Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

نشكر السيدة باتريزيا إميليو ، وندرا نوتو ، وكريج فينويك ، وماتثيو بيرو لكونها دائما متاحه لمناقشه عملنا وجميع الناس في مختبر الإيدز المناعي لمساعدتهم التقنية الثمينة. نود أيضا ان نشكر جون وهارون Weddle من شركه VSB المرتبطة التي ساهمت مع الاعمال الفنية الممتازة. وأخيرا ، العديد من الشكر الخاص لجميع المرضي ، الذين بدونهم هذا العمل لم يكن ممكنا. ولم يتلق هذا العمل اي منحه محدده من اي وكاله تمويل.

تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للمركز الجامعي المستشفى فودويس (CHUV).
1-الاصابه بالخلايا أحاديه النواة للدم الطرفية (Pbmcmcmcmcmcmcmcmccm1) مع الفيروسHXB2 سلاله
<ol><li>
اليوم الأول: تحفيز البنك
	<ol>
<li>عزل Pbmmmmcmcate من معطف المتبرع صحية بوفي.</li>
		<li>العد...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

في هذا التقرير ونحن وصف الفحص RT حبلا محدده تطبيقها علي الكشف عن الجيش النيبالي الريبي في الخلايا المعزولة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية-1. حدوث فتيله غير محدده اثناء RT يعوق الكشف عن النسخ الحمض الريبي النيبالي مع القطبية الحق ، مما يؤدي إلى سوء تفسير النتائج. وقد وضعت المج?...

الجينات البروتين انتيسنس (ASP) هو اطار القراءة المفتوحة (ORF) الموجود علي حبلا السلبية من نوع فيروس نقص المناعة البشرية 1 (الفيروس-1) الظرف (البيئية) الجينات ، التي تغطي تقاطع gp120/gp411. وعلي مدي السنوات الثلاثين الماضية ، أظهرت عده تقارير ان الجينات المصابة بفيروس نقص المناعة الوراثية قد كتبت وترجمت في الواقع2و3و4و5و6و7و8و9. علي الرغم من ان النصوص المضادة للتحسس ASP قد تميزت تماما في المختبر, حتى وقت قريب المعلومات حول الإنتاج الفعلي من الجيش النيبالي الريبي في المرضي كان لا يزال مفقودا.
تسلسل ASP عكس ومكمله إلى البيئية. يمثل هذا عقبه رئيسيه عند محاولة الكشف عن النسخ المستنسخة ل ASP. تستخدم أساليب النسخ العكسي القياسية-تفاعل البلمره المتسلسل (RT-PCR) الإشعال المضاد للتحسس الخاص بالجينات لتوليف DNAs التكميلية (cDNAs) القطبية الصحيحة. هذا النهج ، ومع ذلك ، لا يسمح لتحديد التوجه (الشعور أو انتيسنس) من النموذج الاولي الحمض الريبي النيبالي ، منذ الحمض الريبي النيبالي أو حلقات يمكن رئيس الوزراء RT في كلا الاتجاهين في غياب الإشعال10، وهي ظاهره تعرف باسم rt الذاتي فتيله. معظم المحققين ASP الجانبية مشكله RT الذاتي فتيله باستخدام الإشعال الموسومة مع تسلسل التي لا تتعلق بفيروس نقص المناعة الشخصية-111,12. ومع ذلك ، فان هذه الاستراتيجية لا تقضي علي حدوث هذه الظاهرة ، وقد تؤدي إلى احتمال ترحيل cDNAs غير محدده إلى الطراز PCR11.
وقد قمنا مؤخرا بتطوير رواية RT-PCR الخاصة الجديدة لدراسة الحمض الريبي المضاد للتحسس ، وقد استخدمناه للكشف عن الحمض الريبي النيبالي في فوج من سته مرضي مصابين بفيروس نقص المناعة المناعية ، كما هو مبين في الجدول 1. وقد سبق ان نشر أنطونيو مانكارييلا وآخرون13الاجراء الموصوف أدناه. في بروتوكولنا ، ونحن تجنب إنتاج cDNAs غير محدده بواسطة نهج مزدوج. أولا ، ونحن القضاء علي الهياكل الثانوية الجيش النيبالي الريبي عن طريق التخلص من الجيش النيبالي الريبي في درجه حرارة عاليه (94 درجه مئوية) ، وثانيا ، ونحن عكس نسخ الحمض الريبي النيبالي ASP باستخدام التمهيدي المحددة ASP الحيوية وتقارب-تنقيه cDNA الناتجة. من خلال هذا النهج ، ونحن قادرون علي تضخيم فقط لدينا الهدف cDNA ، لان غيرها من المنتجات RT غير محدده اما منعت من ان تتولد (ارتفاع درجه حرارة المسخ من RNA) أو القضاء عليها قبل PCR (التقارب تنقيه).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

