Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Vi är tacksamma mot Nathalie Vernoux för hennes vägledning och hjälp med experimenten. Vi skulle också vilja tacka DRS. Emmanuel Planel och Serge Rivest för användning av deras fluorescens och konfokala Mikroskop, respektive. Detta arbete finansierades delvis av stipendier från mexikanska vetenskaps-och teknik rådet (CONACYT, till F. G. I), Fondation Famille-Choquette och Centre Thématique de Recherche en neurovetenskap (ctrn; to K.P.), fonds de Recherche du Québec-santé (till M.B.), och Shastri Indo-kanadensiska Institute (till K.B.), samt ett Discovery Grant från Natural Sciences och Engineering Research Council of Canada (NSERC) till M.E.T. M.E.T. innehar en Canada Research Chair (Tier II) av Neuroimmunplasticitet i hälsa och terapi.

Alla experimentella förfaranden utfördes i samförstånd med riktlinjerna från de institutionella djur etikkommittéerna, i enlighet med det kanadensiska rådet för djuromsorg och djur vårds nämnden vid Université Laval.
1. immunofärgning
<ol><li>Välj tre mus hjärn sektioner som innehåller regionen av intresse (ROI) (dvs., Hippocampus) med hjälp av en hjärn Atlas. Placera sektionerna i en plastplatta med flera plattor och täck dem med 350 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (<...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Detta protokoll kan delas in i två kritiska delar: kvaliteten på färgning och analys. Om infärgning inte är optimalt, kommer det inte att representera mikrogliala celler adekvat, vilket påverkar tätheten, distribution, och morfologi mätningar. Dessutom kan andelen infiltrations perifera myeloida celler underskattas. Detta är en optimerad version av infärgnings protokollet, men det finns flera faktorer som kan resultera i suboptimala bilder. Även om perfusion av djuret inte ingår i detta protokoll, om hjärnan...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Oavsett om akut eller kronisk, neuroinflammation är tätt påverkad av microglia, den bosatta makrofager i hjärnan. Att visualisera mikroglia genom immunofärgning är värdefullt för studiet av neuroinflammation med hjälp av ljusmikroskopi, en mycket lättillgänglig teknik. I homeostatiska förhållanden distribueras mikroglia vanligtvis i ett icke-överlappande, mosaik-liknande mönster. De uppvisar små Somas som sträcker förgrenat processer1, som ibland kontakta varandra2. Microglial förgrenat processer dynamiskt undersökning av hjärnparenkymet, interagera med nervceller, andra gliaceller och blodkärl under normala fysiologiska förhållanden3. Microglia är utrustade med en arsenal av receptorer som gör att de kan utföra immunologiska uppgifter och reagera på förändringar i hjärn miljön, celldöd eller vävnadsskada. Dessutom, de utövar viktiga fysiologiska funktioner, särskilt i synaptisk formation, underhåll, och eliminering4,5.
Bland de tillgängliga markörer som används för att studera microglia, Joniserat kalcium bindande adapter molekyl 1 (IBA1) är en av de mest använda. IBA1 är ett kalcium bindnings protein som ger exceptionell visualisering av mikroglial morfologi, inklusive fina distala processer, vilket bekräftas av elektronmikroskopi6. Detta verktyg har varit avgörande för att karakterisera mikroglial omvandling, tidigare kallad "aktivering", i ett brett spektrum av djursjukdomar modeller7,8,9. I närvaro av neuroinflammation, den mikrogliala svar inkluderar: microgliosis som definieras som en ökning av cellulär densitet, förändringar i distributionen som ibland resultera i klustring, utvidgningen av cellkroppen, samt förtjockning och förkortning av processer i samband med mer ameboid former10,11,12,13.
