Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

우리는 Patrizia Amelio, 알레산드라 노토, 크레이그 펜윅, 그리고 마티유 페로가 우리의 일과 에이즈 면역 요법 연구소의 모든 사람들에게 소중한 기술 지원을 위해 항상 토론할 수 있게 해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 또한 훌륭한 작품에 기여 VSB 어소시에이트 Inc.에서 존과 아론 웨들 감사드립니다. 마지막으로, 이 일이 가능하지 않았을 모든 환자에게 특별한 감사를 드립니다. 이 작품은 어떤 자금 조달 기관에서 특정 보조금을받지 않았다.

이 연구는 센터 병원 대학 Vaudois의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다 (CHUV).
1. HIV-1HXB2 균주를 가진 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 감염
<ol><li>
1일차: PBMC 자극
	<ol>
<li>건강한 기증자 버피 코트에서 PBMC를 분리합니다.</li>
		<li>전체 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니크를 포함하는 1640 배지에서 1x106/ mL의 농도로 PBMC를 ?...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

이 보고에서 우리는 HIV-1에 감염된 개별에게서 격리된 CD4+ T 세포에 있는 ASP RNA의 검출에 적용되는 가닥 특이적인 RT 분석방법을 기술합니다. RT 도중 비특이적인 프라이밍의 발생은 적당한 극성을 가진 RNA 전사체의 탐지를 방해하고, 결과의 오해로 이끌어 냅니다. 이전 그룹은 RT 반응 도중 프라이머 독립적인 cDNA 합성을 방지하기 위한 몇몇 전략을 개발했습니다. HIV와 관련이없는 서열로 3 '끝에서 ?...

안티센스 단백질(ASP) 유전자는 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 봉투(env) 유전자의 음성 가닥에 위치한 개방 판독 프레임(ORF)이며, 접합 gp120/gp411에걸쳐 있다. 지난 30 년 동안, 몇몇 보고는 HIV ASP 유전자가 실제로전사되고2,3,4,5,6,7,8,9, 번역된다는것을 보여주었습니다 . ASP 안티센스 전사체는 시험관 내에서완전히 특징지어졌지만, 최근까지 환자에서 ASP RNA의 실제 생산에 대한 정보는 여전히 누락되었다.
ASP의 시퀀스는 반전되고 상호 보완적이다. 이것은 ASP에 대한 성적 증명서를 검출하려고 할 때 주요 장애물을 나타냅니다. 표준 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 방법은 유전자 특이적 안티센스 프라이머를 사용하여 오른쪽 극성의 상보성 DNAs(cDNAs)를 합성합니다. 그러나 이러한 접근법은 초기 RNA 템플릿의 배향(감각 또는 안티센스)을 결정하는 것을 허용하지 않으며, RNA 헤어핀 또는 루프가프라이머(10)가없는 상태에서 양방향으로 RT를 프라임할 수 있기 때문에, RT 자체 프라이밍으로 알려진 현상이다. 대부분의 ASP 조사자들은 HIV-111,12와관련이 없는 시퀀스로 태그가 지정된 프라이머를 사용하여 RT 자체 프라이밍의 문제를 회피한다. 그러나 이러한 전략은 현상의 발생을 제거하지 않으며, 비특이적 cDNA를 PCR11로잠재적으로 이월시킬 수 있다.
우리는 최근에 안티센스 RNA의 연구 를 위한 새로운 가닥 특이적 RT-PCR 분석기를 개발하고 우리는 표 1에도시된 바와 같이 6명의 HIV 감염한 환자의 코호트에서 ASP RNA 검출을 위해 그것을 이용했습니다. 아래에 설명된 절차는 이전에 안토니오 만카렐라 외13에의해 출판되었습니다. 프로토콜에서는 이중 접근 방식으로 비특정 cDNA의 생산을 방지합니다. 첫째, 우리는 고온 (94 °C)에서 RNA를 분해하여 RNA 이차 구조를 제거하고, 둘째, 우리는 생체 별 ASP 특이적 프라이머를 사용하여 ASP RNA를 역전시키고 결과 cDNA를 정화합니다. 이 접근법에 의해, 우리는 다른 비특이적 RT 제품이 생성되는 것을 방지하거나 (RNA의 고온 변성) 또는 PCR (선호도 정제) 이전에 제거되기 때문에 우리의 목표 cDNA만 증폭할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

