Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

We danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick en Matthieu Perreau om altijd beschikbaar te zijn om ons werk en alle mensen in het laboratorium voor AIDS-immunopathogenese te bespreken voor hun kostbare technische hulp. We willen ook John en Aaron Weddle van VSB Associated Inc. bedanken die hebben bijgedragen aan uitstekende kunstwerken. Tot slot, veel speciale dank aan alle patiënten, zonder wie dit werk niet mogelijk zou zijn geweest. Dit werk ontving geen specifieke subsidie van een financierings instantie.

Deze studie werd goedgekeurd door de institutioneel beoordelings Raad van het Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. infectie van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) met HIV-1HXB2 stam
<ol><li>
Dag 1: PBMCs STIMULATIE
	<ol>
<li>Isoleer PBMCs van een gezonde donateurs Buffy vacht.</li>
		<li>Tellen en respenderen PBMCs in een concentratie van 1x106/ml in het complete Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium dat 10% foetaal ...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

In dit rapport beschrijven we een streng-specifieke RT assay toegepast op de detectie van ASP-RNA in CD4 + T-cellen geïsoleerd van personen geïnfecteerd met HIV-1. Het optreden van niet-specifieke priming tijdens RT belemmert de detectie van RNA-transcripten met de juiste polariteit, wat leidt tot een verkeerde interpretatie van de resultaten. Eerdere groepen hebben verschillende strategieën ontwikkeld die gericht zijn op het voorkomen van primer-onafhankelijke cDNA-synthese tijdens de RT-reactie. Het taggen van de om...

Het antisense protein (ASP)-gen is een open Lees frame (ORF) dat zich bevindt op de negatieve streng van het humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) envelop (env)-gen, dat de kruising gp120/gp411beslaat. In de afgelopen dertig jaar hebben verschillende rapporten aangetoond dat het HIV ASP-gen inderdaad is getranscribeerd en vertaald2,3,4,5,6,7,8,9. Hoewel ASP antisense transcripten volledig in vitrozijn gekarakteriseerd, was tot voor kort nog informatie over de werkelijke productie van ASP-RNA bij patiënten verdwenen.
De opeenvolging van ASP is omgekeerd en complementair aan env. Dit vormt een belangrijk obstakel wanneer u transcripten voor ASP probeert te detecteren. Standaard reverse transcriptie-polymerase chain reaction (RT-PCR) methoden gebruiken genspecifieke antisense primers om complementaire Dna's (Cdna's) van de juiste polariteit te synthetiseren. Deze aanpak staat echter niet toe om de oriëntatie (zin of antisense) van de initiële RNA-template te bepalen, aangezien RNA-haarspelden of lussen in beide richtingen kunnen worden priem bij afwezigheid van primers10, een fenomeen dat bekend staat als RT Self-priming. De meeste ASP-onderzoekers gaan het probleem van RT Self-priming aan met behulp van primers gelabeld met sequenties die niet gerelateerd zijn aan HIV-111,12. Deze strategie elimineert echter niet het optreden van het fenomeen en kan leiden tot een mogelijke overname van niet-specifieke Cdna's in de PCR11.
We hebben onlangs een nieuwe strand-specifieke RT-PCR-test ontwikkeld voor de studie van antisense RNA en we hebben het gebruikt voor ASP-RNA-detectie in een cohort van zes HIV-geïnfecteerde patiënten, zoals weergegeven in tabel 1. De hieronder beschreven procedure is eerder gepubliceerd door Antonio Mancarella et al.13. In ons protocol vermijden we de productie van niet-specifieke Cdna's door een dubbele aanpak. Ten eerste elimineren we RNA-secundaire structuren door denaturerende RNA op hoge temperatuur (94 ° c), en ten tweede, we reverse transcriberen ASP RNA met behulp van een biotinyleerd ASP-specifieke primer en affiniteit-zuiveren van de resulterende cDNA. Door deze aanpak kunnen we alleen onze doel-cDNA versterken, omdat andere niet-specifieke RT-producten worden verhinderd om te worden gegenereerd (denaturatie van hoge temperaturen van RNA) of geëlimineerd vóór PCR (affiniteits zuivering).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Bij retrovirussen is antisense transcriptie beschreven in zowel humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) als humaan T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). In HIV-1 bevindt het antisense Protein ASP-gen zich op de negatieve streng van env, in het Lees frame-2, dat de kruising gp120/gp41 beslaat. In de zin oriëntatie overlapt het 3 ' einde van het open Lees frame van ASP met gp120 hypervariable-regio's v4 en V5. De studie van ASP-RNA is gedwarslanteerd door een fenomeen dat bekend staat als RT-Self-priming, waarbij RNA-secundaire structuren de mogelijkheid hebben om RT bij afwezigheid van de specifieke primer te prime, waardoor niet-specifieke Cdna's worden gegenereerd. Het gecombineerde gebruik van hoge RNA-denaturatie met biotinyleerd reverse primers in de RT-reactie, samen met affiniteits zuivering van de cDNA op streptavidin gecoate magnetische kralen, heeft ons toegestaan om selectief te versterken ASP-RNA in CD4 + T cellen afgeleid van individuen geïnfecteerd met HIV-1. Onze methode is relatief voordelig, eenvoudig uit te voeren, zeer betrouwbaar en gemakkelijk reproduceerbaar. In dit opzicht vertegenwoordigt het een krachtig hulpmiddel voor de studie van antisense transcriptie, niet alleen in HIV-1, maar ook in andere biologische systemen.

