Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
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Wir danken Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick und Matthieu Perreau für ihre stets verfügbare Arbeit und alle Menschen im Labor für AIDS-Immunpathogenese für ihre wertvolle technische Hilfe. Wir möchten uns auch bei John und Aaron Weddle von VSB Associated Inc. bedanken, die mit exzellenten Kunstwerken beigetragen haben. Abschließend noch herzlichen Dank an alle Patienten, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Diese Arbeit erhielt keinen spezifischen Zuschuss von einer Förderstelle.

Diese Studie wurde vom Institutional Review Board des Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) genehmigt.
1. Infektion peripherer mononukleischer Blutzellen (PBMCs) mit HIV-1HXB2-Stamm
<ol><li>
Tag 1: PBMCs STIMULATION
	<ol>
<li>Isolieren Sie PBMCs von einem gesunden Spender-Buffy-Mantel.</li>
		<li>Zählung und Resuspendierung von PBMCs in einer Konzentration von 1x106/ml im gesamten Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10% fet...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

In diesem Bericht beschreiben wir einen strangspezifischen RT-Assay, der auf den Nachweis von ASP-RNA in CD4+ T-Zellen angewendet wird, die von Personen isoliert wurden, die mit HIV-1 infiziert sind. Das Auftreten einer unspezifischen Grundierung während RT behindert den Nachweis von RNA-Transkripten mit der richtigen Polarität, was zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse führt. Frühere Gruppen haben mehrere Strategien entwickelt, um die grundunabhängige cDNA-Synthese während der RT-Reaktion zu verhindern. Das M...

Das Antisense-Protein (ASP)-Gen ist ein offener Leserahmen (ORF), der sich auf dem negativen Strang des humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) Hüllkurve (env) befindet und die Kreuzung gp120/gp411überspannt. In den letzten 30 Jahren haben mehrere Berichte gezeigt, dass das HIV-ASP-Gen tatsächlich transkribiert und übersetzt ist2,3,4,5,6,7,8,9. Obwohl ASP Antisense Transkripte in vitrovollständig charakterisiert wurden, fehlten bis vor kurzem Informationen über die tatsächliche Produktion von ASP-RNA bei Patienten noch.
Die Reihenfolge von ASP ist umgekehrt und komplementär zu env. Dies stellt ein großes Hindernis beim Versuch dar, Transkripte für ASP zu erkennen. Standard-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktions-Methoden (RT-PCR) verwenden genspezifische Antisense-Primer, um komplementäre DNAs (cDNAs) der rechten Polarität zu synthetisieren. Dieser Ansatz erlaubt es jedoch nicht, die Ausrichtung (Sinn oder Antisense) der ursprünglichen RNA-Vorlage zu bestimmen, da RNA-Haarnadeln oder -schleifen RT in beide Richtungen ohne Primer10primieren können, ein Phänomen, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist. Die meisten ASP-Ermittler umgehen das Problem der RT-Selbstansaugung mit Primern, die mit Sequenzen markiert sind, die nichts mit HIV-11,12zu tun haben. Diese Strategie beseitigt jedoch nicht das Auftreten des Phänomens und kann zu einer möglichen Übertragung unspezifischer cDNAs in die PCR11führen.
Wir haben vor kurzem einen neuartigen strangspezifischen RT-PCR-Assay für die Untersuchung von Antisense-RNA entwickelt und für den ASP-RNA-Nachweis in einer Kohorte von sechs HIV-infizierten Patienten verwendet, wie in Tabelle 1dargestellt. Das unten beschriebene Verfahren wurde bereits von Antonio Mancarella et al.13veröffentlicht. In unserem Protokoll vermeiden wir die Produktion von unspezifischen cDNAs durch einen dualen Ansatz. Erstens eliminieren wir RNA-Sekundärstrukturen durch Denaturierung von RNA bei hoher Temperatur (94 °C), und zweitens transkribieren wir ASP-RNA mit einem biotinylierten ASP-spezifischen Primer und affinitätsreinigen die resultierende cDNA. Mit diesem Ansatz sind wir in der Lage, nur unsere Ziel-cDNA zu verstärken, da andere unspezifische RT-Produkte entweder daran gehindert werden, erzeugt zu werden (Hochtemperatur-Denaturierung der RNA) oder vor PCR (Affinitätsreinigung) eliminiert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Bei Retroviren wurde die Antisense-Transkription sowohl beim humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) als auch beim humanen T-Lymphotropen Virus 1 (HTLV-1) beschrieben. In HIV-1 befindet sich das Antisense-Protein ASP-Gen auf dem negativen Strang von env, im Leserahmen -2, der die Kreuzung gp120/gp41 überspannt. In der Sinnesorientierung überlappt sich das 3' Ende des offenen ASP-Leserahmens mit den hypervariablen gp120-Bereichen V4 und V5. Die Untersuchung von ASP-RNA wurde durch ein Phänomen vereitelt, das als RT-Selbstgrundierung bekannt ist, wobei RNA-Sekundärstrukturen die Fähigkeit haben, RT in Abwesenheit des spezifischen Primers zu grundieren und unspezifische cDNAs zu erzeugen. Die kombinierte Verwendung einer hohen RNA-Denaturierung mit biotinylierten Reverseprimern in der RT-Reaktion, zusammen mit der Affinitätsreinigung der cDNA auf Streptavidin-beschichtete Magnetperlen, hat es uns ermöglicht, ASP-RNA in CD4+ T-Zellen, die von mit HIV-1 infizierten Personen stammen, selektiv zu verstärken. Unsere Methode ist relativ kostengünstig, einfach durchzuführen, sehr zuverlässig und leicht reproduzierbar. In dieser Hinsicht stellt es ein wirksames Instrument zur Untersuchung der Antisense-Transkription nicht nur bei HIV-1, sondern auch in anderen biologischen Systemen dar.