레트로바이러스에서, 안티센스 전사는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1) 및 인간 T-림프성 바이러스 1(HTLV-1)에서 모두 기재되었다. HIV-1에서, 안티센스 단백질 ASP 유전자는 접합 gp120/gp41에 걸친 독서 프레임 -2에서 env의 부정적인 가닥에 위치한다. 감지 방향에서 ASP 오픈 판독 프레임의 3' 끝은 gp120 초가변 영역 V4 및 V5와 겹칩니다. ASP RNA의 연구는 RT 자기 프라이밍으로 알려진 현상에 의해 좌절되었습니다, 이에 의해 RNA 이차 구조는 특정 프라이머의 부재에서 RT를 프라임 할 수있는 능력을 가지고, 비 특이적 cDNAs를 생성. RT 반응에서 생체 티니화 역 프라이머와 높은 RNA 변성의 결합 된 사용, 함께 스트렙타비딘 코팅 자기 구슬에 cDNA의 친화도 정제와 함께, 우리는 선택적으로 HIV-1에 감염된 개인에서 파생 된 CD4 + T 세포에서 ASP RNA를 증폭 할 수 있습니다. 우리의 방법은 상대적으로 저렴하고, 수행하기 쉽고, 매우 신뢰할 수 있고, 쉽게 재현 할 수 있습니다. 이 점에서, 그것은 뿐만 아니라 HIV-1에서 뿐만 아니라 다른 생물 학적 시스템에서 안티 센스 전사의 연구에 대 한 강력한 도구를 나타냅니다.

생체 연화 cDNA의 친화도 정제에 결합 된 고온 RNA 변성은 체외 및 환자로부터 분리 된 CD4 + T 세포에서 감염된 PBMC에서 PCR 동안 비 특이적 ASP 제품의 증폭을 방지합니다. RT 셀프 프라이밍은 안티센스 RNAs10,14,15,16,17의역전사 중에 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 현상을...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA 헤어핀 및 루프는 서열 특이적 프라이머가 없는 경우 역전사(RT)를 위한 프라이머로서 기능할 수 있으며, 중첩된 안티센스 전사체의 연구를 방해한다. 우리는 가닥 특정 RNA를 확인할 수 있는 기술을 개발했습니다, 우리는 HIV-1 안티센스 단백질 ASP를 공부하기 위하여 그것을 이용했습니다.

인간 면역 결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1) 안티 센스 단백질 (ASP) 가닥 특정 RT-PCR에 의해 환자에서 RNA 전사체의 검출