Immunofärgning begränsas av tillgången på antikroppar riktade mot specifika markörer. Viktigt, IBA1 uttrycks av mikroglia men också av perifera makrofager som infiltrera hjärnan14. Medan observation av IBA1-positiva celler inne i hjärnan har blivit en markör för mikroglia inom detta forskningsområde, perifer makrofag infiltration har rapporterats under olika förhållanden, även marginellt i den friska hjärnan15,16 ,17,18. Användningen av IBA1 ensamt tillåter därför inte selektiv visualisering av mikroglia. Dessutom, makrofager anta molekylära och morfologiska egenskaper hos Resident mikroglia när de har infiltrerat hjärnan, vilket hindrar differentiering19. Detta är en utmaning när man undersöker funktionen hos både mikroglia och infiltrerande makrofager.
Medan mikroglia och perifera makrofager har distinkta ursprung (t. ex. från den embryonala äggula säcken och benmärgen, respektive20,21), finns det ett ökande antal fynd som indikerar att de två cell populationerna utövar olika roller i hjärnan19. Det är därför viktigt att använda metoder som diskriminerar mellan dessa två populationer utan invasiva manipulationer (dvs., benmärgs chimärer eller parabios) som kan modulera deras densitet, distribution, morfologi, och funktion. TMEM119 har dykt upp som en microglia-specifik markör över hälsa och sjukdomstillstånd22. När den kombineras med IBA1, blir denna markör användbar för att differentiera dessa celler från infiltrerande makrofager, som är TMEM119-negativa och IBA1-positiva. Medan det är utvecklingsreglerat, TMEM119 uttrycks så tidigt som postnatal dag 3 (P3) och 6 (P6), stadigt ökar tills når vuxna nivåer mellan P10 och P1422. IBA1 uttrycks så tidigt som embryonala dag 10,5 (E 10.5)23. Den föreslagna dubbel märkning protokollet är därför användbart att studera dessa två populationer under postnatal liv.
Detta protokoll ger en stegvis immunfärgnings procedur som möjliggör diskriminering mellan mikroglia och perifera makrofager. Det förklarar också hur man genomför en kvantitativ analys av mikroglial densitet, distribution, och morfologi, samt analys av perifer makrofaginfiltration. Medan utredningen av mikroglia och perifera makrofager är användbar på egen hand, detta protokoll ytterligare tillåter lokalisering av neuroinflammatoriska Foyers; Således fungerar det också som en plattform för att identifiera specifika regioner att undersöka, med hjälp av kompletterande (ännu, mer tids-och resurskrävande) tekniker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Detta är ett protokoll för den dubbla visualiseringen av mikroglia och infiltrerande makrofager i mus hjärnvävnad. TMEM119 (vilka etiketter mikroglia selektivt), i kombination med IBA1 (som ger en exceptionell visualisering av deras morfologi), möjliggör utredning av förändringar i densitet, distribution och morfologi. Kvantifiera dessa parametrar är viktigt för att ge insikter i de roller som utövas av microglia, bosatt makrofager i hjärnan. Under normala fysiologiska förhållanden, mikroglia regelbundet distribueras i en mosaik-liknande mönster och presentera en liten Soma med förgrenade processer. Ändå, som ett svar på miljöfaktorer (dvs trauma, infektion, sjukdom, eller skada), mikroglial densitet, distribution och morfologi ändras på olika sätt, beroende på förolämpningen. Dessutom, den beskrivna dubbel-färgning metod tillåter visualisering av infiltrerande makrofager i hjärnan baserat på deras uttryck av IBA1 och utan colocalization med TMEM119. Detta tillvägagångssätt möjliggör diskriminering mellan mikroglia och infiltrerande makrofager, vilket krävs för att ge funktionella insikter i deras distinkta engagemang i hjärnans homeostas över olika sammanhang av hälsa och sjukdom. Detta protokoll integrerar de senaste fynden i Neuroimmunologi som hänför sig till identifieringen av selektiva markörer. Det fungerar också som ett användbart verktyg för både erfarna neuroimmunologer och forskare som vill integrera Neuroimmunologi i projekt.

