Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Vi takker Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick og Matthieu Perreau for altid at være til rådighed for at diskutere vores arbejde og alle de mennesker i laboratoriet af AIDS immunopathogenesis for deres dyrebare tekniske bistand. Vi vil også gerne takke John og Aaron Weddle fra VSB Associated Inc., der bidrog med fremragende kunst. Endelig mange særlig tak til alle de patienter, uden hvem dette arbejde ikke ville have været muligt. Dette arbejde modtog ikke noget specifikt tilskud fra et finansierings agentur.

Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse for Centre hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. infektion af mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) med HIV-1HXB2 -stamme
<ol><li>
Dag 1: stimulering af PBMCs
	<ol>
<li>Isoler PBMCs fra en sund donor Buffy coat.</li>
		<li>Tælle og resuspendere PBMCs i en koncentration på 1x106/ml i komplet Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium indeholdende 10% fø...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

I denne rapport beskriver vi en streng specifik RT-analyse, der anvendes til påvisning af ASP-RNA i CD4 + T-celler isoleret fra personer, der er inficeret med HIV-1. Forekomsten af ikke-specifik priming under RT hæmmer påvisning af RNA-udskrifter med den rigtige polaritet, hvilket fører til fejlfortolkning af resultaterne. Tidligere grupper har udviklet flere strategier, der har til formål at forhindre primer-uafhængig cDNA-syntese under RT-reaktionen. Tagging af den omvendte primer ved 3 ' ende med sekvenser, der ...

Antisense protein (ASP) genet er en åben læse ramme (ORF), der er placeret på den negative del af humant immundefektvirus type 1 (HIV-1)-genet (ENV), der spænder overkrydset gp120/gp411. I løbet af de sidste 30 år har flere rapporter vist, at hiv ASP-genet faktisk er transskriberet og oversat2,3,4,5,6,7,8,9. Selvom ASP antisense udskrifter er blevet fuldt karakteriseret in vitro, indtil for nylig oplysninger om den faktiske produktion af ASP RNA hos patienter stadig manglede.
Rækkefølgen af ASP er omvendt og komplementær til env. Dette udgør en stor forhindring, når du forsøger at registrere udskrifter for ASP. Standard reverse transkription-polymerase kædereaktion (RT-PCR) metoder bruger gen-specifikke antisense primere til at syntetisere komplementære DNAs (cDNAs) af den rigtige polaritet. Denne tilgang tillader dog ikke at bestemme retningen (Sense eller antisense) af den oprindelige RNA-skabelon, da RNA-Hårnåle eller sløjfer kan Prime rt i begge retninger i fravær af primere10, et fænomen kendt som rt Self-Priming. De fleste ASP-efterforskere undgik problemet med RT-selv priming ved hjælp af primere Tagged med sekvenser, der ikke er relateret til HIV-111,12. Denne strategi eliminerer imidlertid ikke forekomsten af fænomenet og kan føre til potentiel fremførsel af ikke-specifikke Cdna'er i PCR11.
Vi har for nylig udviklet en ny streng specifik RT-PCR-analyse til studiet af antisense RNA, og vi har brugt det til påvisning af ASP-RNA i en kohorte af seks HIV-inficerede patienter, som vist i tabel 1. Den nedenfor beskrevne fremgangsmåde er tidligere blevet offentliggjort af Antonio Mancarella et al.13. I vores protokol undgår vi produktion af ikke-specifikke cDNAs ved en dobbelt tilgang. For det første fjerner vi RNA-sekundære strukturer ved at denaturere RNA ved høj temperatur (94 °C), og for det andet omskriver vi ASP-RNA ved hjælp af en biotinyleret ASP-specifik primer og affinitet-renser det resulterende cDNA. Ved denne fremgangsmåde er vi i stand til kun at forstærke vores mål-cDNA, da andre ikke-specifikke RT-produkter enten forhindres i at blive genereret (høj temperatur denaturering af RNA) eller elimineres før PCR (affinitets rensning).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

