Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Ringraziamo Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick e Matthieu Perreau per essere sempre disponibili a discutere del nostro lavoro e di tutte le persone del Laboratorio di AIDS Immunopatogenesi per la loro preziosa assistenza tecnica. Vorremmo anche ringraziare John e Aaron Weddle di VSB Associated Inc. Infine, tanti ringraziamenti speciali a tutti i Pazienti, senza i quali questo lavoro non sarebbe stato possibile. Questo lavoro non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica da qualsiasi agenzia di finanziamento.

Questo studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infezione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) con ceppo HIV-1HXB2
<ol><li>
Giorno 1: PBMC STIMULATION
	<ol>
<li>Isola i PBMC da un cappotto sano per i donatori.</li>
		<li>Contare e risospendere i PBMC a una concentrazione di 1x106/mL nel roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio completo contenente 10% sie...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

In questo rapporto viene descritto un saggio RT specifico del filamento applicato al rilevamento dell'RNA ASP nelle cellule T CD4, isolate da individui infettati dall'HIV-1. Il verificarsi di priming non specifico durante RT ostacola la rilevazione di trascrizioni dell'RNA con la polarità destra, portando a un'errata interpretazione dei risultati. I gruppi precedenti hanno sviluppato diverse strategie volte a prevenire la sintesi cDNA indipendente dal primer durante la reazione RT. Contrassegnare l'inversione all'estrem...

Il gene della proteina antisenso (ASP) è un telaio di lettura aperto (ORF) situato sul filamento negativo del gene dell'involucro (HIV-1) del virus dell'immunodeficienza umana, che si estende sulla giunzione gp120/gp411. Negli ultimi 30 anni, diversi rapporti hanno dimostrato che il gene ASP HIV è effettivamente trascritto e tradotto2,3,4,5,6,7,8,9. Anche se le trascrizioni antisense ASP sono state completamente caratterizzate in vitro, fino a poco tempo fa mancavano ancora informazioni sulla produzione effettiva di RNA ASP nei pazienti.
La sequenza di ASP è inversa e complementare all'ambiente di env. Questo rappresenta un ostacolo importante quando si tenta di rilevare le trascrizioni per ASP. I metodi standard di reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) utilizzano primer antisense specifici genici per sintetizzare DNA complementari (CDA) della polarità destra. Questo approccio, tuttavia, non consente di determinare l'orientamento (senso o antisenso) del modello di RNA iniziale, poiché le forcine o i loop di RNA possono innescare RT in entrambe le direzioni in assenza di primer10, un fenomeno noto come RT self-priming. La maggior parte degli investigatori ASP elude il problema dell'auto-priming RT utilizzando i primer contrassegnati con sequenze che non sono correlate all'HIV-111,12. Questa strategia, tuttavia, non elimina il verificarsi del fenomeno e può portare a potenziali riporti di cDNA non specifici nel PCR11.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo saggio RT-PCR specifico del filamento per lo studio dell'RNA antisenso e l'abbiamo utilizzato per il rilevamento dell'RNA ASP in una coorte di sei pazienti affetti da HIV, come mostrato nella tabella 1. La procedura descritta di seguito è stata precedentemente pubblicata da Antonio Mancarella etal. Nel nostro protocollo, evitiamo la produzione di cDNA non specifici con un duplice approccio. In primo luogo, eliminiamo le strutture secondarie dell'RNA denimentando l'RNA ad alta temperatura (94 gradi centigradi), e in secondo luogo, invertiamo l'RNA ASP utilizzando un primer biotinylato specifico di ASP e purificando l'affinità-purificailo il cDNA risultante. Con questo approccio, siamo in grado di amplificare solo il nostro cDNA target, poiché altri prodotti RT non specifici sono o impedito di essere generati (denaturazione ad alta temperatura di RNA) o eliminati prima della PCR (purificazione dell'affinità).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Nei retrovirus, la trascrizione antisenso è stata descritta sia nel virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) che nel virus T-linfotropico umano 1 (HTLV-1). Nell'HIV-1, il gene ASP della proteina antisenso si trova sul filamento negativo di env, nel fotogramma di lettura -2, che si estende per la giunzione gp120/gp41. Nell'orientamento del senso, l'estremità 3' del frame di lettura ASP aperto si sovrappone alle regioni ipervariabili gp120 V4 e V5. Lo studio dell'RNA ASP è stato ostacolato da un fenomeno noto come RT-self-priming, per cui le strutture secondarie dell'RNA hanno la capacità di innescare RT in assenza del primer specifico, generando cDNA non specifici. L'uso combinato dell'elevata denaturazione dell'RNA con primer inversi biotinylati nella reazione RT, insieme alla purificazione dell'affinità del cDNA su perline magnetiche rivestite di streptavidin, ci ha permesso di amplificare selettivamente l'RNA ASP nelle cellule T CD4, derivate da individui infettati da HIV-1. Il nostro metodo è relativamente a basso costo, semplice da eseguire, altamente affidabile e facilmente riproducibile. A questo proposito, rappresenta un potente strumento per lo studio della trascrizione antisenso non solo in HIV-1 ma anche in altri sistemi biologici.