Hoge temperatuur RNA denaturatie gekoppeld aan affiniteit zuivering van biotinyleerd cDNA voorkomt versterking van niet-specifieke ASP-producten tijdens PCR in PBMCs geïnfecteerd in vitro en in CD4 + T-cellen geïsoleerd van patiënten. RT zelfaanzuigend is aangetoond tijdens omgekeerde transcriptie van antisense RNAS10,14,15,16,17. Om dit fenomeen t...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Conventionele RT-PCR's staan geen discriminatie toe tussen de zins- en anti-sense sequenties wanneer ze worden gebruikt om RNAs te detecteren die gecodeerd zijn door overlappende genen. Dit protocol maakt het mogelijk om specifiek anti-sense RNAs te detecteren. Het gebruik van een biotynylated primers samen met hoge RNA denaturatie temperaturen zorgt voor versterking van anti-sense cDNAs, het voorkomen van de vorming van niet-specifieke RT producten.We hebben deze methode gebruikt om aan te tonen dat ASP ofwel als een RNA anti-sense of een eiwit voorloper, het is een nieuw HIV-antigeen, doet het potentieel een nieuwe HIV-doel voor therapie. Deze methode kan worden toegepast op elk systeem, waarin anti-sense RNAs van overlappende genen kunnen worden gedetecteerd. Begin met het ontwerpen van patiëntspecifieke primers met behulp van de pro-virale DNA-sequentie intern aan de PanASP primers.Kwantificeer vervolgens het RNA en elimineer DNA-besmetting door monsters met DNase te behandelen. Breng tussen 0,1 en een microgram van de totale RNA in de juiste putten op een 96 goed PCR plaat. Stel vervolgens de omgekeerde transcriptie, of RT reactie, volgens manuscript richtingen.Bereid de endogene RT-besturingselementen door het toevoegen van vijf microliters van nuclease vrij water in plaats van de ASP omgekeerde primer. Leg de plaat in de thermocycler en verwarm het RNA gedurende vijf minuten tot 94 graden Celsius. Dan onmiddellijk afkoelen in ijswater voor ten minste een minuut.Bereid het reactiemengsel voor in een buis van 1,5 milliliter zoals beschreven in het tekstmanuscript en breng vervolgens 17,5 microliter over naar elk van het RNA met putten. RNA-denaturatie moet worden uitgevoerd bij 94 graden Celsius. Zonder totale denaturatie kunnen syntheses van niet-specifieke producten van sense RNA optreden, wat leidt tot versterking van niet-specifieke cDNA's.Meng de inhoud van de putten voorzichtig en broed de plaat op 55 graden Celsius gedurende 60 minuten. Activeer vervolgens de reacties door de plaat gedurende 15 minuten te verwarmen tot 70 graden Celsius. Bereid een liter 2X was- en bindingsbuffer volgens de handschriftaanwijzing en filter de oplossing.Bereid vervolgens 50 milliliter 1X was- en bindingsbuffer voor met pcr-water. Breng het juiste aantal streptavidin-geconjugeerde magnetische kralen over naar een buis van 1,5 milliliter en was ze vervolgens door een gelijk volume van 2X was- en bindingsbuffer toe te voegen en de buis gedurende 15 seconden te laten vortexen. Plaats de buis in een magnetisch scheidingsrek en broed deze gedurende drie minuten op kamertemperatuur.Verwijder vervolgens voorzichtig de supernatant zonder de kralen te storen en voeg hetzelfde volume van de 2X was- en bindingsbuffer toe als het initiële volume van de kralen. Vortex de kralen voor 30 seconden en breng 10 microliter van de suspensie naar een passend aantal van 1,5 milliliter buizen. Plaats de buizen in het magnetische scheidingsrek en broed ze drie minuten lang op kamertemperatuur.Gooi vervolgens de supernatant weg en voeg 50 microliter 2x was- en bindingsbuffer toe. Voeg 50 microliter biotynylated cDNA toe aan de overeenkomstige buizen met de kralen en broed ze gedurende 30 minuten