Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
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Agradecemos a Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick e Matthieu Perreau por estarem sempre disponíveis para discutir nosso trabalho e todas as pessoas do Laboratório de Imunopatogenigenese da AIDS por sua preciosa assistência técnica. Também gostaríamos de agradecer a John e Aaron Weddle da VSB Associated Inc. que contribuíram com excelente arte. Finalmente, muito agradecimento especial a todos os pacientes, sem os quais este trabalho não teria sido possível. Este trabalho não recebeu nenhuma subvenção específica de qualquer agência de financiamento.

Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. Infecção de células mononucleares periféricas do sangue (PBMCs) com cepaHIV-1 HXB2
<ol><li>
Dia 1: ESTIMULAÇÃO PBMCs
	<ol>
<li>Isolar PBMCs de um casaco de buffy doador saudável.</li>
		<li>Conde e resuspenda PBMCs auma concentração de 1x10 6/mL em completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio contendo 10% de sor...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

Neste relatório descrevemos um ensaio rt específico da cadeia aplicado à detecção de RNA ASP em células T CD4+ isoladas de indivíduos infectados pelo HIV-1. A ocorrência de escoramento não específico durante a RT dificulta a detecção de transcrições de RNA com a polaridade certa, levando à má interpretação dos resultados. Grupos anteriores desenvolveram várias estratégias destinadas a prevenir a síntese de CDNA independente durante a reação rt. Marcar a cartilha reversa no final do 3' com sequênci...

O gene da proteína antisense (ASP) é um quadro de leitura aberto (ORF) localizado na cadeia negativa do gene do envelope tipo 1 (HIV-1) do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1), abrangendo a junção gp120/gp411. Nos últimos 30 anos, vários relatos mostraram que o gene HIV ASP é de fato transcrito e traduzido2,3,4,5,6,7,8,9. Embora as transcrições antisense asp tenham sido totalmente caracterizadas in vitro, até recentemente, as informações sobre a produção real de RNA ASP em pacientes ainda estavam faltando.
A seqüência de ASP é reversa e complementar ao env. Isso representa um grande obstáculo ao tentar detectar transcrições para ASP. Os métodos padrão de reação em cadeia de transcrição reversa-polimerase (RT-PCR) usam primers antisenso específicos do gene para sintetizar DNAs complementares (CDNAs) da polaridade certa. Esta abordagem, no entanto, não permite determinar a orientação (sentido ou antisenso) do modelo inicial de RNA, uma vez que grampos de cabelo rna ou loops podem prime RT em ambas as direções, na ausência de primers10, um fenômeno conhecido como RT auto-priming. A maioria dos investigadores ASP contornar o problema da RT auto-priming usando primers marcados com seqüências que não estão relacionadas com o HIV-111,12. Esta estratégia, no entanto, não elimina a ocorrência do fenômeno, e pode levar a potencial recarga de cDNAs não específicas para o PCR11.
Recentemente desenvolvemos um novo ensaio RT-PCR específico da vertente para o estudo do RNA antisenso e o usamos para a detecção de RNA da ASP em uma coorte de seis pacientes infectados pelo HIV, como mostrado na Tabela 1. O procedimento descrito abaixo foi publicado anteriormente por Antonio Mancarella et al.13. Em nosso protocolo, evitamos a produção de CDNAs não específicos por uma abordagem dupla. Em primeiro lugar, eliminamos as estruturas secundárias de RNA desnatando rna a alta temperatura (94 °C) e, em segundo lugar, transcrevemos o RNA ASP usando uma cartilha específica de ASP biotinylated e purificam aafinidade do cDNA resultante. Por essa abordagem, somos capazes de amplificar apenas nosso cDNA alvo, uma vez que outros produtos RT não específicos são impedidos de serem gerados (desnaturação de alta temperatura de RNA) ou eliminados antes do PCR (purificação de afinidade).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Em retrovírus, a transcrição antisense tem sido descrita tanto no vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) quanto no vírus tinfotrópico T humano 1 (HTLV-1). No HIV-1, o gene asp de proteína antisense está localizado na vertente negativa da vv, no quadro de leitura -2, abrangendo a junção gp120/gp41. Na orientação de sentido, o final de 3' do quadro de leitura aberta asp se sobrepõe com gp120 regiões hipervariáveis V4 e V5. O estudo do RNA ASP foi frustrado por um fenômeno conhecido como RT-auto-priming, em que as estruturas secundárias de RNA têm a capacidade de prime RT na ausência da cartilha específica, gerando cDNAs não específicos. O uso combinado de alta desnaturação de RNA com primers reversos biotinylated na reação rt, juntamente com a purificação de afinidade do cDNA em contas magnéticas revestidas de streptavidin, nos permitiu amplificar seletivamente RNA ASP em células T CD4 + derivadas de indivíduos infectados com HIV-1. Nosso método é relativamente de baixo custo, simples de executar, altamente confiável e facilmente reproduzível. A este respeito, representa uma ferramenta poderosa para o estudo da transcrição antisense não só no HIV-1, mas também em outros sistemas biológicos.

