Name: immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain
Uploaded: 2019-10-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Nathalie Vernoux'a rehberlik ve deneylerdeki yardımları için minnettarız. Dr. Emmanuel Planel ve Serge Rivest'e floresan ve konfokal mikroskoplarını kullanmaları için de teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Meksika Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT; F.G.I), Fondation Famille-Choquette ve Centre thématique de recherche en neurosciences (TON; to K.P.), Fonds de Recherche du Québec - Santé (M.B.) ve Shastri Indo-Kanada Enstitüsü (K.B.'ye) yanı sıra Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'nden (NSERC) M.E.T. M.E.T.'ye bir Discovery bursu, Sağlık ve Terapide Nöroimmün Plastisite Kanada Araştırma Başkanı 'na (Tier II) sahiptir.

Tüm deneysel prosedürler, Kanada Hayvan Bakımı Konseyi ve Université Laval Hayvan Bakım Komitesi'ne uygun olarak Kurumsal Hayvan Etiği komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İmmünoboyama
<ol><li>Bir beyin atlası yardımıyla ilgi bölgesi (ROI) (yani, hipokampus) içeren üç fare beyin bölümleri seçin. Bölümleri plastik çok kuyulu bir tabağa yerleştirin ve üzerini 350 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile kaplayın (Tablo 1).<...

<ol>
	<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Milior, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractalkine+receptor+deficiency+impairs+microglial+and+neuronal+responsiveness+to+chronic+stress.">Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+Microglial+Cells+Are+Highly+Dynamic+Surveillants+of+Brain+Parenchyma+in+Vivo.">Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li><li>Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegeneration.">Microglia in neurodegeneration.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).</li><li>Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+across+the+lifespan:+from+origin+to+function+in+brain+development,+plasticity+and+cognition.">Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition.</a> The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Interactions+with+Synapses+Are+Modulated+by+Visual+Experience.">Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience.</a> PLoS Biology. 8 (11), (2010).</li><li>Jakovljevic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+NTPDase1/CD39+by+Reactive+Microglia+and+Macrophages+Is+Associated+With+the+Functional+State+During+EAE.">Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).</li><li>Taylor, A. M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+Disrupt+Mesolimbic+Reward+Circuitry+in+Chronic+Pain.">Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).</li><li>Poliani, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TREM2+sustains+microglial+expansion+during+aging+and+response+to+demyelination.">TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).</li><li>Lu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Tat-Induced+Microgliosis+and+Synaptic+Damage+via+Interactions+between+Peripheral+and+Central+Myeloid+Cells.">HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells.</a> PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).</li><li>Rodr&#237;guez, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+densities+of+resting+and+activated+microglia+in+the+dentate+gyrus+follow+senile+plaque+formation+in+the+CA1+subfield+of+the+hippocampus+in+the+triple+transgenic+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease.</a> Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).</li><li>Rasmussen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+activation+of+microglia+is+associated+with+neuronal+dysfunction+of+callosal+projecting+pathways+and+multiple+sclerosis-like+lesions+in+relapsing-remitting+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).</li><li>Walker, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+structural+remodelling+of+microglia+in+health+and+disease:+a+review+of+the+models,+the+signals+and+the+mechanisms.">Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).</li><li>Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Iba1+in+membrane+ruffling+and+phagocytosis+of+macrophages/microglia.">Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia.</a> Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wohleb, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+innate+immune+challenge+exaggerated+microglia+activation,+increased+the+number+of+inflammatory+CNS+macrophages,+and+prolonged+social+withdrawal+in+socially+defeated+mice.">Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).</li><li>Shemer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engrafted+parenchymal+brain+macrophages+differ+from+microglia+in+transcriptome,+chromatin+landscape+and+response+to+challenge.">Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+monocytes,+macrophages+and+dendritic+cells.">Development of monocytes, macrophages and dendritic cells.</a> Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).</li><li>Minogue, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+infiltrating+monocytes/macrophages+in+acute+and+chronic+neuroinflammation:+Effects+on+cognition,+learning+and+affective+behaviour.">Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour.</a> Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).</li><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+Mapping+Analysis+Reveals+That+Adult+Microglia+Derive+from+Primitive+Macrophages.">Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages.</a> Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways.">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).</li></ol>