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

기존의 RT-PCR은 겹치는 유전자에 의해 인코딩된 RNA를 검출하는 데 사용될 때 감각과 반감각 서열 사이의 차별을 허용하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하면 특히 안티 센스 RNA를 감지 할 수 있습니다. 높은 RNA 데니션 온도와 함께 생체 화 프라이머를 사용하면 안티 센스 cDN의 증폭을 허용하여 비특이적 RT 제품의 형성을 방지합니다.우리는 ASP가 RNA 항감각 또는 단백질 전구체로서, 새로운 HIV 항원, 잠재적으로 치료를 위한 새로운 HIV 표적을 한다는 것을 보여주기 위하여 이 방법을 이용했습니다. 이 방법은 겹치는 유전자에서 반감각 RNA가 검출될 수 있는 어떤 시스템에도 적용될 수 있습니다. PanASP 프라이머 내부의 프로 바이러스 DNA 서열을 사용하여 환자 특정 프라이머를 설계하여 시작합니다.다음으로, RNA를 정량화하고 DNase로 견본을 취급하여 DNA 오염을 제거합니다. 총 RNA의 0.1 과 1 마이크로그램 사이를 96 개의 잘 PCR 플레이트에 적합한 우물로 옮기. 그런 다음 원고 방향에 따라 역 전사 또는 RT 반응을 설정합니다.ASP 역 프라이머 대신 뉴클레아제 프리 워터 5마이크로리터를 추가하여 내인성 RT 컨트롤을 준비한다. 플레이트를 열순환기로 넣고 RNA를 섭씨 94도로 5분간 가열합니다. 그런 다음 즉시 적어도 1 분 동안 차가운 물에 식힙니다.텍스트 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 튜브에서 반응 혼합물을 준비한 다음, 17.5 마이크로리터를 각 RNA에 우물을 함유한다. RNA 데니션은 섭씨 94도에서 수행해야 합니다. 총 내성 없이, 감각 RNA로부터 비특이적 제품의 합성이 발생할 수 있으며, 이는 비특이적 cDNA의 증폭으로 이어질 수 있다.우물의 내용물들을 부드럽게 섞고 접시를 섭씨 55도에서 60분간 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 70도까지 15분 동안 가열하여 반응을 비활성화합니다. 원고 방향에 따라 2X 세척 및 바인딩 버퍼 1리터를 준비하고 용액을 필터링합니다.다음으로 PCR 급수를 사용하여 1X 세척 및 바인딩 버퍼 50 밀리리터를 준비합니다. 적절한 수의 스트렙타비딘-유도 마그네틱 구슬을 1.5밀리리터 튜브로 옮은 다음, 2배의 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가하고 15초 동안 튜브를 소용돌이시켜 세척합니다. 튜브를 자기 분리 랙에 넣고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.그런 다음, 구슬을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하고 구슬의 초기 부피와 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 동일한 볼륨을 추가합니다. 구슬을 30초 동안 소용돌이게 하고 서스펜션의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 적절히 옮겨냅니다. 튜브를 자기 분리 랙에 놓고 실온에서 3 분 동안 배양하십시오.그런 다음 상체를 버리고 2X 세척 및 바인딩 버퍼의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 50 마이크로리터의 생체분해된 cDNA를 구슬로 해당 튜브에 추가하고 부드럽게 회전하면서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 3분 동안 자기 분리 랙에 튜브를 놓고 1X 세척 및 바인딩 버퍼의 200 마이크로리터로 구슬을 세척한 다음 분리 랙에 3분 배양을 합니다.상체를 버리고 두 번 씻는 것을 반복하십시오. 그런 다음, PCR 급수의 10 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다. 원고 방향에 따라 적절한 양의 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.잘 섞어서 빠르게 회전한 다음 잘 하면 49마이크로리터를 96개의 PCR 플레이트로 옮기습니다. 15초 동안 정제된 cDNA로 튜브를 조심스럽게 소용돌이치게 하고 해당 우물에 서스펜션의 마이크로리터 1개를 추가합니다. PCR을 실행하고 1 % 아가로즈 젤에 제품을 분리합니다.젤에서 밴드를 잘라 PCR 2.1 플라스미드로 증폭 된 제품을 복제합니다. 그런 다음 클론을 시퀀스하고 각 시퀀스를 분석합니다. 초기 RT 반응은 일반 비생물학적 안티센스 프라이머로 수행되었고 ASP의 성공적인 증폭을 초래했다.그러나, 동일한 분자량및 프라이머 마이너스 대조군의 밴드도 증폭되었다. 이러한 문제점을 우회하기 위해, 특정 반센스 프라이머는 비오틴으로 표지되었고, 그 결과 반감각 cDNA는 PCR 이전에 정제되었다. 이를 통해 프라이머 마이너스 컨트롤에서 비특이적 cDNA로부터의 오염이 크게 감소하여 ASP 서열을 증폭시킬 수 있었습니다.이 방법의 추가 최적화는 RT 이전에 섭씨 94도에서 RNA의 완전한 내포화에 의해 달성되었고, 얼음 물에 즉각적인 냉각을 거쳐 ASP 대역의 효과적인 증폭과 비특이적 제품이 발생하지 않았다. ASP RNA의 운동학은 검출 가능한 viremia및 항 CD3/CD28로 자극다음 치료의 부재를 가진 3개의 HIV 양성 과목에서 분리된 CD4 세포를 측정하고 CD4 세포. ASP RNA의 정량화는 또한 비 검출 가능한 viremia를 가진 ART를 겪고 있는 환자에서 가능했습니다.3명의 환자 중 2개에서 ASP RNA는 3~5일 후에 낮은 수준에서 자극을 받았다. 2명의 환자는 ASP와 env RNA를 위해 분석되었습니다, 1개는 치료되지 않고 1개 취급되었습니다. 치료되지 않은 환자를 위해, 둘 다 RNA를 검출할 수 있었습니다.치료된 환자를 위해, ASP및 env는 자극의 며칠 후에 거의 검출될 수 있었습니다. 이 절차를 시도할 때, 탈고가 RNA를 선형화하여 RT를 프라임할 수 있는 이차 구조물이 파괴된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 반면, 구슬의 세척은 비 생물학적 cDN을 씻어낸다.정확한 극성으로 cDNA를 정제한 후, qPCR은 유전자 발현을 분석하기 위해 수행될 수 있다. 또한 cDNA는 시퀀스 분석에도 복제되고 사용될 수 있습니다. 이 방법은 반대 방향으로 겹치는 유전자를 연구할 수 있게 해주며, 일부 유형의 암을 포함한 박테리아및 바이러스 관련 질병의 조절 및 병발생을 해명하는 데 유용할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

BrUTP 가닥 특정 전사 런타임에 (TRO) 접근 방식을 사용하여 전사의 종료의 분석

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

연구

유전학

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

박테리아에서 단백질 RNA 결합을 정량화하기위한 분석

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...