في الفيروسات الرجعية, وقد وصفت النسخ انتيسنس في كل من فيروس نقص المناعة البشرية نوع 1 (فيروس العوز المناعي البشري-1) والإنسان T-اللمفاوية الفيروس 1 (HTLV-1). في فيروس نقص المناعة الذاتية-1 ، ويقع الجينات المضادة للتحسس ASP البروتين علي حبلا السلبية من البيئية ، في اطار القراءة-2 ، التي تغطي تقاطع gp120/gp41. في اتجاه المعني ، تتداخل نهاية 3 ' من ASP فتح اطار القراءة مع gp120 المناطق المتغيرة بشكل مفرط V4 و V5. وقد أحبطت دراسة الجيش النيبالي الريبي من قبل ظاهره المعروفة باسم RT-فتيله الذاتي, حيث الهياكل الثانوية RNA لديها القدرة علي رئيس الوزراء RT في غياب التمهيدي محدده, توليد cDNAs غير محدده. الاستخدام المشترك لل RNA عاليه المسخ مع الإشعال العكسي بيوتينيلاتيد في رد فعل RT ، جنبا إلى جنب مع تنقيه تقارب cDNA علي الخرز المغناطيسي المغلفة العقديات ، سمح لنا بشكل انتقائي تضخيم الحمض الريبي النيبالي في الخلايا التائية المشتقة من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب-1. طريقتنا هي منخفضه التكلفة نسبيا ، بسيطه لأداء ، موثوق بها للغاية ، ويمكن استنساخها بسهوله. وفي هذا الصدد ، فانه يمثل أداه قويه لدراسة النسخ المضادة للتحسس ليس فقط في فيروس نقص المناعة الطبيعية-1 ولكن أيضا في النظم البيولوجية الأخرى.

درجه الحرارة العالية RNA المسخ إلى جانب تنقيه التقارب من الحمض الحيوي الحيوي ويمنع التضخيم من المنتجات غير محدده ASP خلال PCR في PBMCs المصابة في المختبر وفي الخلايا المعزولة من المرضي. وقدثبت الذاتي فتيله ان يحدث اثناء النسخ العكسي لل rnas انتيسنس10،14،<sup...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

يمكن لدبابيس الشعر RNA والحلقات تعمل كالاشعال للنسخ العكسي (RT) في غياب الإشعال تسلسل محدده ، تتداخل مع دراسة المستنسخات انتيسنس متداخلة. وقد وضعنا تقنيه قادره علي تحديد الحمض الريبي النيبالي محدده حبلا ، ونحن قد استخدمت لدراسة فيروس نقص المناعة الذاتية-1 البروتين انتيسنس ASP.

الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية النوع 1 (HIV-1) البروتين انتيسنس (ASP) الحمض الريبي النيبالي المستنسخات في المرضي التي كتبها RT-PCR الخاصة

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

ولا تسمح الـ RT-PCRs التقليدية بالتمييز بين تسلسل المعنى والتسلسلات المضادة للحس عند استخدامها للكشف عن الحمض النووي الرنا المشفّر بواسطة الجينات المتداخلة. هذا البروتوكول يجعل من الممكن للكشف عن RNAs المضادة للحس على وجه التحديد. استخدام الشعيرات biotynylated جنبا إلى جنب مع ارتفاع درجات حرارة DENaturation RNA يسمح لتضخيم مضادة للحس cDNAs، ومنع تشكيل منتجات RT غير محددة.لقد استخدمنا هذه الطريقة لإثبات أن ASP إما كـ RNA المضادة للحس أو السلائف البروتينية، انها مستضد فيروس نقص المناعة البشرية الجديد، فإنه يحتمل أن يكون هدفا فيروس نقص المناعة البشرية رواية للعلاج. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام، حيث يمكن الكشف عن RNAs المضادة للحس من الجينات المتداخلة. ابدأ بتصميم التمهيديات المحددة للمريض باستخدام تسلسل الحمض النووي المؤيد للفيروسات الداخلية لـ PanASP التمهيدية.بعد ذلك ، كمي الحمض النووي الريبي والقضاء على تلوث الحمض النووي عن طريق معالجة العينات مع DNase. نقل بين 0.1 و ميكروغرام واحد من مجموع RNA إلى الآبار المناسبة على 96 بئراً من الألواح PCR. ثم قم بإعداد النسخ العكسي ، أو رد فعل RT ، وفقًا لاتجاهات المخطوطات.إعداد ضوابط RT الذاتية عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من المياه الحرة النوى بدلا من التمهيدي عكس ASP. وضع لوحة في الترموسل والحرارة الجيش الملكي النيبالي إلى 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم تبريده على الفور في الماء المثلج لمدة دقيقة واحدة على الأقل.إعداد خليط التفاعل في أنبوب 1.5 ملليلتر كما هو موضح في مخطوطة النص، ثم نقل 17.5 ميكرولترات إلى كل من الآبار التي تحتوي على RNA. يجب إجراء denaturation RNA في 94 درجة مئوية. وبدون التشبع الكلي بالتهريب، قد تحدث توليفات من المنتجات غير المحددة من الحمض النووي الريبي الحس، مما يؤدي إلى تضخيم الحمض النووي الريبي غير المحدد.اخلط محتويات الآبار بلطف ويحضن الصفيحة عند درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. ثم، تعطيل ردود الفعل عن طريق تسخين لوحة إلى 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إعداد لتر واحد من 2X الغسيل ومخزن ملزم وفقا لاتجاهات المخطوطات وتصفية الحل.المقبل, إعداد 50 ملليلتر من 1X الغسيل ومخزن ملزم باستخدام المياه الصف PCR. نقل العدد المناسب من الخرز المغناطيسي streptavidin-مترافق إلى أنبوب 1.5 ملليلتر ثم غسلها عن طريق إضافة حجم متساو من 2X الغسيل ومخزن ملزم ودوامة الأنبوب لمدة 15 ثانية. ضع الأنبوب في رف فصل مغناطيسي واحتضانه لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم، بعناية إزالة افرات دون إزعاج الخرز وإضافة نفس حجم الغسيل 2X ومخزن ملزم كما الحجم الأولي من الخرز. دوامة الخرز لمدة 30 ثانية ونقل 10 ميكرولترات من التعليق إلى عدد مناسب من 1.5 ملليلتر أنابيب. ضع الأنابيب في رف الفصل المغناطيسي وحضنها لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم، والتخلص من عظمى وإضافة 50 ميكرولترات من 2X الغسيل ومخزن ملزم. إضافة 50 ميكرولترات من سي نا biotynylated إلى الأنابيب المقابلة مع الخرز واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في حين تناوب بلطف. بعد الحضانة، ضع الأنابيب على رف الفصل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق ثم غسل الخرز مع 200 ميكرولترات من 1X الغسيل والموانع المؤقتة الملزمة، تليها حضانة لمدة ثلاث دقائق على رف الفصل.