Bu protokol iki kritik bölüme ayrılabilir: boyama ve analiz kalitesi. Boyama optimal değilse, mikroglial hücreleri yeterince temsil etmek için başarısız olacak, böylece yoğunluk, dağılım ve morfoloji ölçümleri etkileyen. Buna ek olarak, infiltrasyon periferik miyeloid hücrelerin oranı hafife alınabilir. Bu boyama protokolünün en iyi leştirilmiş bir sürümüdür, ancak en uygun olmayan görüntülere neden olabilecek çeşitli etkenler vardır. Hayvanın perfüzyonu bu protokole dahil edilmese de,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.
The&#160;name&#160;was&#160;corrected from:
Maude&#160;Bordelau
to:
Maude&#160;Bordeleau

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/60510/immunofluorescence-staining-using-iba1-tmem119-for-microglial-density">Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain</a>. An&#160;author&#160;name was&#160;updated.

Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Akut veya kronik olsun, nöroinflamasyon sıkı mikroglia etkilenir, beynin yerleşik makrofajlar. Mikroglianın immünoboyama yoluyla görselleştirilmesi, son derece erişilebilir bir teknik olan ışık mikroskobu kullanımı ile nöroinflamasyon çalışmaları için değerlidir. Homeostatik koşullarda, mikroglia genellikle örtüşmeyen, mozaik benzeri bir desen olarak dağıtılır. Onlar ramified süreçleri uzatmak küçük somassergilemek 1, bazen birbirlerine temas2. Mikroglial ramified süreçler dinamik beyin parankim anket, nöronlar ile etkileşim, diğer glial hücreler, ve normal fizyolojik koşullar sırasında kan damarları3. Mikroglia onları immünolojik görevleri gerçekleştirmek ve beyin ortamında değişikliklere yanıt sağlayan reseptörlerin bir cephanelik ile donatılmıştır, hücre ölümü, ya da doku hasarı. Buna ek olarak, özellikle sinaptik oluşum, bakım ve eleme4,5önemli fizyolojik fonksiyonlar uygulamak.
Mikroglia üzerinde kullanılan mevcut belirteçler arasında iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekül 1 (IBA1) en yaygın olarak kullanılanlardan biridir. IBA1, elektronmikroskobuile doğrulanan ince distal prosesler de dahil olmak üzere mikroglial morfolojinin olağanüstü görselleştirmesini sağlayan kalsiyum bağlayıcı bir proteindir 6. Bu araç mikroglial dönüşüm karakterize aracı olmuştur, eski olarak adlandırılan "aktivasyon", hayvan hastalığı modelleri geniş bir dizi7,8,9. Nöroinflamasyon varlığında, mikroglial yanıt içerir: hücresel yoğunluk artışı olarak tanımlanan mikrogliozis, bazen kümeleme neden dağılım değişiklikleri, hücre gövdesinin genişlemesi, yanı sıra kalınlaşma ve daha ameboid şekiller ile ilişkili süreçlerin kısalması10,11,12,13.
İmmünoboyama belirli belirteçlere karşı yönlendirilen antikorların bulunabilirliği ile sınırlıdır. Daha da önemlisi, IBA1 mikroglia ile değil, aynı zamanda beyin14infiltrasyon periferik makrofajlar ile ifade edilir. Beyin içinde IBA1-pozitif hücrelerin gözlem bu araştırma alanında mikroglia bir belirteç haline gelmiştir iken, periferik makrofaj infiltrasyonu çeşitli koşullar altında bildirilmiştir, hatta marjinal sağlıklı beyin15,16 ,17,18. Sonuç olarak, Tek başına IBA1 kullanımı mikroglia seçici görselleştirme izin vermez. Buna ek olarak, makrofajlar, beyne sızdıktan sonra yerleşik mikroglianın moleküler ve morfolojik özelliklerini benimseyerek farklılaşmayı engellerler 19. Bu, hem mikroglianın işlevini araştırırken hem de makrofajlara sızarken bir zorluk teşkil eder.
Mikroglia ve periferik makrofajlar farklı kökenlere sahip olmakla birlikte (örneğin, embriyonik sarık kesesi ve kemik iliği, sırasıyla20,21), iki hücre popülasyonunun beyinde farklı roller19. Bu nedenle, bu iki popülasyon arasında yoğunluklarını, dağılımlarını, morfolojilerini ve işlevlerini modüle edebilen invaziv manipülasyonlar (kemik iliği kimeraları veya parabiyoz) olmadan ayrım yapan yöntemler kullanmak çok önemlidir. TMEM119 sağlık ve hastalık koşulları arasında mikroglia özgü bir belirteç olarak ortaya çıkmıştır22. IBA1 ile birleştirildiğinde, bu belirteç tmem119-negatif ve IBA1-pozitif makrofajlar, infiltrasyon bu hücrelerin ayırt etmek için yararlı olur. Bu gelişimsel olarak düzenlenmiş olsa da, TMEM119 doğum sonrası gün 3 (P3) ve 6 (P6) gibi erken olarak ifade edilir, sürekli P10 ve P1422arasında yetişkin seviyelerine ulaşana kadar artan . IBA1 embriyonik gün 10.5 (E10.5)23gibi erken ifade edilir. Önerilen çift etiketleme protokolü bu iki popülasyonun doğum sonrası yaşam boyunca incelenmesinde yararlıdır.
Bu protokol mikroglia ve periferik makrofajlar arasında ayrımcılık sağlayan bir adım-adım immünboyama prosedürü sağlar. Ayrıca mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin kantitatif analizinin yanı sıra periferik makrofaj infiltrasyonunun analizini de açıklar. Mikroglia ve periferik makrofajların araştırılması kendi başına yararlı olmakla birlikte, bu protokol nöroinflamatuar fuayelerin lokalizasyonuna daha da olanak sağlar; böylece, tamamlayıcı (henüz, daha fazla zaman ve kaynak tüketen) tekniklerin kullanımı ile, araştırmak için belirli bölgeleri belirlemek için bir platform olarak hizmet vermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>A11011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolite 24 Well multidish</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>930186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>EMD Millipore Corporation</td>
			<td>2930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Nuceleic acid stain</td>
			<td>Invitrogen/Thermofisher</td>
			<td>MP 01306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Brush</td>
			<td>Art store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from coldwater fish skin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1254418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microslides positively charged</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse Anti-IBA1</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2PO4&#183;H2O</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPM306, SPM400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>SPD307, SPD600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaBH4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S642500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm-M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal Anti-TMEM119</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reciprocal Shaking bath model 25</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer hydrochloride</td>
			<td>BioShop Canada Inc.</td>
			<td>TRS002/TRS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence staining using iba1 and tmem119 for microglial density, morphology and peripheral myeloid cell infiltration analysis in mouse brain