Desnaturação de RNA de alta temperatura juntamente com a purificação de afinidade de cDNA biotinylated impede a amplificação de produtos ASP não específicos durante PCR em PBMCs infectados in vitro e em células T CD4+ isoladas dos pacientes. Rt auto-priming tem sido mostrado para ocorrer durante a transcrição reversa de RNAs antisense10,14,15,16,...

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Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Grampos de cabelo rna e loops podem funcionar como primers para transcrição reversa (RT) na ausência de primers específicos da seqüência, interferindo com o estudo de transcrições antisense sobrepostas. Desenvolvemos uma técnica capaz de identificar rna específico da cadeia, e nós o usamos para estudar a proteína antisense HIV-1 ASP.

Transcrições de RNA do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) em pacientes por RT-PCR específico

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Os RT-PCRs convencionais não permitem discriminação entre as sequências de sentido e anti-sentido quando usadas para detectar RNAs codificadas por genes sobrepostos. Este protocolo permite detectar especificamente RNAs anti-sentido. O uso de primers biotimilados, juntamente com altas temperaturas de desnaturação de RNA, permite a amplificação de cDNAs anti-sentido, impedindo a formação de produtos RT não específicos.Usamos este método para demonstrar que o ASP, seja como um anti-sentido de RNA ou um precursor de proteínas, é um novo antígeno do HIV, faz potencialmente um novo alvo de HIV para a terapia. Este método pode ser aplicado a qualquer sistema, no qual rnas anti-sentido de genes sobrepostos podem ser detectados. Comece projetando primers específicos do paciente usando a sequência de DNA pró-viral interna para os primers PanASP.Em seguida, quantifique o RNA e elimine a contaminação do DNA tratando amostras com DNase. Transfira entre 0,1 e um micrograma de RNA total para os poços apropriados em uma placa PCR de 96 poços. Em seguida, configure a transcrição reversa, ou reação RT, de acordo com as instruções do manuscrito.Prepare os controles RT endógenos adicionando cinco microliters de água livre de nuclease em vez do primer reverso ASP. Coloque a placa no termociclador e aqueça o RNA a 94 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, esfrie-o imediatamente em água gelada por pelo menos um minuto.Prepare a mistura de reação em um tubo de 1,5 mililitro, conforme descrito no manuscrito do texto, depois transfira 17,5 microliters para cada um dos poços contendo RNA. A desnaturação do RNA deve ser realizada a 94 graus centígrados. Sem a desnaturação total, podem ocorrer sínteses de produtos não específicos do RNA sentido, levando à amplificação de cDNAs não específicos.Misture o conteúdo dos poços suavemente e incubar a placa a 55 graus Celsius por 60 minutos. Em seguida, inativar as reações aquecendo a placa a 70 graus Celsius por 15 minutos. Prepare um litro de tampão de lavagem e ligação 2X de acordo com as instruções do manuscrito e filtre a solução.Em seguida, prepare 50 mililitros de lavagem 1X e tampão de ligação usando água de grau PCR. Transfira o número apropriado de contas magnéticas conjugadas com streptavidin para um tubo de 1,5 mililitro e depois lave-as adicionando um volume igual de lavagem 2X e tampão de ligação e vórtice do tubo por 15 segundos. Coloque o tubo em um rack de separação magnética e incuba-o por três minutos em temperatura ambiente.Em seguida, remova cuidadosamente o supernasciente sem perturbar as contas e adicione o mesmo volume do tampão de lavagem e ligação 2X como o volume inicial das contas. Vórtice as contas por 30 segundos e transfira 10 microliters da suspensão para um número apropriado de tubos de 1,5 mililitro. Coloque os tubos no rack de separação magnética e incuba-os por três minutos em temperatura ambiente.Em seguida, descarte o