Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
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Nous remercions Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick et Matthieu Perreau d'être toujours disponibles pour discuter de notre travail et de toutes les personnes du Laboratoire d'immunopathogenèse du sida pour leur précieuse assistance technique. Nous tenons également à remercier John et Aaron Weddle de VSB Associated Inc. qui ont contribué avec d'excellentes œuvres d'art. Enfin, un grand merci à tous les patients, sans qui ce travail n'aurait pas été possible. Ces travaux n'ont reçu aucune subvention spécifique d'un organisme de financement.

Cette étude a été approuvée par la Commission d'examen institutionnel du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infection des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) par soucheHXB2 VIH-1
<ol><li>
Jour 1: PBMCs STIMULATION
	<ol>
<li>Isoler les PBMC d'un pelage velauve de donneur sain.</li>
		<li>Compter et resuspendre les PBMC à une concentration de 1x106/mL dans le milieu complet du Roswell Park Memorial Institute (RP...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

Dans ce rapport, nous décrivons un essai de RT spécifique au brin appliqué à la détection de l'ARN ASP dans les cellules T CD4MD isolées chez des personnes infectées par le VIH-1. L'occurrence de l'amorçage non spécifique pendant RT entrave la détection des transcriptions d'ARN avec la polarité droite, menant à l'interprétation erronée des résultats. Les groupes précédents ont développé plusieurs stratégies visant à empêcher la synthèse d'ADNc amorce-indépendante pendant la réaction de RT. Le mar...

Le gène de protéine antisens (ASP) est un cadre de lecture ouvert (ORF) situé sur le brin négatif du gène de l'enveloppe du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) (env), couvrant la jonction gp120/gp411. Au cours des 30 dernières années, plusieurs rapports ont montré que le gène DUVIH est en effet transcrit et traduit2,3,4,5,6,7,8,9. Bien que les transcriptions antisense d'ASP aient été entièrement caractérisées in vitro,jusqu'à récemment l'information au sujet de la production réelle de l'ARN d'ASP dans les patients était toujours manquante.
La séquence de l'ASP est inversée et complémentaire à env. Cela représente un obstacle majeur lorsque vous essayez de détecter les transcriptions pour ASP. Les méthodes standard de réaction en chaîne de transcription-polymérase inverse (RT-PCR) utilisent des amorces antisens spécifiques aux gènes pour synthétiser les ANN complémentaires (CDNA) de la polarité droite. Cette approche, cependant, ne permet pas de déterminer l'orientation (sens ou antisens) du modèle initial d'ARN, puisque les épingles à cheveux ou les boucles d'ARN peuvent primer RT dans les deux directions en l'absence des amorces10,un phénomène connu sous le nom d'auto-amorçage de RT. La plupart des chercheurs de l'ASP écartent le problème de l'auto-amorçage de RT à l'aide d'amorces étiquetées avec des séquences qui ne sont pas liées au VIH-111,12. Toutefois, cette stratégie n'élimine pas l'occurrence du phénomène et peut entraîner un report potentiel des ADCD non spécifiques dans le PCR11.
Nous avons récemment mis au point un nouvel essai RT-PCR spécifique au brin pour l'étude de l'ARN antisens et nous l'avons utilisé pour la détection de l'ARN ASP dans une cohorte de six patients infectés par le VIH, comme le montre le tableau 1. La procédure décrite ci-dessous a déjà été publiée par Antonio Mancarella et coll.13. Dans notre protocole, nous évitons la production de CDNA non spécifiques par une double approche. Tout d'abord, nous éliminons les structures secondaires de l'ARN en dénaturant l'ARN à haute température (94 oC), et deuxièmement, nous rincions l'ARN ASP à l'aide d'une amorce spécifique à l'ASP biotinylated et l'affinité purifie l'ADNc résultant. Par cette approche, nous sommes en mesure d'amplifier seulement notre cDNA cible, puisque d'autres produits NON spécifiques de RT sont empêchés d'être générés (dénaturation à haute température de l'ARN) ou éliminés avant PCR (purification d'affinité).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Dans les rétrovirus, la transcription d'antisense a été décrite dans le type 1 de virus d'immunodéficience humaine (HIV-1) et le virus T-lymphotropic humain 1 (HTLV-1). Dans LE VIH-1, le gène ASP de protéine antisens est situé sur le brin négatif de l'env, dans le cadre de lecture -2, couvrant la jonction gp120/gp41. Dans le sens de l'orientation, la fin de 3' du cadre de lecture ouverte ASP chevauche avec les régions hypervariables gp120 V4 et V5. L'étude de l'ARN ASP a été contrecarrée par un phénomène connu sous le nom de RT-auto-amorçage, par lequel les structures secondaires d'ARN ont la capacité de premier rinçage RT en l'absence de l'amorce spécifique, générant des cDNAs non spécifiques. L'utilisation combinée de la dénaturation à haut ARN avec des amorces inverses biotinylated dans la réaction de RT, avec la purification d'affinité de l'ADNc sur les perles magnétiques streptavidin-enduites, nous a permis d'amplifier sélectivement l'ARN d'ASP dans les cellules De T CD4MD dérivées des individus infectés par HIV-1. Notre méthode est relativement peu coûteuse, simple à exécuter, très fiable et facilement reproductible. À cet égard, il représente un outil puissant pour l'étude de la transcription antisens non seulement dans le VIH-1, mais aussi dans d'autres systèmes biologiques.