Hochtemperatur-RNA-Denaturierung gekoppelt mit Affinitätsreinigung von biotinylatierter cDNA verhindert die Amplifikation unspezifischer ASP-Produkte während der PCR in PBMCs, die in vitro infiziert sind, und in CD4+ T-Zellen, die von Patienten isoliert wurden. RT Selbstansaugung hat sich gezeigt, während der umgekehrten Transkription von Antisense RNAs10,14,15,16,<sup cl...

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Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA-Haarnadeln und -schleifen können als Primer für die Reverse-Transkription (RT) in Ermangelung sequenzspezifischer Primer fungieren, was die Untersuchung überlappender Antisense-Transkripte beeinträchtigt. Wir haben eine Technik entwickelt, die in der Lage ist, strangspezifische RNA zu identifizieren, und wir haben sie verwendet, um DAS HIV-1-Antisense-Protein ASP zu untersuchen.

Nachweis von Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts bei Patienten durch Strand-spezifische RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Herkömmliche RT-PCRs erlauben keine Diskriminierung zwischen Sinn- und Anti-Sinn-Sequenzen, wenn sie verwendet werden, um RNAs zu erkennen, die durch überlappende Gene kodiert sind. Dieses Protokoll ermöglicht es, speziell anti-sense-RNAs zu erkennen. Die Verwendung einer biotynyolierten Grundierung zusammen mit hohen RNA-Denaturierungstemperaturen ermöglicht eine Verstärkung von Anti-Sense-CDNAs und verhindert die Bildung unspezifischer RT-Produkte.Wir haben diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass ASP entweder als RNA-Anti-Sinn oder als Protein-Vorläufer, es ist ein neues HIV-Antigen, tut es potenziell ein neues HIV-Ziel für die Therapie. Diese Methode kann auf jedes System angewendet werden, in dem Anti-Sense-RNAs aus überlappenden Genen nachgewiesen werden können. Beginnen Sie mit der Entwicklung patientenspezifischer Primer unter Verwendung der proviralen DNA-Sequenz, die intern in den PanASP-Primern ist.Als nächstes quantifizieren Sie die RNA und beseitigen Sie die DNA-Kontamination, indem Sie Proben mit DNase behandeln. Transfer zwischen 0,1 und einem Mikrogramm gesamter RNA in die entsprechenden Brunnen auf einer 96 Well PCR Platte. Richten Sie dann die umgekehrte Transkription oder RT-Reaktion gemäß manuskripten Anweisungen ein.Bereiten Sie die endogenen RT-Kontrollen vor, indem Sie anstelle des ASP-Reverseprimers fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen. Die Platte in den Thermocycler geben und die RNA fünf Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzen. Dann sofort in Eiswasser für mindestens eine Minute abkühlen.Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und übertragen Sie dann 17,5 Mikroliter auf jede der RNA enthaltenden Brunnen. Die RNA-Denaturierung muss bei 94 Grad Celsius durchgeführt werden. Ohne vollständige Denaturierung können Synthesen von unspezifischen Produkten aus Sinnes-RNA auftreten, was zur Amplifikation unspezifischer cDNAs führt.Mischen Sie den Inhalt der Brunnen sanft und bebrüten Sie die Platte bei 55 Grad Celsius für 60 Minuten. Dann inaktivieren Sie die Reaktionen, indem Sie die Platte 15 Minuten lang auf 70 Grad Celsius erwärmen. Bereiten Sie einen Liter 2X Wasch- und Bindungspuffer nach Manuskriptrichtungen vor und filtern Sie die Lösung.Als nächstes bereiten Sie 50 Milliliter 1X Wasch- und Bindungspuffer mit PCR-Wasser vor. Übertragen Sie die entsprechende Anzahl von streptavidin-konjugierten Magnetperlen auf ein 1,5 Milliliter-Rohr und waschen Sie sie dann, indem Sie ein gleiches Volumen von 2X Wasch- und Bindungspuffer hinzufügen und das Rohr für 15 Sekunden wirbeln. Legen Sie das Rohr in ein magnetisches Trennregal und inkubieren Sie es für drei Minuten bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören, und fügen Sie das gleiche Volumen des 2X Wasch- und Bindungspuffers hinzu wie das Anfangsvolumen der Perlen. Wirbeln Sie die Perlen für 30 Sekunden und übertragen Sie 10 Mikroliter der Suspension auf eine entsprechende Anzahl von 1,5 Milliliter-Röhren. Legen Sie die Rohre in das magnetische Trennregal und inkubieren Sie sie für drei Minuten bei Raumtemperatur.Entsorgen Sie dann den Überstand und fügen Sie 50 Mikroliter 2X Wasch- und Bindungspuffer hinzu. 