La denaturazione dell'RNA ad alta temperatura accoppiata alla purificazione dell'affinità del cDNA biotinylato previene l'amplificazione di prodotti ASP non specifici durante la PCR nei PBMC infettati in vitro e nelle cellule T CD4 isolate dai pazienti. È stato dimostrato che l'auto-priming RT si verifica durante la trascrizione inversa degli RNA antisenso10,14,15,16,<sup ...

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Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Le forcine e i loop di RNA possono funzionare come primer per la trascrizione inversa (RT) in assenza di primer specifici della sequenza, interferendo con lo studio delle trascrizioni antisense sovrapposte. Abbiamo sviluppato una tecnica in grado di identificare l'RNA specifico del filamento, e l'abbiamo usata per studiare la proteina antisenso HIV-1 ASP.

Rilevamento di trascrizioni di RNA di tipo 1 (HIV-1) di proteina antisenso (ASP) di immunodeficienza umana nei pazienti da parte di RT-PCR specifico di Strand

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Gli RT-PCR convenzionali non consentono discriminazioni tra le sequenze di senso e anti-senso quando vengono utilizzati per rilevare gli RNA codificati da geni sovrapposti. Questo protocollo consente di rilevare RNA specificamente anti-senso. L'uso di primer biotinolati insieme ad alte temperature di denaturazione dell'RNA consente l'amplificazione di cDNA anti-senso, impedendo la formazione di prodotti RT non specifici.Abbiamo usato questo metodo per dimostrare che l'ASP sia come anti-senso dell'RNA che come precursore proteico, è un nuovo antigene hiv, lo fa potenzialmente un nuovo bersaglio hiv per la terapia. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi sistema, in cui possono essere rilevati RNA anti-senso da geni sovrapposti. Inizia progettando primer specifici per pazienti utilizzando la sequenza di DNA pro-virale interna ai primer PanASP.Successivamente, quantificare l'RNA ed eliminare la contaminazione da DNA trattando campioni con DNasi. Trasferire tra 0,1 e un microgrammo di RNA totale nei pozzi appropriati su una piastra PCR da 96 porri. Quindi impostare la trascrizione inversa, o reazione RT, secondo le indicazioni del manoscritto.Preparare i controlli RT endogeni aggiungendo cinque microlitri di acqua libera da nucleasi anziché il primer inverso ASP. Mettere la piastra nel termociclo e riscaldare l'RNA a 94 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi raffreddarlo immediatamente in acqua ghiacciata per almeno un minuto.Preparare la miscela di reazione in un tubo da 1,5 millilitri come descritto nel manoscritto testuale, quindi trasferire 17,5 microlitri in ciascuno degli RNA contenenti pozzi. La denaturazione dell'RNA deve essere eseguita a 94 gradi centigradi. Senza denaturazione totale, possono verificarsi sintesi di prodotti non specifici dall'RNA di senso, portando all'amplificazione di cDNA non specifici.Mescolare delicatamente il contenuto dei pozzi e incubare la piastra a 55 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi, inattivare le reazioni riscaldando la piastra a 70 gradi Celsius per 15 minuti. Preparare un litro di tampone di lavaggio e rilegatura 2X in base alle indicazioni manoscritte e filtrare la soluzione.Successivamente, preparare 50 millilitri di tampone di lavaggio e rilegatura 1X utilizzando acqua di grado PCR. Trasferire il numero appropriato di perline magnetiche coniugate con streptavidina in un tubo da 1,5 millilitri, quindi lavarle aggiungendo un volume uguale di tampone di lavaggio e legame 2X e vortice del tubo per 15 secondi. Posizionare il tubo in un rack di separazione magnetico e incubarlo per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi, rimuovere con cura il supernatante senza disturbare le perline e aggiungere lo stesso volume del tampone di lavaggio e rilegatura 2X del volume iniziale delle perline. Vortice le perline per 30 secondi e trasferire 10 microlitri della sospensione ad un numero appropriato di tubi da 1,5 millilitri. Posizionare i tubi nel rack di separazione magnetica e incubarli per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi, scartare il supernatante e aggiungere 50 microlitri di lavaggio 2X e tampone di legame. Aggiungere 50 microlitri di cDNA biotinilato ai tubi corrispondenti con le perline e incubarli per 30 minuti ruotando delicatamente. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica per tre minuti, quindi lavare le perline con 200 microlitri di lavaggio 1X e tampone di legame, seguito da un'incubazione di tre minuti sul rack di separazione.Scartare il supernatante e ripetere il lavaggio due volte. Quindi, rimospendare le perline in 10 microlitri di acqua di grado PCR. Preparare un volume appropriato di PCR Master Mix in base alle indicazioni manoscritte.Mescolarlo bene e farlo girare rapidamente verso il basso, quindi trasferire 49 microlitri per pozzo su una piastra PCR da 96 po '. Vortice attento i tubi con il cDNA purificato per 15 secondi e aggiungere un microlitro della sospensione ai pozzi corrispondenti. Eseguire la PCR e separare i prodotti su un gel di agarosio dell'1%.Tagliare le bande dal gel e clonare i prodotti amplificati in un plasmide PCR 2.1. Quindi sequenziare i cloni e analizzare ogni sequenza. Le prime reazioni RT sono state eseguite con il regolare primer anti-senso non biotinylato e hanno portato ad un'amplificazione riuscita dell'ASP.Tuttavia, fu amplificata anche una banda dello stesso peso molecolare e controlli più minuscoli. Per aggirare questo problema, il primer anti-senso specifico è stato etichettato con biotin e il cDNA anti-senso risultante è stato purificato prima della PCR. Ciò ha permesso di amplificare la sequenza ASP con una contaminazione notevolmente ridotta dal cDNA non specifico nei controlli primer minus.Un'ulteriore ottimizzazione di questo metodo è stata ottenuta con la completa denaturazione dell'RNA a 94 gradi Celsius prima di RT, seguita dal raffreddamento immediato sull'acqua ghiacciata, che ha portato a un'amplificazione efficace della banda ASP e nessun prodotto non specifico. La cinetica dell'RNA ASP è stata misurata e le cellule CD4 isolate da tre soggetti sieropositiva con viremia rilevabile e assenza di terapia a seguito di stimolazione con anti-CD3/CD28. La quantificazione dell'RNA ASP è stata possibile anche in pazienti sottoposti ad ART, con viremia non rilevabile.In due pazienti su tre, l'RNA ASP è stato rilevato in bassi livelli a tre o cinque giorni dopo la stimolazione. Due pazienti sono stati analizzati per ASP e env RNA, uno non trattato e uno trattato. Per il paziente non trattato, entrambi gli RNA potrebbero essere rilevati.Per il paziente trattato, ASP e env erano a malapena rilevabili dopo diversi giorni di stimolazione. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la denaturazione linearizza l'RNA in modo che le strutture secondarie in grado di innescare RT siano distrutte. Mentre, il lavaggio delle perline lava via i cDNA non biotinilati.Dopo la purificazione dei cDNA con la polarità corretta, qPCR può essere eseguito per analizzare l'espressione genica. Inoltre, i cDNA possono anche essere clonati e utilizzati per l'analisi delle sequenze. Questo metodo consente di studiare i geni che si sovrappongono con orientamento opposto e può essere utile per chiarire la regolazione e la patogenesi di un batterio e di una malattia correlata al virus, compresi alcuni tipi di cancro.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analisi di terminazione della trascrizione Utilizzando BrUTP-strand-specifici Trascrizione Run-on (TRO) Approccio

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Ricerca

Genetica

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

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Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

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Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

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Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

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Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminazione e mappatura delle trascrizioni primarie ed elaborate nel mitocondrio di mais utilizzando una strategia circolare basata su RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...