I retrovira er antisense transkriptionen blevet beskrevet i både humant immundefektvirus type 1 (HIV-1) og humant T-lymfotropic virus 1 (HTLV-1). I HIV-1 er antisense protein ASP-genet placeret på den negative del af env, i læse ramme-2, der spænder overkrydset gp120/gp41. I Sense-retningen overlapper den 3 ' ende ASP-åbne læse ramme med gp120 hypervariable-områder v4 og v5. Studiet af ASP-RNA er blevet modstået af et fænomen kendt som RT-Self-Priming, hvorved RNA sekundære strukturer har evnen til at prime RT i fravær af den specifikke primer, genererer ikke-specifikke cDNAs. Den kombinerede anvendelse af høj RNA-denaturering med biotinylerede omvendte primere i RT-reaktionen sammen med affinitets rensning af cDNA på streptavidin-belagte magnetiske perler har gjort det muligt for os selektivt at forstærke ASP-RNA i CD4 + T-celler afledt af personer inficeret med HIV-1. Vores metode er relativt lave omkostninger, enkel at udføre, meget pålidelig og let reproducerbar. I denne henseende, det repræsenterer et effektivt redskab til undersøgelse af antisense transkriptionen ikke kun i HIV-1, men også i andre biologiske systemer.

Høj temperatur RNA denaturering koblet til affinitet oprensning af biotinyleret cDNA forhindrer forstærkning af ikke-specifikke ASP-produkter under PCR i PBMCs inficeret in vitro og i CD4 + T-celler isoleret fra patienter. RT Self-Priming har vist sig at forekomme under reverse transkription af antisense RNAs10,14,15,16,17. For at forhindre dette f?...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA Hårnåle og sløjfer kan fungere som primere for reverse transkription (RT) i fravær af sekvens-specifikke primere, forstyrrer studiet af overlappende antisense udskrifter. Vi har udviklet en teknik, der kan identificere streng-specifik RNA, og vi har brugt det til at studere HIV-1 antisense protein ASP.

