línea lo más cerca posible de la escala de la imagen. Seleccione Analizar, Establecer escala.Aparecerá una ventana que colocará la distancia y la unidad de longitud conocidas correctas para determinar la unidad de longitud del píxel y hacer clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Color, Hacer compuesto para crear una imagen compuesta de todos los canales. En la barra de menús, seleccione Analizar, Definir medidas. Compruebe el área, centroide y perímetro.En el menú desplegable Redirección a, seleccione Abrir archivo y, a continuación, haga clic en Aceptar. Vaya a Imagen, Color, Herramienta Canal para abrir la herramienta Canal. Utilice la herramienta Selección a mano alzada para dibujar un perímetro áspero alrededor de la región de interés. Haga doble clic en la herramienta Oval en la barra de herramientas para habilitar la herramienta Pincel de selección.Asegúrese de que la casilla Habilitar pincel de selección esté activada y haga clic en Aceptar. Con el pincel de selección, ajuste el perímetro para que se ajuste mejor a la región de interés y, a continuación, presione T en el teclado en toda esta área para flechaR Y manager. Seleccione Analizar, Medir o Pulse la tecla M y aparecerá la ventana Resultados. Copie y pegue los resultados en una hoja de datos y guarde la información relativa al área.Después de copiar el área de la región de interés, base la información desde la ventana Resultados haciendo clic en ella y presionando la tecla Retroceso. Seleccione la ventana Administrador de ROI, seleccione el seguimiento de ROI y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen pulsando Cambiar nombre. Haga clic en Aceptar y, a continuación, haga clic con el botón derecho en el nuevo nombre del seguimiento de ROI y guarde.Haga doble clic en la herramienta Pincel en la barra de herramientas. Seleccione el color negro y el tamaño del pincel de 10. Asegúrese de que la opción Pintar en superposición esté desactivada.En el canal TMEM119, coloque cuidadosamente un punto negro en el centro del soma para cada microglia positiva TMEM119. Coloque un punto blanco en el centro de las celdas que no sean positivas para TMEM119. Repita el mismo procedimiento para todas las celdas contenidas en la región de interés.A continuación, seleccione Imagen, Color, Canal dividido, aparecerá una ventana para cada canal. Identifique el canal que tiene las anotaciones de puntos y cierre las otras dos ventanas. Para redirigir la nueva imagen de canal dividido, vaya a Analizar, Establecer medidas.En el menú desplegable Redireccionar a, seleccione la imagen de canal dividido y haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Tipo y ocho bits. Vaya a Ajuste de imagen y seleccione Umbral. Ajuste los controles deslizantes hasta la izquierda en ambas barras.Esto dejará sólo los puntos negros que ahora aparecerán blancos. Seleccione la región de interés en la ventana Administrador de ROI. En la barra de menús, seleccione Analizar, Analizar partícula.En el cuadro de texto tamaño, introduzca uno a 20. La casilla de las unidades de píxeles debe permanecer desactivada mientras se activa la casilla que se encuentra para Mostrar resultados, Resumir y Agregar al administrador. Haga clic en Aceptar para mostrar la ventana Resumen que dará el número de puntos.Copie y pegue esta información en la hoja de datos. A continuación, seleccione los complementos NND para mostrar la ventana NND. Cada número representa la distancia que cada microglia tiene a la microglia vecina más cercana.Copie y pegue toda esta información en la hoja de datos. Vuelve a la ventana Umbral y ajusta el control deslizante superior hasta la derecha, lo que dejará todos los puntos blancos visibles, ahora apareciendo en blanco. Seleccione Analizar, Analizar partícula para mostrar la ventana emergente Analizar partículas.Haga clic en Aceptar para mostrar la ventana Resumen que proporciona el número de puntos. Copie y pegue esta información en la hoja de datos. Vaya al Administrador de ROI y seleccione todos los puntos.A continuación, haga clic con el botón derecho y guarde con el nombre de la imagen. Esto permitirá guardar todos los puntos de un archivo ZIP. En primer lugar, abra los archivos de imagen 4DX.Aparecerá una ventana emergente preguntando si las imágenes deben abrirse en una pila. Haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione Imagen, Pilas, ZProject para abrir la ventana Proyección Z. Incluya todos los sectores desde el primer hasta el último sector.Asegúrese de que la intensidad máxima está seleccionada en Tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Haga clic en la nueva ventana que contiene el ZProject. Seleccione Imagen, Colores, Canales divididos y realice las trazas en las imágenes del canal IBA1. En la barra de menús, seleccione Analizar, Establecer medidas.Compruebe el área, centroide y perímetro. En el menú desplegable Redireccionar a, seleccione el