La dénaturation à haute température de l'ARN couplée à la purification d'affinité de l'ADNc biotinylated empêche l'amplification des produits ASP non spécifiques pendant PCR dans les PBMCs infectés in vitro et dans les cellules T CD4MD isolées des patients. RT auto-amorçage a été montré pour se produire lors de la transcription inverse des ARN antisens10,14,15,16,</s...

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Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Les RT-PCR conventionnels ne permettent pas la discrimination entre les séquences de sens et d’anti-sens lorsqu’ils sont utilisés pour détecter les ARN codés par des gènes qui se chevauchent. Ce protocole permet de détecter spécifiquement les ARN anti-sens. L’utilisation d’amorces biotynylated avec des températures élevées de dénaturation d’ARN permet l’amplification des cDNA anti-sens, empêchant la formation des produits non spécifiques de RT.Nous avons utilisé cette méthode pour démontrer que l’ASP, soit comme anti-sens arn, soit comme précurseur de protéines, c’est un nouvel antigène anti-VIH, est-ce potentiellement une nouvelle cible pour le VIH pour le traitement. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel système, dans lequel des ARN anti-sens provenant de gènes qui se chevauchent peuvent être détectés. Commencez par concevoir des amorces spécifiques aux patients à l’aide de la séquence d’ADN pro-virale interne aux amorces PanASP.Ensuite, quantifier l’ARN et éliminer la contamination par l’ADN en traitant les échantillons avec du DNase. Transférer entre 0,1 et un microgramme d’ARN total dans les puits appropriés sur une plaque PCR de 96 puits. Ensuite, configurer la transcription inverse, ou réaction RT, selon les instructions manuscrites.Préparez les commandes endogènes de RT en ajoutant cinq microlitres d’eau libre de nucléase au lieu de l’amorce inverse d’ASP. Mettez la plaque dans le thermocycleur et chauffer l’ARN à 94 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, refroidissez-le immédiatement dans de l’eau glacée pendant au moins une minute.Préparer le mélange de réaction dans un tube de 1,5 millilitre tel que décrit dans le manuscrit du texte, puis transférer 17,5 microlitres à chacun des puits contenant de l’ARN. La dénaturation de l’ARN doit être effectuée à 94 degrés Centigrades. Sans dénaturation totale, des synthèses de produits non spécifiques à partir d’ARN de sens peuvent se produire, conduisant à l’amplification des ADNN non spécifiques.Mélanger délicatement le contenu des puits et incuber la plaque à 55 degrés Celsius pendant 60 minutes. Ensuite, inactivez les réactions en chauffant la plaque à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes. Préparez un litre de tampon de lavage et de liaison 2X selon les instructions manuscrites et filtrez la solution.Ensuite, préparez 50 millilitres de tampon de lavage et de liaison 1X à l’aide d’eau de qualité PCR. Transférez le nombre approprié de perles magnétiques conjuguées à la streptavidine dans un tube de 1,5 millilitre, puis lavez-les en ajoutant un volume égal de tampon de lavage et de liaison 2X et en vortexant le tube pendant 15 secondes. Placez le tube dans un support de séparation magnétique et incubez-le pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, retirez soigneusement le supernatant sans déranger les perles et ajoutez le même volume du tampon de lavage et de fixation 2X que le volume initial des perles. Vortex les perles pendant 30 secondes et transférer 10 microlitres de la suspension à un nombre approprié de tubes de 1,5 millilitre. Placez les tubes dans le support de séparation magnétique et incubez-les pendant trois minutes à température ambiante.Ensuite, jetez le supernatant et ajoutez 50 microlitres de tampon de lavage et de liaison 2X. Ajouter 50 microlitres de cDNA biotynylé aux tubes correspondants avec les perles et les incuber pendant 30 minutes tout en tournant doucement. Après l’incubation, placer les tubes sur la grille de séparation magnétique pendant trois minutes, puis laver les