Bu mikroglia çift görselleştirme ve fare beyin dokusunda makrofajlar infiltrasyon için bir protokoldür. TMEM119 (mikrogliayı seçici olarak etiketler), IBA1 ile birlikte (morfolojilerinin olağanüstü bir görselleştirmesini sağlar), yoğunluk, dağılım ve morfolojideki değişikliklerin araştırılmasına olanak tanır. Bu parametrelerin ölçülmesi, beynin yerleşik makrofajları olan mikroglianın oynadığı rollere ilişkin içgörüler sağlamada önemlidir. Normal fizyolojik koşullar altında, mikroglia düzenli olarak mozaik benzeri bir desen dağıtılır ve ramified süreçleri ile küçük bir soma mevcut. Bununla birlikte, çevresel faktörlere (travma, enfeksiyon, hastalık veya yaralanma) yanıt olarak, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfoloji hakarete bağlı olarak çeşitli şekillerde değiştirilmiştir. Ayrıca, açıklanan çift boyama yöntemi, IBA1 ekspresyonuna göre ve TMEM119 ile birlikte lokalizasyon olmadan beyindeki makrofajların görüntülenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım böylece mikroglia ve sızma makrofajlar arasında ayrımcılık sağlar, hangi sağlık ve hastalık çeşitli bağlamlarda beyin homeostaz onların farklı katılımı içine fonksiyonel anlayışlar sağlamak için gereklidir. Bu protokol, seçici belirteçlerin tanımlanması ile ilgili nöroimmünolojideki en son bulguları birleştirir. Aynı zamanda hem deneyimli nöroimmünolojistler hem de nöroimmünolojiyi projelere entegre etmek isteyen araştırmacılar için yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir.