50 Mikroliter biotynylatierte cDNA mit den Perlen in die entsprechenden Schläuche geben und 30 Minuten lang bebrüten, während sie sich sanft drehen. Legen Sie die Rohre nach der Inkubation drei Minuten lang auf das magnetische Trenngestell und waschen Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern 1X Wasch- und Bindungspuffer, gefolgt von einer dreiminütigen Inkubation auf dem Trennträger.Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Dann setzen Sie die Perlen in 10 Mikroliter PCR-Wasser wieder aus. Bereiten Sie ein entsprechendes Volumen von PCR Master Mix entsprechend den Manuskriptanweisungen vor.Mischen Sie es gut und drehen Sie es schnell nach unten, dann übertragen 49 Mikroliter pro Brunnen auf eine 96 well PCR Platte. Wirbeln Sie die Rohre mit der gereinigten cDNA 15 Sekunden lang vorsichtig aus und fügen Sie den entsprechenden Brunnen einen Mikroliter der Suspension hinzu. Führen Sie die PCR aus und trennen Sie die Produkte auf einem 1%Agarose-Gel.Schneiden Sie die Bänder aus dem Gel und klonen Sie die verstärkten Produkte in ein PCR 2.1 Plasmid. Sequenzieren Sie dann die Klone und analysieren Sie jede Sequenz. Die ersten RT-Reaktionen wurden mit dem regulären nicht-biotynyolierten Anti-Sense-Primer durchgeführt und führten zu einer erfolgreichen Amplifikation von ASP.Allerdings wurde auch ein Band mit dem gleichen Molekulargewicht und der gleichen Grundierung minus Kontrollen verstärkt. Um dieses Problem zu umgehen, wurde der spezifische Anti-Sinn-Primer mit Biotyn gekennzeichnet und die resultierende Anti-Sense-cDNA wurde vor PCR gereinigt. Dadurch konnte die ASP-Sequenz mit stark reduzierter Kontamination durch die unspezifische cDNA im Primer minus-Kontrollen verstärkt werden.Eine weitere Optimierung dieser Methode wurde durch eine vollständige Denaturierung der RNA bei 94 Grad Celsius vor RT erreicht, gefolgt von einer sofortigen Abkühlung auf Eiswasser, was zu einer effektiven Verstärkung des ASP-Bandes und ohne unspezifische Produkte führte. Die Kinetik der ASP-RNA wurde gemessen und CD4-Zellen von drei HIV-positiven Probanden mit nachweisbarer Virämie und fehlender Therapie nach Stimulation mit Anti-CD3/CD28 isoliert. Die Quantifizierung der ASP-RNA war auch bei Patienten mit ART-Behandlung mit nicht nachweisbarer Virämie möglich.Bei zwei von drei Patienten wurde ASP-RNA in niedrigen Konzentrationen an drei bis fünf Tagen nach der Stimulation nachgewiesen. Zwei Patienten wurden auf ASP- und Env-RNAs untersucht, einer unbehandelt und einer behandelt. Für den unbehandelten Patienten konnten beide RNAs nachgewiesen werden.Für den behandelten Patienten waren ASP und Env nach mehrtägiger Stimulation kaum nachweisbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Denaturierung die RNA linearisiert, so dass sekundäre Strukturen, die RT primieren können, zerstört werden. Während das Waschen der Perlen nicht-biotynylated cDNAs wegspült.Nach der Reinigung der cDNAs mit der richtigen Polarität kann qPCR durchgeführt werden, um die Genexpression zu analysieren. Darüber hinaus können cDNAs auch geklont und für die Sequenzanalyse verwendet werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genen, die sich in entgegengesetzter Ausrichtung überlappen, und kann bei der Aufklärung der Regulierung und Pathogenese eines Bakteriums und einer virusbedingten Krankheit, einschließlich einiger Krebsarten, nützlich sein.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Die Analyse der Beendigung der Transkription unter Verwendung von BrUTP strangspezifische Transkription Run-on (TRO) Ansatz

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Forschung

Genetik

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Bestimmende 3'-Termini und Sequenzen der im Entstehen begriffenen einsträngige virale DNA-Moleküle während HIV-1 Reverse Transkription in infizierten Zellen

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ein Assay zur Quantifizierung der Protein-RNA-Bindung in Bakterien

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskrimintion und Mapping der primären und verarbeiteten Transkripte in Mais mitochondrion mit einer kreisförmigen RT-PCR-basierten Strategie

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...