perles avec 200 microlitres de tampon de lavage et de liaison 1X, suivi d’une incubation de trois minutes sur la grille de séparation.Jeter le surnatant et répéter le lavage deux fois. Ensuite, resuspendez les perles dans 10 microlitres d’eau de qualité PCR. Préparez un volume approprié de PCR Master Mix selon les instructions manuscrites.Bien mélanger et le faire tourner rapidement vers le bas, puis transférer 49 microlitres par puits à une plaque PCR 96 bien. Vortex soigneusement les tubes avec le cDNA purifié pendant 15 secondes et ajouter un microlitre de la suspension aux puits correspondants. Exécutez le PCR et séparez les produits sur un gel agarose de 1%.Couper les bandes du gel et cloner les produits amplifiés dans un plasmide PCR 2.1. Séquencez ensuite les clones et analysez chaque séquence. Les réactions initiales de RT ont été exécutées avec l’amorce anti-sens non biotynylated régulière et ont eu comme conséquence l’amplification réussie d’ASP.Cependant, une bande du même poids moléculaire et des contrôles d’amorce moins a également été amplifiée. Pour contourner ce problème, l’amorce anti-sens spécifique a été étiquetée avec du biotyn et l’ADN anti-sens qui en a résulté a été purifiée avant pcr. Cela a permis d’amplifier la séquence ASP avec une contamination considérablement réduite de l’ADNC non spécifique dans l’amorce moins les contrôles.D’autres optimisations de cette méthode ont été réalisées par dénaturation complète de l’ARN à 94 degrés Celsius avant rt, suivie d’un refroidissement immédiat sur l’eau glacée, ce qui a entraîné une amplification efficace de la bande ASP et aucun produit non spécifique. La cinétique de l’ARN ASP a été mesurée et les cellules CD4 isolées de trois sujets séropositifs atteints de viremia détectable et d’une absence de thérapie après stimulation avec anti-CD3/CD28. La quantification de l’ARN d’ASP était également possible dans les patients subissant la multithérapie, avec viremia non détectable.Dans deux patients sur trois, l’ARN d’ASP a été détecté dans les niveaux bas à trois à cinq jours après stimulation. Deux patients ont été analysés pour ASP et ENV ARN, un non traité et un traité. Pour le patient non traité, les deux ARN pourraient être détectés.Pour le patient traité, ASP et env étaient à peine détectables après plusieurs jours de stimulation. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la dénaturation linéarise l’ARN de sorte que les structures secondaires capables d’amorce RT sont détruites. Attendu que le lavage des perles chasse les CDA non biotynylés.Après purification des CDA avec la polarité correcte, qPCR peut être effectué pour analyser l’expression des gènes. En outre, les ADN peuvent également être clonés et utilisés pour l’analyse des séquences. Cette méthode permet d’étudier les gènes qui se chevauchent dans une orientation opposée et peut être utile pour élucider la régulation et la pathogénie d’une bactérie et d’une maladie liée au virus, y compris certains types de cancer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d&#39;exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Recherche

Génétique

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Détection semi-quantitative de l’activité de l’ARN polymérase ARN-dépendante de protéine de Transcriptase inverse de la télomérase humaine

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR induite par la réorganisation de la Structure de la chromatine boucle

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un jeu d'enfant pour quantifier la liaison protéine-ARN chez les bactéries

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identification des empreintes de pas de l'ARN: Complexes protéiques par l'intermédiaire de l'immunoprécipitation d'ARN dans Tandem suivi du séquençage (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discrimintion et cartographie des transcriptions primaires et traitées dans la mitochondndrion de maïs à l'aide d'une stratégie circulaire basée sur rt-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...