Şekil 1, floresan mikroskopi ile 20x'te görüntülenmiş dorsal hipokampusun koronal bölümünde IBA1 ve TMEM119 kullanılarak mikroglianın ortak etiketlemesi gösterilmektedir. Başarılı bir boyama mikroglial hücre cisimlerini ve ince süreçlerini ortaya çıkarır (Şekil 1A−C). Bu boyama mikroglial yoğunluk ve dağılım belirlenmesi ve mikroglial kümelerin belirlenmesi sağlar (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain at JoVE

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Bu protokol, mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonunun analizine ek olarak, IBA1 ve TMEM119'un immünororesan costaining'i için adım adım iş akışını tanımlar.

Fare Beyninde Mikroglial Yoğunluk, Morfoloji ve Periferik Miyeloid Hücre Infiltrasyonu Analizi için IBA1 ve TMEM119 Kullanılarak İmmünofloresanS Boyama

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Bu protokol, mikroglialeke nasıl, kantitatif yoğunluk ve morfoloji analizi gerçekleştirmek yanı sıra beyne makrofaj infiltrasyon ölçmek için nasıl gösterecektir. Bu teknik, araştırmacının mikroglia dağılımı ve morfolojisindeki değişiklikleri nicel bir şekilde ölçmesine ve mikroglianın makrofajlardan ayırt edilmesine olanak sağlar Bu analiz protokolü, anti-IBA1 ve anti-TMEM119 antikorlarının mevcut olduğu mikroglial dağılım ve morfolojideki değişiklikleri ölçmek için diğer hayvan modellerine kolayca uygulanabilir. Hücre sayımlarının ve izlerinin deneysel duruma göre izlenmesi ve bu işlemin gerçekleştirilme şeklinde tutarlı olması tavsiye edilir.Bu yordamı başlatmak için, en yakın komşu mesafesi eklentisi yüklü olan Fiji veya ImageJ gibi bir görüntü işleme programı açın. Ölçek dosyanın meta verilerinde yer alan ve meta verilerden otomatik olarak ayarlanamazsa 20X görüntüyü açın. Menü çubuğunda Analiz et, Ölçeği Ayarla'yı seçin ve ardından doğru bilgileri girin.Görüntüyü nislinüzerine basılmış bir skalaya göre ölçeği el ile ayarlamak için Düz Çizgi aracını seçin. İmleci ölçeğin kenarına yerleştirin ve Shift tuşuna basarken görüntüdeki ölçeğe mümkün olduğunca yakın bir çizgi çizin. Analiz et, ölçek ayarla'yı seçin.Bir pencere açılır ve pikselin uzunluk birimi başına belirlemek için bilinen doğru mesafeyi ve uzunluk birimini koyar ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, tüm kanalların bileşik görüntüsünü oluşturmak için Resim, Renk, Bileşik Oluştur'u seçin. Menü çubuğunda Analiz et, Ölçümleri Ayarla'yı seçin. Bölge, Centroid ve Çevre kontrol edin.AçılanA Yönlendir menüsünde, Dosyayı Aç'ı seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Kanal aracını açmak için Görüntü, Renk, Kanal Aracı'na gidin. İlgi alanı etrafında kaba bir çevre çizmek için Freehand Seçimi aracını kullanın. Seçim Fırçası aracını etkinleştirmek için araç çubuğundaki Oval aracı çift tıklatın.Seçim Fırçasını Etkinleştir kutusunun işaretlandığından emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Seçim fırçasını kullanarak, çevreyi ilgi alanına en uygun şekilde ayarlayın ve ardından y yöneticisine ok lamak için bu alan daki klavyedeki T tuşuna basın. Analiz et, Ölç veya M tuşuna bas' seçeneğini belirleyin ve Sonuçlar penceresi açılır. Sonuçları kopyalayıp bir veri sayfasına yapıştırın ve alanla ilgili bilgileri kaydedin.