Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

אנו מודים לפטריזיה אמגליו, אלסנדרה נוואל, קרייג פנוויק, ומתיו פרברו, שתמיד יהיו זמינים לדון בעבודתנו ובכל האנשים במעבדת האיידס Immunopathogenesis לסיוע הטכני היקר שלהם. אנחנו גם רוצים להודות לג ואהרון וודל מ VSB המשויכים Inc. שתרמו עם יצירות אמנות מעולה. לבסוף, תודות מיוחדות רבות לכל המטופלים, מבלי שהעבודה הזאת לא הייתה אפשרית. עבודה זו לא קיבלה כל מענק ספציפי משום סוכנות מימון.

מחקר זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת מרכז אשפוז ודוייס (CHUV).
1. זיהום של דם היקפי תאים ברורים (PBMCs) עם HIV-1HXB2 זן
<ol><li>
יום 1: גירוי PBMCs
	<ol>
<li>לבודד PBMCs מעיל באפי תורם בריא.</li>
		<li>לספור ולהשעות מחדש PBMCs בריכוז של 1x106/mL בשנת מלאה רוזוול פארק הזיכרו...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

בדוח זה אנו מתארים שיטת ה-RT הספציפית לסטרנד המוחלת על איתור RNA של ASP בתאים CD4 + T מבודדים מאנשים שנדבקו ב-HIV-1. התרחשות של הטרמה לא ספציפית במהלך RT הסלים את הזיהוי של התעתיקים RNA עם הקוטביות הימנית, המוביל וטעה של התוצאות. הקבוצות הקודמות פיתחו מספר אסטרטגיות שמטרתן למנוע סינתזה בלתי תלויה cDNA במ?...

החלבון antisense (ASP) הגן הוא מסגרת קריאה פתוחה (ORF) הממוקם על סטרנד שלילי של הנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) המעטפה (env) גן, הפורש את הצומת gp120/gp411. במהלך 30 השנים האחרונות, מספר דיווחים הראו כי הגן HIV ASP הוא אכן מועתק ותורגם2,3,4,5,6,7,8,9. למרות התעתיקים של ASP antisense כבר מאופיין באופן מלא בתוך מבחנה, עד לאחרונה מידע על הייצור בפועל של ה-RNA של ASP בחולים עדיין חסר.
הרצף של ASP הוא הפוך ומשלים ל-env. זה מייצג מכשול גדול כאשר מנסים לזהות תעתיקים של ASP. שיטת הפוך סטנדרטית לתגובת שרשרת פולימראז (RT-PCR) שיטות משתמשות גנטית ספציפית אנטי הגיון לסנתז DNAs משלימה (cDNAs) של הקוטביות הימנית. גישה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת לקבוע את הכיוון (תחושה או אנטי-היגיון) של תבנית ה-RNA הראשונית, מכיוון שסיכות או לולאות של RNA יכולות להיות מראש בשני הכיוונים בהעדר התחל10, תופעה הידועה כ-RT-הטרמה עצמית. רוב החוקרים ASP הבעיה של RT הטרמה עצמית באמצעות תחל מתויג עם רצפים שאינם קשורים ל-HIV-111,12. אסטרטגיה זו, עם זאת, אינה מבטלת את התרחשות התופעה, ועלולה לגרום לנשיאה פוטנציאלית של cDNAs שאינו ספציפי ל-PCR11.
פיתחנו לאחרונה הרומן מיוחד סטרנד-PCR שיטת המחקר של RNA antisense ואנחנו השתמשנו בו עבור הזיהוי של ה-RNA ASP בקבוצה של שישה חולים נגועים באיידס, כפי שמוצג בטבלה 1. ההליך המתואר להלן פורסם בעבר על ידי אנטוניו Mancarella ואח '13. בפרוטוקול שלנו, אנו נמנעים מהפקת cDNAs לא ספציפי באמצעות גישה כפולה. ראשית, אנו מסלקים מבנים משניים של RNA על ידי שימוש ב-RNA בטמפרטורה גבוהה (94 ° c), ושנית, אנו הפוכה להפוך את ה-RNA של ASP באמצעות פריימר ביולוגי ברמה של ASP ואהדה-לטהר את התוצאה cDNA. על-ידי גישה זו, אנו מסוגלים להגביר רק את היעד שלנו cdna, מאז מוצרי RT אחרים שאינם ספציפיים מנועים או שנוצר (הטמפרטורה הגבוהה דנטורציה של RNA) או נמחק לפני ה-PCR (טיהור האהדה).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