Figur 1 visar Co-märkning av mikroglia med IBA1 och TMEM119 i en koronala delen av dorsala Hippocampus avbildas på 20x av fluorescens mikroskopi. En lyckad färgning avslöjar mikrogliala cell organ och deras fina processer (figur 1A − C). Denna färgning möjliggör bestämning av mikroglialtäthet och fördelning och identifiering av mikrogliala kluster (figur 1I</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Detta protokoll beskriver ett steg-för-steg-arbetsflöde för Immunofluorescerande cofärgning av IBA1 och TMEM119, förutom analys av mikroglial densitet, distribution och morfologi, samt perifer myeloisk cell infiltration i mus hjärnvävnad.

Immunofluorescensfärgning med IBA1 och TMEM119 för Mikroglial densitet, morfologi och perifer myeloid cell infiltration analys i mushjärna

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Detta protokoll kommer att visa dig hur man fläckar microglia, utföra kvantitativ densitet och morfologi analys samt att kvantifiera makrofag infiltration i hjärnan. Denna teknik gör det möjligt för forskaren att mäta förändringar i mikrogliafördelning och morfologi på ett kvantitativt sätt och att differentiera mikroglia från infiltrera makrofager Detta analysprotokoll kan enkelt appliceras på andra djurmodeller för att mäta förändringar i mikroglial distribution och morfologi där anti-IBA1 och anti-TMEM119-antikroppar finns tillgängliga. Det rekommenderas starkt att genomföra cellen räknas och spår förblindade till det experimentella tillståndet och att vara konsekvent i hur denna procedur utförs.För att börja denna procedur, öppna ett bildbehandlingsprogram sådan Fiji eller ImageJ som har närmaste granne avstånd plug-in installerat. Öppna 20X-bilden om skalan finns i filens metadata och inte automatiskt ställs in från metadata. På menyraden väljer du Analysera, Ange skala och ange sedan rätt information.Om du vill ställa in skalan manuellt baserat på en skala som är inpräntad på bilden väljer du verktyget Rak linje. Placera markören på vågens kant och samtidigt som du trycker på Skift-tangenten ritar du en linje så nära vågen som möjligt på bilden. Välj Analysera, Ange skala.Ett fönster kommer att dyka upp och sätta rätt kända avstånd och enhet längd för att bestämma pixelns per längd enhet och klicka på OK. Därefter väljer du Bild, Färg, Gör sammansatt för att skapa en sammansatt bild av alla kanaler. På menyraden väljer du Analysera, Ange mått. Kontrollera Område, Centroid och Perimeter.I menyn Omdirigera till dropdown väljer du den Öppna filen och klickar sedan på OK. Gå till Bild, Färg, Kanalverktyg för att öppna kanalverktyget. Använd freehandmarkeringsverktyget för att rita en grov omkrets runt den region som är av intresse. Dubbelklicka på ovalverktyget på verktygsfältet för att aktivera markeringspenseln.Kontrollera att rutan Aktivera markeringspensel är markerad och klicka på OK. Med hjälp av markeringsborsten justerar du omkretsen så att den passar bäst den region av intresse som bäst passar regionen av intresse, tryck sedan på T på tangentbordet i hela det här området till pilen Y manager. Välj Analysera, Mät eller Tryck på M-tangenten så dyker fönstret Resultat upp. Kopiera och klistra in resultaten i ett datablad och spara informationen angående området.När du har kopierat området i den region som är av intresse baserar du informationen från fönstret Resultat genom att klicka på den och trycka på Backsteg-tangenten. Välj fönstret AVKASTNINGSHANTERAREN, välj ROI Trace och ändra namnet så att det matchar bildens namn genom att trycka på Byt namn. Klicka på OK sedan högerklicka på det nya namnet på ROI Trace och spara.Dubbelklicka på penselverktyget i verktygsfältet. Välj färg svart och Penselstorleken 10. Kontrollera att alternativet Paint på överlägg är avmarkerat.I TMEM119 kanal, försiktigt placera en svart prick på mitten av soma för varje TMEM119 positiva microglia. Placera en vit punkt på mitten av cellerna som inte är positiva för TMEM119. Upprepa samma procedur för alla celler som ingår i den region av intresse.Därefter väljer du Bild, Färg, Dela kanal, ett fönster för varje kanal kommer att visas. Identifiera kanalen som har punktanteckningarna och stäng de andra två fönstren. Om du vill omdirigera den nya bilden för delad kanal går du till Analysera, Ange mått.Välj den delade kanalbilden i rullgardinsmenyn omdirigering och klicka på OK. Välj sedan Bild, Typ, åttabitar. Gå till Bildjustera och välj Tröskelvärde. Justera skjutreglagen ända till vänster i båda staplarna.Detta kommer att lämna endast de svarta prickar som nu kommer att visas vit. Välj region av intresse i fönstret ROI Manager. Välj Analysera, Analysera partikel i menyraden.I textrutan för Storlek, mata in en till 20. Rutan för Pixel-enheter ska förbli omarkerad medan rutan som är för Visningsresultat, Sammanfatta och Lägg till i hanteraren ska vara markerad. Klicka på OK för att visa fönstret Sammanfattning som kommer att ge antalet poäng.Kopiera och klistra in den här informationen i databladet. Välj sedan plugin-program NND för att visa NND-fönstret. Varje nummer representerar avståndet varje microglia har till närmaste grannmikroglia.Kopiera och klistra in all denna information i databladet. Gå tillbaka till threshold-fönstret och justera det övre reglaget hela vägen till höger, vilket kommer att lämna alla vita prickar synliga, nu