İlgi alanının alanını kopyaladıktan sonra, Sonuçlar penceresindeki bilgileri üzerine tıklayarak ve Backspace tuşuna basarak temela savuruyorsunuz. YG Yöneticisi penceresini seçin, YG İzleme'yi seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Tamam'ı tıklatın ve sonra Yatırım Getirisi İzleme'nin yeni adını sağ tıklatın ve kaydedin.Araç çubuğundaki Fırça aracını çift tıklatın. Siyah rengi ve Fırça boyutunu 10 olarak seçin. Bindirme üzerine Paint seçeneğinin işaretsiz olduğundan emin olun.TMEM119 kanalında, her TMEM119 pozitif mikroglia için soma'nın merkezine dikkatlice siyah bir nokta yerleştirin. TMEM119 için pozitif olmayan hücrelerin merkezine beyaz bir nokta yerleştirin. İlgi alanında bulunan tüm hücreler için aynı yordamı yineleyin.Ardından, Görüntü, Renk, Split Channel'ı seçin, her kanal için bir pencere görüntülenir. Nokta ek açıklamaları olan kanalı tanımlayın ve diğer iki pencereyi kapatın. Yeni bölünmüş kanal görüntüsünü yeniden yönlendirmek için Analiz et, Ölçümleri Ayarla'ya gidin.Yeniden Yönlendir menüsünde, Kanal Görüntüsünü Böl'ü seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından Resim, Tür, sekiz bit'i seçin. Görüntü Ayarla'ya gidin ve Eşik'i seçin. Her iki çubukta da kaydırıcıları sola doğru ayarlayın.Bu şimdi beyaz görünecektir sadece siyah nokta bırakacaktır. YG Yöneticisi penceresinde ilgi çekici bölgeyi seçin. Menü çubuğunda, Parçacığı Analiz Et, Analiz Et'i seçin.Boyut metin kutusunda, 1'den 20'ye kadar giriş. Piksel birimlerinin kutusu işaretsiz kalırken, Görüntü sonuçları, Özetle ve Yöneticiye Ekle kutusu işaretlenmelidir. Puan sayısını verecek Özet penceresini görüntülemek için Tamam'ı tıklatın.Bu bilgileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Ardından, NND penceresini göstermek için eklentiler NND'yi seçin. Her sayı, her mikroglianın en yakın komşu mikrogliaya olan uzaklığı temsil eder.Tüm bu bilgileri veri sayfasına kopyalayıp yapıştırın. Eşik penceresine geri dön ve üst kaydırıcıyı sağa doğru ayarlayın, bu da tüm beyaz noktalarını görünür bırakarak şimdi beyaz görünmesini sağlar. Parçacıkları Analiz Et penceresini görüntülemek için Analiz Et, Parçacığı Analiz Et'i seçin.Puan sayısını sağlayan Özet penceresini göstermek için Tamam'ı tıklatın. Bu bilgileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Yatırım Getirisi Yöneticisi'ne gidin ve tüm noktaları seçin.Ardından sağ tıklayın ve resmin adı ile kaydedin. Bu, bir ZIP dosyasındaki tüm noktaların kaydedilmesine olanak sağlar. İlk olarak, 4DX resim dosyalarını açın.Görüntülerin yığında açılıp açılmaması gerektiğini soran bir açılır pencere görüntülenir. Tamam'ı tıklatın. Ardından, Z Projeksiyon penceresini açmak için Resim, Yığınlar, ZProject'i seçin. İlk dilimden son dilime kadar olan tüm dilimleri ekleyin.Maksimum Yoğunluğun Projeksiyon Türü altında seçildiğinden emin olun ve Tamam'ı tıklatın. ZProject içeren yeni pencereyi tıklatın. Görüntü, Renkler, Split Kanalları seçin ve IBA1 kanalının görüntülerindeki izleri iletin. Menü çubuğunda, Ölçümleri Ayarla'yı seçin.Bölgeyi, Centroid'i ve Çevreyi kontrol edin. Yeniden Yönlendir menüsünde, dosyayı açın ve Tamam'ı tıklatın. Görüntüyü nislinüzerine basılmış bir skalaya göre ölçeği el ile ayarlamak için Düz Çizgi aracını seçin. İmleci ölçeğin kenarına yerleştirin ve Shift tuşuna basarken görüntüdeki ölçeğe mümkün olduğunca yakın bir çizgi çizin.Analiz