archivo abierto y haga clic en Aceptar. Para establecer la escala manualmente en función de una escala impresa en la imagen, seleccione la herramienta Línea recta. Coloque el cursor en el borde de la escala y mientras presiona la tecla Mayús, dibuje una línea lo más cerca posible de la escala de la imagen.Seleccione Analizar, Establecer escala. Aparecerá una ventana. Introduzca la distancia conocida correcta y la unidad de longitud para determinar la unidad Píxeles por longitud y haga clic en Aceptar. Para medir el tamaño del soma en el canal IBA1, dibuje un perímetro áspero del soma con la herramienta Selección a mano alzada.Haga doble clic en la herramienta Oval en la barra de herramientas para habilitar la herramienta Pincel de selección. Asegúrese de que la casilla Habilitar pincel de selección esté activada y haga clic en Aceptar. Con el Pincel de Selección, ajuste el trazo para que se ajuste mejor al soma. El acercamiento activará la precisión durante este paso.A continuación, presione la tecla T para agregar el seguimiento soma al Administrador de ROI. Seleccione Analizar, Medir o pulse la tecla M para mostrar los resultados. Copie y pegue estos resultados en una hoja de datos.Vaya a la ventana Administrador de ROI, seleccione la región de interés y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen pulsando Cambiar nombre. Haga clic con el botón derecho en la región de interés renombrada y haga clic en Guardar. Asegúrese de que el nombre especifica que el seguimiento es para soma y guarde el archivo.Para medir el área de arborización en el canal IBA1, seleccione primero la herramienta Selección de polígonos. Haga clic en la extremidad del proceso microglial con la herramienta para iniciar la forma del polígono. Vaya alrededor de la microglia haciendo clic en las puntas de cada extremidad del proceso para formar un polígono que mejor represente el área cubierta por las arborizaciones microgliaales.Cuando el polígono esté completo, haga clic en el punto de partida para cerrarlo. A continuación, presione la tecla T para agregar el seguimiento al Administrador de ROI. Seleccione Analizar, Medir o pulse la tecla M para agregar los datos a la ventana Resultados.Copie y pegue estos datos en la hoja de datos. Para guardar la información relativa al área de arborización, vaya a la ventana Administrador de ROI, seleccione la región de interés y cambie el nombre para que coincida con el nombre de la imagen presionando Cambiar nombre. Haga clic con el botón derecho en la región de interés renombrada y haga clic en Guardar.Asegúrese de que el nombre especifica que el seguimiento es para la arborización y guarde el archivo. Este estudio describió el flujo de trabajo paso a paso para la co-tinción inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119 y para el análisis de la densidad microglial, distribución y morfología, así como de la infiltración celular mieloide periférica en el tejido cerebral del ratón. La microscopía de fluorescencia se utiliza para tomar imágenes del co-etiquetado de la microglia utilizando IBA1 y TMEM119 en la sección coronal del hipocampo dorsal con aumento de 20 veces.Una tinción exitosa revela cuerpos celulares microgliales y sus procesos finos. La tinción permite la determinación de la densidad y distribución microglial y la identificación de cúmulos microgliales y macrófagos infiltrados. La microscopía confocal se utiliza para tomar imágenes del procedimiento de rastreo de arborización microglial escalonada a un aumento de 40X.Estos resultados representativos muestran la microglia positiva DE IBA1 y la microglia positiva TMEM119, así como un ejemplo de rastreo del cuerpo celular. Es importante ser consistente al contar las células y prestar atención a ambas señales de IBA1 y TMEM119. Esta técnica permite al investigador identificar regiones del cerebro que se ven afectadas por un estímulo particular que luego se puede estudiar más en profundidad con técnicas complementarias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Aislamiento de células dendríticas mieloides y células epiteliales de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Aislamiento y análisis de citometría de flujo de células inmunes del cerebro isquémico Ratón

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lavado broncoalveolar de los pulmones murinos para analizar infiltración de células inflamatorias

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Aislamiento, fijación y proyección de imagen de inmunofluorescencia de las glándulas suprarrenales de ratón

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Análisis de la restricción SAMHD1 por citometría de flujo en células mieloides humanas U937

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Separación de subpoblaciones de células inmunitarias en muestras de sangre periférica de niños con mononucleosis infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...