visas vitt. Välj Analysera, Analysera partikel för att visa fönstret Analysera partiklar dyker upp.Klicka på OK om du vill visa fönstret Sammanfattning som ger antalet poäng. Kopiera och klistra in den här informationen i databladet. Gå till ROI Manager och välj alla punkter.Högerklicka sedan och Spara med bildens namn. Detta gör det möjligt att spara alla punkter i en ZIP-fil. Öppna först 4DX-bildfilerna.Ett pop up-fönster kommer att visas med en fråga om bilderna ska öppnas i en stapel. Klicka på OK. Därefter väljer du Bild, Stackar, ZProject för att öppna fönstret Z Projection. Inkludera alla segment från det första till sista segmentet.Se till att Max-intensiteten är markerad under Projektionstyp och klicka på OK. Klicka på det nya fönstret som innehåller ZProject. Välj Bild, Färger, Dela kanaler och genomföra spåren på bilderna av IBA1-kanalen. Välj Analysera, Ange mått i menyraden.Kolla Området, Centroid och Perimeter. Markera den öppna filen och klicka på OK i rullgardinsmenyn Omdirigering till. Om du vill ställa in skalan manuellt baserat på en skala som är inpräntad på bilden väljer du verktyget Rak linje. Placera markören på vågens kant och samtidigt som du trycker på Skift-tangenten ritar du en linje så nära vågen som möjligt på bilden.Välj Analysera, Ange skala. Ett fönster kommer att dyka upp. Mata in rätt kända avstånd och längdenhet för att bestämma enheten Pixlar per längd och klicka på OK. För att mäta soma-storleken i IBA1-kanalen, rita en grov omkrets av soma med Freehand Selection-verktyget.Aktivera verktyget Markeringspensel genom att dubbelklicka på verktyget Oval i verktygsfältet. Kontrollera att rutan Aktivera markeringspensel är markerad och klicka på OK. Justera spårningen med hjälp av markeringspenseln så att den passar på bästa sätt soma. Zoomning i kommer att möjliggöra precision under det här steget.Därefter trycker du på T-tangenten för att lägga till soma-spårningen i ROI-hanteraren. Markera Analysera, Mät eller tryck på M-tangenten för att visa resultaten. Kopiera och klistra in dessa resultat på ett datablad.Gå till fönstret ROI Manager, välj region av intresse och ändra namnet så att det matchar bildens namn genom att trycka på Byt namn. Högerklicka på den omdöpta intresseregionen och klicka på Spara. Kontrollera att namnet anger att spårningen är för soma och spara filen.Om du vill mäta arborization-området i IBA1-kanalen väljer du först verktyget Polygonmarkering. Klicka på mikroglial process-extremiteten med verktyget för att starta polygonformen. Gå runt mikroglian genom att klicka på spetsarna på varje processremit för att bilda en polygon som bäst representerar det område som omfattas av mikroglialberedlingarna.När polygonen är klar, klicka på startpunkten för att stänga den. Sedan trycker du på T-tangenten för att lägga till spårningen till ROI Manager. Välj Analysera, Mät eller tryck på M-tangenten för att lägga till data i fönstret Resultat.Kopiera och klistra in dessa data på databladet. Om du vill spara informationen angående arborizationområdet går du till fönstret AVKASTNINGSHANTERAREN, väljer den region av intresse och ändrar namnet så att det matchar bildens namn genom att trycka på Byt namn. Högerklicka på den omdöpta intresseregionen och klicka på Spara.Kontrollera att namnet anger att spårningen är till för bersorization och spara filen. Denna studie beskrivs steg-för-steg arbetsflödet för immunofluorescerande co-färgning av IBA1 och TMEM119 och för analys av mikroglial densitet, distribution och morfologi samt av perifera myeloisk cell infiltration i mus hjärnvävnad. Fluorescensmikroskopi används för att avbilda co-märkning av mikroglia med IBA1 och TMEM119 i koronasektionen av dorsala hippocampus vid 20X förstoring.En lyckad färgning avslöjar mikroglial cell organ och deras fina processer. Färgningen möjliggör bestämning av mikroglial densitet och fördelning och för identifiering av mikrogliala kluster och infiltrera makrofager. Confocal mikroskopi används för att avbilda stegvis mikroglial berorization tracing förfarande vid 40X förstoring.Dessa representativa resultat visar IBA1 positiva och TMEM119 positiva microglia samt ett exempel på cellkroppen spårning. Det är viktigt att vara konsekvent när man räknar celler och att vara uppmärksam på båda signalerna av IBA1 och TMEM119. Denna teknik gör det möjligt för forskaren att identifiera regioner i hjärnan som påverkas av en viss stimulans som sedan kan studeras mer djupgående med kompletterande tekniker.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera perifera mononukleära blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Bedöma Retinal mikrogliaceller fagocytos<em&gt; In Vivo</em&gt; Med hjälp av en flödescytometri-baserad analys

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Lungsköljning av murina lungor Analysera infiltration av inflammatoriska celler

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Isolering, fixering och immunofluorescens avbildning av mus binjurarna

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Analys av SAMHD1-begränsning genom flödescytometri i humana myeloida U937-celler

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Separation av immuncellssubpopulationer i perifera blodprover från barn med infektiös mononukleos

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...