Påvisning af humant immundefekt virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA-transskriptioner hos patienter med streng specifik RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Konventionelle RT-PCR giver ikke mulighed for forskelsbehandling mellem sanse- og antisanssekvenser, når de anvendes til at detektere RNA'er, der er kodet af overlappende gener. Denne protokol gør det muligt at opdage specifikt anti-sense RNA'er. Brugen af en biotynylated primere sammen med høje RNA denatureringstemperaturer giver mulighed for forstærkning af anti-sense cDNAs, forhindrer dannelsen af ikke-specifikke RT-produkter.Vi har brugt denne metode til at påvise, at ASP enten som en RNA anti-sense eller et protein forløber, det er en ny HIV antigen, gør det potentielt en ny HIV mål for behandling. Denne metode kan anvendes på ethvert system, hvor anti-sense RNA'er fra overlappende gener kan påvises. Start med at designe patientspecifikke primere ved hjælp af den pro-virale DNA-sekvens internt til PanASP primere.Dernæst kvantificere RNA og fjerne DNA-kontaminering ved at behandle prøver med DNase. Overfør mellem 0,1 og et mikrogram total RNA i de relevante brønde på en 96 brønd PCR plade. Derefter oprette den omvendte transskription, eller RT reaktion, i henhold til manuskript retninger.Forbered de endogene RT-kontroller ved at tilføje fem mikroliter nukleasefrit vand i stedet for ASP omvendt primer. Sæt pladen i termocyren og varm RNA'et op på 94 grader Celsius i fem minutter. Derefter straks afkøles i isvand i mindst et minut.Forbered reaktionsblandingen i et 1,5 milliliterrør som beskrevet i tekstmanuskriptet, og overfør derefter 17,5 mikroliter til hver af RNA'et, der indeholder brønde. RNA-denatureringen skal udføres ved 94 grader Celsius. Uden total denaturering kan der forekomme synteser af ikke-specifikke produkter fra sense RNA, hvilket fører til forstærkning af ikke-specifikke cDNA'er.Bland indholdet af brøndene forsigtigt og inkuber pladen ved 55 grader Celsius i 60 minutter. Derefter inaktivere reaktionerne ved at opvarme pladen til 70 grader Celsius i 15 minutter. Forbered en liter 2X vask og binding buffer i henhold til manuskript retninger og filtrere løsningen.Derefter forberedes 50 milliliter 1X vask og bindingsbuffer ved hjælp af PCR-vand. Overfør et passende antal streptavidin-konjugerede magnetiske perler til et 1,5 milliliterrør, og vask dem derefter ved at tilsætte et tilsvarende volumen på 2X vask og bindingsbuffer og hvirvle røret i 15 sekunder. Rørret røret i et magnetisk separationsstativ, og inkuber det i tre minutter ved stuetemperatur.Fjern derefter forsigtigt supernatanten uden at forstyrre perlerne og tilsæt det samme volumen af 2X vask og bindingsbuffer som det oprindelige volumen af perlerne. Vortex perlerne i 30 sekunder og overføre 10 mikroliter af suspensionen til et passende antal 1,5 milliliter rør. Rørene anbringes i den magnetiske separationsrist og inkuberes i tre minutter ved stuetemperatur.Derefter kasseres supernatant og tilsæt 50 mikroliter af 2X vask og binding buffer. Tilsæt 50 mikroliter af biotynylated cDNA til de tilsvarende rør med perlerne og inkuber dem i 30 minutter, mens forsigtigt roterende. Efter inkubationen anbringes rørene på den magnetiske separationsrist i tre minutter, og perlerne vaskes derefter med 200 mikroliter af 1X vask og bindingsbuffer efterfulgt af en tre minutters inkubation på separationsstativet.Kassér supernatanten og gentag vasken to gange. Derefter resuspenderede perlerne i 10 mikroliter af PCR-grade vand. Forbered en passende mængde PCR Master Mix i henhold til håndskriftsanvisningerne.Bland det godt og hurtigt dreje det ned, derefter overføre 49 mikroliter pr godt til en 96 godt PCR plade. Vortex rørene med den rensede cDNA i 15 sekunder, og tilsæt en mikroliter af suspensionen til de tilsvarende brønde. Kør PCR og adskille produkterne på en 1% agarose gel.Skær båndene fra gelen og klon de forstærkede produkter i en PCR 2.1 plasmid. Derefter sekvens kloner og analysere hver sekvens. De første RT-reaktioner blev udført med den regelmæssige ikke-biotynylaterede antisansprimer og resulterede i en vellykket forstærkning af ASP.Men et bånd af samme molekylvægt og primer minus kontrol blev også forstærket. For at omgå dette problem, den specifikke anti-sense primer blev mærket med biotyn og den deraf følgende anti-sense cDNA blev renset før PCR. Dette gjorde det muligt at forstærke ASP-sekvensen med stærkt reduceret kontaminering fra den ikke-specifikke cDNA i primer minus kontrollerne.Yderligere optimering af denne metode blev opnået ved fuldstændig denaturering af RNA ved 94 grader Celsius før RT, efterfulgt af øjeblikkelig afkøling på isvand, hvilket resulterede i effektiv forstærkning af ASP-båndet og ingen ikke-specifikke produkter. ASP RNA's kinetik blev målt, og CD4-cellerne blev isoleret fra tre hiv-positive personer med påviselig viremia og fravær af behandling efter stimulation med anti-CD3/CD28. Kvantificering af ASP RNA var også mulig hos patienter, der gennemgik ART, med ikke-påviselig viremia.Hos to ud af tre patienter blev ASP RNA påvist i lave niveauer ved tre til fem dage efter stimulering. To patienter blev analyseret for ASP og env RNAs, en ubehandlet og en behandlet. For den ubehandlede patient kunne begge RNA'er påvises.For den behandlede patient, ASP og env var næppe påviselige efter flere dages stimulation. Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at denaturering linearizes RNA, således at sekundære strukturer i stand til prime RT er ødelagt. Mens vask af perlerne skyller væk ikke-biotynylated cDNAs.Efter rensning af cDNAs med den korrekte polaritet, kan qPCR udføres for at analysere genekspression. Desuden kan cDNAs også klones og anvendes til sekvensanalyse. Denne metode gør det muligt at studere gener overlapper i modsatte orientering og kan være nyttige i at belyse regulering og patogenese af en bakterie og en virus-relaterede sygdomme, herunder nogle typer af kræft.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analyse af Ophør af Transcription Brug BrUTP-streng-specifikke Transskription Run-on (TRO) indflyvning

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kvantitative opdagelse af RNA-afhængige RNA Polymerase aktivitet af menneskelige Telomerase Reverse transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medieret reorganisering af kromatin løkke struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjælden begivenhed registrering ved hjælp af fejl-korrigeret DNA og RNA sekventering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Afgørende 3'-Termini og sekvenser af spirende enkeltstrenget Viral DNA molekyler i HIV-1 omvendt transkription i inficerede celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

En analyse til kvantificering af protein-RNA-binding i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimination og kortlægning af primære og forarbejdede transskriptioner i majs mitokondrier ved hjælp af en cirkulær RT-PCR-baseret strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...