ב retroviruses, שעתוק החושים שתוארו בנגיף החיסוני האנושי סוג 1 (HIV-1) ו-T-lymphotropic וירוס 1 (HTLV-1). ב-HIV -1, החלבון antisense של ASP גן ממוקם על סטרנד שלילי של env, במסגרת הקריאה -2, הפורש את הצומת gp120/gp41. בכיוון ההגיון, הקצה של 3 מסגרת הקריאה של ASP חופף עם V4 של אזורים gp120-משתנים ומספר V5. המחקר של ה-RNA ASP סוכלה על ידי תופעה המכונה RT-self-הטרמה, לפיו מבנים משניים RNA יש את היכולת הממשלה RT בהעדר של פריימר ספציפי, יצירת cDNAs לא ספציפי. השימוש המשולב בשילוב עם כדורי היסוד הפוכים ביולוגית בתגובת RT, יחד עם האהדה לטיהור של cDNA על streptavidin מצופה חרוזים מגנטיים, אפשרה לנו באופן סלקטיבי להגביר את ה-RNA של ASP בתאים CD4 + T נגזר מאנשים נגועים ב-HIV-1. השיטה שלנו היא בעלות נמוכה יחסית, פשוט לבצע, מאוד אמין, ובקלות להיות מתוכדל. במובן זה, הוא מייצג כלי רב עוצמה לחקר שעתוק החושים לא רק ב-HIV-1 אלא גם במערכות ביולוגיות אחרות.

טמפ גבוהה רנ א מצמידים לטיהור אהדה של cDNA biotinylated מונע הגברה של מוצרי ASP שאינם ספציפיים במהלך ה-PCR ב-PBMCs נגוע מבחנה בתאי CD4 + T מבודדים מהחולים. RT הטרמה עצמית הוכח להתרחש במהלך שעתוק לאחור של antisense rnas10,14,15,16,<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

הסיכות ולולאות של RNA יכולות לתפקד כצבעי יסוד לתמלול הפוכה (RT) בהיעדר התחל העצמי הספציפי ברצף, הפרעה למחקר של התעתיקים החופפים של התמלילים. פיתחנו טכניקה מסוגל לזהות את ה-RNA ספציפי סטרנד, ואנחנו השתמשנו בו כדי ללמוד HIV-1 antisense חלבון ASP.

זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

RT-PCRs קונבנציונליים אינם מאפשרים אפליה בין רצפי החושים והאנטי-חושיים כאשר נעשה בהם שימוש כדי לזהות RNAs המקודדים על ידי גנים חופפים. פרוטוקול זה מאפשר לזהות RNAs אנטי-חושיים במיוחד. השימוש פריימרים biotynylated יחד עם טמפרטורות denaturation RNA גבוה מאפשר הגברה של cDNAs אנטי חושי, מניעת היווצרות של מוצרי RT לא ספציפיים.השתמשנו בשיטה זו כדי להדגים כי ASP או כמו אנטי חוש RNA או מבשר חלבון, זה אנטיגן HIV חדש, עושה את זה פוטנציאל יעד HIV חדשני לטיפול. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת, שבה ניתן לזהות RNAs אנטי-חושיים מגנים חופפים. התחל בתכנון פריימרים ספציפיים למטופל באמצעות רצף הדנ"א הפרו-ויראלי הפנימי של פריימרים PanASP.לאחר מכן, לכמת את RNA ולמנוע זיהום DNA על ידי טיפול בדגימות עם DNase. העבר בין 0.1 ומיקרוגרם אחד של RNA הכולל לתוך בארות המתאימות על צלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן להגדיר את התמלול ההפוך, או תגובת RT, על פי הוראות כתב היד.הכן את פקדי RT אנדוגניים על ידי הוספת חמישה microliters של מים חופשיים גרעין במקום פריימר הפוך ASP. מכניסים את הצלחת לתרמוצ'ילר ומחממים את ה-RNA ל-94 מעלות במשך חמש דקות. ואז מיד לקרר אותו במים קרים לפחות דקה אחת.הכן את תערובת התגובה בצינור 1.5 מיליליטר כמתואר בכתב היד טקסט, ולאחר מכן להעביר 17.5 microliters לכל אחד RNA המכיל בארות. דנטורציה RNA חייב להתבצע ב 94 מעלות צל"ש. ללא denaturation מוחלט, סינתזות של מוצרים לא ספציפיים מן RNA החוש עלול להתרחש, המוביל הגברה של cDNAs לא ספציפי.מערבבים בעדינות את תכולת הבאר ומטמיבים את הצלחת ב-55 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. לאחר מכן, להשבית את התגובות על ידי חימום הצלחת ל 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. הכינו ליטר אחד של כביסה פי 2 וחוצץ מחייב לפי הוראות כתב היד וסננים את הפתרון.לאחר מכן, הכינו 50 מיליליטר של כביסה פי 1 ומאגר מחייב באמצעות מים בדרגת PCR. מעבירים את המספר המתאים של חרוזים מגנטיים נדנים לצינור 1.5 מיליליטר ואז שוטפים אותם על ידי הוספת נפח שווה של שטיפת פי 2 ומאגר קשירה ומערבולת הצינור למשך 15 שניות. מניחים את הצינור לתוך מתלה הפרדה מגנטית להדרור אותו במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, להסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את חרוזים ולהוסיף את אותו נפח של 2X כביסה חיץ מחייב כמו הנפח הראשוני של חרוזים. Vortex את חרוזים במשך 30 שניות ולהעביר 10 microliters של ההשעיה למספר מתאים של צינורות 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינורות במתלה ההפרדה המגנטית ומדרגרים אותם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, השליכו את העל-טבעי והוסיפו 50 מיקרוליטרים של חיץ כביסה וכריכה 2X. מוסיפים 50 מיקרוליטרים של cDNA biotynylated לצינורות המתאימים עם חרוזים דגירה אותם במשך 30 דקות תוך סיבוב בעדינות. לאחר הדגירה, מניחים את הצינורות על מתלה ההפרדה המגנטית במשך שלוש דקות ואז לשטוף את חרוזים עם 200 microliters של 1X כביסה חיץ מחייב, ואחריו דגירה שלוש דקות על מתלה ההפרדה.השליכו את העל-טבעי וחזרו על הכביסה פעמיים. לאחר מכן, תן שימוש חוזר בחרוזים ב-10 מיקרוליטרים של מים בדרגת PCR. הכן כרך מתאים של PCR מאסטר מיקס בהתאם לכיווני כתב היד.מערבבים אותו היטב במהירות לסובב אותו, ולאחר מכן להעביר 49 microliters לגם לצלחת PCR 96 היטב. בזהירות מערבולת הצינורות עם cDNA מטוהרים במשך 15 שניות ולהוסיף מיקרוליטר אחד של ההשעיה ל בארות המתאימות. הפעל את PCR ולהפריד את המוצרים על 1%agarose ג'ל.חותכים את הרצועות מהג'ל ומשכפלים את המוצרים המוגברים לפלסמיד PCR 2.1. לאחר מכן לרצף את השיבוטים ולנתח כל רצף. התגובות הראשוניות של RT בוצעו עם פריימר אנטי-חושי רגיל שאינו ביוטיני, והביאו להגברה מוצלחת של ASP.עם זאת, רצועה של אותו משקל מולקולרי ופקדי פרימר מינוס הוגברה גם היא. כדי לעקוף בעיה זו, פריימר אנטי חוש ספציפי היה שכותרתו עם biotyn ואת cDNA אנטי חוש וכתוצאה מכך היה מטוהר לפני PCR. זה אפשר להגביר את רצף ASP עם זיהום מופחת מאוד מן cDNA לא ספציפי בפקדי פרימר מינוס.אופטימיזציה נוספת של שיטה זו הושגה על ידי denaturation מלא של RNA ב 94 מעלות צלזיוס לפני RT, ואחריו קירור מיידי על מי קרח, אשר הביא הגברה יעילה של הלהקה ASP ולא מוצרים שאינם ספציפיים. הקינטיקה של ASP RNA נמדדו ותאי CD4 מבודדים משלושה נבדקים נשאי HIV עם וירמיה הניתנת לגילוי והיעדר טיפול בעקבות גירוי עם אנטי CD3/CD28. כימות של ASP RNA היה אפשרי גם בחולים שעברו אמנות, עם וירמיה שאינה ניתנת לגילוי.בשניים מתוך שלושה חולים, ASP RNA זוהה ברמות נמוכות ב שלושה עד חמישה ימים לאחר גירוי. שני חולים נותחו עבור ASP ו ENV RNAs, אחד מטופל ואחד מטופל. עבור המטופל שלא טופל, ניתן היה לזהות את שני ה- RNAs.עבור המטופל המטופל המטופל, ASP ו env בקושי היו ניתנים לגילוי לאחר מספר ימים של גירוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי denaturation ליניארית RNA כך מבנים משניים מסוגלים ראש RT נהרסים. בעוד, שטיפת חרוזים שוטף משם cDNAs שאינם biotynylated.לאחר טיהור ה- cDNAs עם הקוטביות הנכונה, ניתן לבצע qPCR כדי לנתח ביטוי גנים. יתר על כן, cDNAs ניתן גם לשכפל ושמש לניתוח רצף. שיטה זו מאפשרת ללמוד גנים חופפים בכיוון ההפוך ועשויים להיות שימושיים בהבהרת רגולציה ופתוגנזה של חיידק ומחלות הקשורות לנגיף כולל סוגים מסוימים של סרטן.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...