تجاهل المابير وكرر الغسيل مرتين. ثم، resuspend الخرز في 10 ميكرولترات من المياه الصف PCR. إعداد حجم مناسب من PCR ماجستير ميكس وفقا لاتجاهات المخطوطة.اخلطه جيداً و سرعان ما يدور عليه، ثم نقل 49 ميكرولترات لكل بئر إلى لوحة PCR 96 بشكل جيد. دوامة بعناية الأنابيب مع cDNA المنقى لمدة 15 ثانية وإضافة ميكرولتر واحد من التعليق إلى الآبار المقابلة. تشغيل PCR وفصل المنتجات على جل agarose 1٪.قطع العصابات من هلام واستنساخ المنتجات المكبوخة في PCR 2.1 plasmid. ثم تسلسل المستنسخين وتحليل كل تسلسل. تم تنفيذ ردود الفعل RT الأولية مع التمهيدي العادي غير biotynylated المضادة للحس وأسفرت عن التضخيم الناجح ل ASP.ومع ذلك ، تم تضخيم نطاق من نفس الوزن الجزيئي والضوابط ناقص التمهيدي. لتجاوز هذه المشكلة، تم تسمية التمهيدي المضادة للحس محددة مع biotyn وcDNA المضادة للحس الناتجة تم تنقيتها قبل PCR. وهذا ما جعل من الممكن تضخيم تسلسل ASP مع انخفاض التلوث بشكل كبير من cDNA غير محددة في التمهيدي ناقص الضوابط.وقد تحقق المزيد من التحسين لهذه الطريقة عن طريق التكتّن الكامل للرنا في 94 درجة مئوية قبل RT، تليها التبريد الفوري على الماء المثلج، مما أدى إلى تضخيم فعال لـ النطاق ASP ولا توجد منتجات غير محددة. تم قياس حركية RNA ASP وخلايا CD4 معزولة عن ثلاثة أشخاص إيجابية لفيروس نقص المناعة البشرية مع viremia يمكن الكشف عنها وغياب العلاج بعد التحفيز مع CD3/CD28 المضادة. وكان من الممكن أيضا تحديد كمية من RNA ASP في المرضى الذين يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات القهقرية، مع viremia غير قابلة للكشف.في اثنين من أصل ثلاثة مرضى، تم الكشف عن RNA ASP في مستويات منخفضة في ثلاثة إلى خمسة أيام بعد التحفيز. تم تحليل اثنين من المرضى ل ASP و RNAs env، واحد غير المعالجة وواحد عولج. بالنسبة للمريض غير المعالج، يمكن الكشف عن كل من الرنا.بالنسبة للمريض المعالج ، كان ASP والإنف بالكاد يمكن اكتشافهما بعد عدة أيام من التحفيز. عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن denaturation خطي RNA بحيث يتم تدمير الهياكل الثانوية قادرة على RT رئيس. في حين أن غسل الخرز يتدفق بعيدا cDNAs غير biotynylated.بعد تنقية cDNAs مع قطبية الصحيح، يمكن إجراء qPCR لتحليل التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، يمكن استنساخ الحمض النووي الموحد أيضاً واستخدامها في تحليل التسلسل. هذه الطريقة تسمح لدراسة الجينات المتداخلة في الاتجاه المعاكس، وقد تكون مفيدة في توضيح التنظيم والعوامل المسببة للأمراض من البكتيريا والأمراض المرتبطة بالفيروس بما في ذلك بعض أنواع السرطان.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

تحليل إنهاء النسخ عن طريق النسخ على تشغيل (TRO) نهج BrUTP حبلا محددة

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

اختبار لتحديد كمية البروتين-RNA الربط في البكتيريا

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...