et, ölçek ayarla'yı seçin. Bir pencere açılır. Uzunluk birimi başına Pikselleri belirlemek için bilinen doğru mesafeyi ve uzunluk birimini girdiniz ve Tamam'ı tıklatın. IBA1 kanalındaki soma boyutunu ölçmek için Freehand Selection aracıyla soma'nın kaba bir çevresini çizin.Seçim Fırçası aracını etkinleştirmek için araç çubuğundaki Oval aracı çift tıklatın. Seçim Fırçasını Etkinleştir kutusunun işaretlandığından emin olun ve Tamam'ı tıklatın. Seçim Fırçası'nı kullanarak, soma'ya en iyi uyacak şekilde izlemeyi ayarlayın. Yakınlaştırma, bu adım sırasında hassasiyet sağlar.Ardından, Soma izini YG Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. Sonuçları görüntülemek için Analiz Et, Ölç veya M tuşuna bas' seçeneğini belirleyin. Bu sonuçları kopyalayın ve bir veri sayfasına yapıştırın.YG Yöneticisi penceresine gidin, ilgi çekici bölgeyi seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Yeniden adlandırılmış ilgi alanı bölgesine sağ tıklayın ve Kaydet'i tıklatın. Adın izlemenin soma için olduğunu belirttiğinden emin olun ve dosyayı kaydedin.IBA1 kanalındaki ağaçlandırma alanını ölçmek için önce Çokgen Seçimi aracını seçin. Çokgen şeklini başlatmak için aracı ile mikroglial proses ekstremite tıklayın. Mikroglia etrafında en iyi mikroglial arborizations tarafından kapsanan alanı temsil eden bir poligon oluşturmak için her süreç ekstremite uçlarını tıklayarak gidin.Çokgen tamamlandığında, kapatmak için başlangıç noktasına tıklayın. Ardından, İzlemeyi YG Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. Sonuçları Pencereye veri eklemek için Analiz Et, Ölç veya M tuşuna basın.Bu verileri kopyalayın ve veri sayfasına yapıştırın. Ağaçlandırma alanıyla ilgili bilgileri kaydetmek için YG Yöneticisi penceresine gidin, ilgi alanını seçin ve Yeniden Adlandır'a basarak görüntünün adını eşleşecek şekilde değiştirin. Yeniden adlandırılmış ilgi alanı bölgesine sağ tıklayın ve Kaydet'i tıklatın.Adın izlemenin ağaçlandırma için olduğunu belirttiğinden emin olun ve dosyayı kaydedin. Bu çalışmada, IBA1 ve TMEM119 immünofloresan co-boyama ve mikroglial yoğunluk, dağılım ve morfolojinin yanı sıra fare beyin dokusunda periferik miyeloid hücre infiltrasyonu analizi için adım adım iş akışı açıklanmıştır. Floresan mikroskobu, 20X büyütmede dorsal hipokampusun koronal bölümünde IBA1 ve TMEM119 kullanılarak mikroglianın ortak etiketlemesini görüntülemek için kullanılır.Başarılı bir boyama mikroglial hücre organları ve ince süreçleri ortaya koymaktadır. Boyama mikroglial yoğunluk ve dağılım belirlenmesi ve mikroglial kümelerin belirlenmesi ve makrofajlar infiltrasyon için izin verir. Konfokal mikroskopi 40X büyütme de adım adım mikroglial arborization izleme prosedürü görüntü için kullanılır.Bu temsili sonuçlar IBA1 pozitif ve TMEM119 pozitif mikroglia yanı sıra hücre vücut izleme bir örnek göstermektedir. Hücreleri sayarken tutarlı olmak ve IBA1 ve TMEM119'un her iki sinyaline de dikkat etmek önemlidir. Bu teknik, araştırmacının beynin belirli bir uyarıcıdan etkilenen bölgelerini belirlemesine olanak tanır ve bu da daha sonra tamamlayıcı tekniklerle daha derinlemesine incelenebilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Yalıtım, fiksasyon ve fare böbreküstü bezlerinin ayirt görüntüleme

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...