supernatante e adicione 50 microliters de lavagem 2X e tampão de ligação. Adicione 50 microlitadores de cDNA biotimilado aos tubos correspondentes com as contas e incuba-os por 30 minutos enquanto gira suavemente. Após a incubação, coloque os tubos no rack de separação magnética por três minutos e depois lave as contas com 200 microliters de 1X de lavagem e tampão de ligação, seguido de uma incubação de três minutos no rack de separação.Descarte o supernatante e repita a lavagem duas vezes. Em seguida, resuspenja as contas em 10 microliters de água de grau PCR. Prepare um volume apropriado de PCR Master Mix de acordo com as instruções do manuscrito.Misture bem e gire-o rapidamente para baixo, em seguida, transfira 49 microliters por poço para uma placa PCR de 96 poços. Cuidadosamente vórtice dos tubos com o cDNA purificado por 15 segundos e adicione um microliter da suspensão aos poços correspondentes. Execute o PCR e separe os produtos em um gel de 1% de agarose.Corte as bandas do gel e clone os produtos amplificados em um plasmídeo PCR 2.1. Em seguida, sequenciar os clones e analisar cada sequência. As reações iniciais de RT foram realizadas com o primer anti-sentido não bionilatado regular e resultaram em amplificação bem sucedida do ASP.No entanto, uma faixa do mesmo peso molecular e primer menos controles também foi amplificada. Para contornar esse problema, o primer anti-sentido específico foi rotulado com biotyn e o cDNA anti-sentido resultante foi purificado antes do PCR. Isso possibilitou amplificar a sequência ASP com contaminação muito reduzida do cDNA não específico no primer menos controles.A otimização adicional deste método foi alcançada pela desnaturação completa do RNA a 94 graus Celsius antes da TR, seguida pelo resfriamento imediato da água gelada, o que resultou em amplificação efetiva da banda ASP e sem produtos não específicos. A cinética do ASP RNA foi medida e as células CD4 isoladas de três indivíduos hiv positivos com viremia detectável e ausência de terapia após estimulação com anti-CD3/CD28. A quantificação do RNA ASP também foi possível em pacientes submetidos à TARV, com viremia não detectável.Em dois em cada três pacientes, o RNA ASP foi detectado em níveis baixos em três a cinco dias pós-estimulação. Dois pacientes foram analisados para ASP e env RNAs, um não tratado e um tratado. Para o paciente não tratado, ambos os RNAs poderiam ser detectados.Para o paciente tratado, ASP e env mal foram detectáveis após vários dias de estimulação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a desnaturação lineariza o RNA para que estruturas secundárias capazes de primor RT sejam destruídas. Considerando que a lavagem das contas afasta os cDNAs não bionilatados.Após a purificação dos cDNAs com a polaridade correta, o qPCR pode ser realizado para analisar a expressão genética. Além disso, cDNAs também podem ser clonados e usados para análise de sequência. Este método permite estudar genes sobrepostos em orientação oposta e pode ser útil na regulação elucidação de uma bactéria e de uma doença relacionada ao vírus, incluindo alguns tipos de câncer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Análise de terminação da transcrição Usando Approach (TRO) específico BrUTP vertente Transcrição Run-on

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Genética

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adaptação 3' rápida amplificação do CDNA termina para mapear transcritos em câncer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Determinante 3'-Termini e sequências de moléculas de ADN Viral de Single-Stranded nascente durante o HIV-1 inverter transcrição em células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminação e mapeamento das transcrições primárias e processadas em Mitocídrias de milho usando uma estratégia circular RT-PCR-based

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...