terwijl ze zachtjes draaien. Na de incubatie, plaats de buizen op de magnetische scheiding rek gedurende drie minuten dan was de kralen met 200 microliters van 1X wassen en binden buffer, gevolgd door een drie minuten incubatie op de scheiding rack.Gooi de supernatant weg en herhaal de was twee keer. Dan, resuspend de kralen in 10 microliters van PCR-kwaliteit water. Bereid een passend volume van PCR Master Mix volgens het manuscript richtingen.Meng het goed en snel draai het naar beneden, dan overdracht 49 microliters per put naar een 96 goed PCR plaat. Voorzichtig vortex de buizen met de gezuiverde cDNA voor 15 seconden en voeg een microliter van de suspensie aan de overeenkomstige putten. Voer de PCR uit en scheid de producten op een 1%agarose gel.Snijd de banden uit de gel en kloon de versterkte producten in een PCR 2.1 plasmide. Sequentiële de klonen en analyseer elke reeks. De eerste RT-reacties werden uitgevoerd met de reguliere niet-biotynylated anti-sense primer en resulteerden in een succesvolle versterking van ASP.Echter, een band van hetzelfde moleculaire gewicht en primer minus controles werd ook versterkt. Om dit probleem te omzeilen, werd de specifieke anti-sense primer gelabeld met biotyn en de resulterende anti-sense cDNA werd gezuiverd voorafgaand aan PCR. Dit maakte het mogelijk om de ASP-sequentie te versterken met sterk verminderde verontreiniging van de niet-specifieke cDNA in de primer minus-controles.Verdere optimalisatie van deze methode werd bereikt door volledige denaturatie van RNA bij 94 graden Celsius voorafgaand aan RT, gevolgd door onmiddellijke koeling op ijswater, wat resulteerde in effectieve versterking van de ASP-band en geen niet-specifieke producten. De kinetiek van ASP RNA werd gemeten en CD4 cellen geïsoleerd van drie HIV-positieve proefpersonen met detecteerbare viremia en een afwezigheid van therapie na stimulatie met anti-CD3/CD28. Kwantificering van ASP RNA was ook mogelijk bij patiënten die ART ondergingen, met niet-detecteerbare viremie.Bij twee op de drie patiënten werd ASP RNA bij lage niveaus op drie tot vijf dagen na stimulatie gedetecteerd. Twee patiënten werden geanalyseerd op ASP en env RNAs, een onbehandeld en een behandeld. Voor de onbehandelde patiënt kunnen beide RNA's worden gedetecteerd.Voor de behandelde patiënt waren ASP en env nauwelijks detecteerbaar na enkele dagen stimulatie. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat denaturatie RNA lineariseert, zodat secundaire structuren in staat om RT prime worden vernietigd. Terwijl het wassen van de kralen wegspoelt niet-biotynylated cDNAs.Na zuivering van de cDNAs met de juiste polariteit, qPCR kan worden uitgevoerd om genexpressie te analyseren. Bovendien kunnen cDNA's ook worden gekloond en gebruikt voor sequentieanalyse. Deze methode maakt het mogelijk om genen te bestuderen die elkaar overlappen in tegengestelde oriëntatie en kan nuttig zijn bij het ophelderen van regulatie en pathogenese van een bacterie en een virusgerelateerde ziekten, waaronder sommige vormen van kanker.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analyse van de beëindiging van de transcriptie gebruik van BrUTP-streng-specifieke transcriptie Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-kwantitatieve opsporing van RNA-afhankelijke RNA-polymeraseactiviteit van menselijke Telomerase Reverse-Transcriptase eiwit

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminatie en mapping van de primaire en verwerkte transcripten in maïs-mitochondrion met behulp van een circulaire RT-PCR-gebaseerde strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...