Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Мы благодарим Патрицию Амелио, Алессандру Ното, Крейга Фенвика и Матье Перро за то, что они всегда были доступны для обсуждения нашей работы и всех людей в Лаборатории иммунопатогенеза СПИДа за их драгоценную техническую помощь. Мы также хотели бы поблагодарить Джона и Аарона Уэддла из VSB Associated Inc., которые внесли свой вклад с отличными произведениями искусства. Наконец, большое спасибо всем пациентам, без которых эта работа была бы невозможна. Эта работа не получила никаких конкретных субсидий от какого-либо финансируемого учреждения.

Это исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Центра Госпитальер Университета Vaudois (CHUV).
1. Заражение периферических клеток крови (ПБМК) штаммом ВИЧ-1HXB2
<ol><li>
День 1: ПБМЦ СТИМУЛЯЦИЯ
	<ol>
<li>Изолировать PBMCs от здорового донора баффи п...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

В этом отчете мы описываем специфический rt-расса, применяемый к обнаружению АСП РНК в клетках CD4', изолированных от людей, инфицированных ВИЧ-1. Появление неспецифических грунтовок во время RT препятствует обнаружению РНК стенограммы с правом полярности, что приводит к неправильной инте?...

Антисмыслового белка (ASP) ген астровая рамка чтения (ORF) расположена на отрицательной нити вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) конверт (env) ген, охватывающий соединение gp120/gp411. За последние 30 лет, несколько докладов показали, что ген ВИЧ ASP действительно транскрибируется и переводится2,3,4,5,6,7,8,9. Хотя ASP антисмысл стенограммы были полностью охарактеризованы в пробирке, до недавнего времени информация о фактическом производстве ASP РНК у пациентов по-прежнему отсутствует.
Последовательность ASP обратная и дополняет env. Это представляет собой серьезное препятствие при попытке обнаружить транскрипты для ASP. Стандартные методы обратной транскрипции-полимеразы цепной реакции (RT-PCR) используют генно-специфические антисмысловые праймеры для синтеза дополнительных ДНС (cDNA) правильной полярности. Этот подход, однако, не позволяет определить ориентацию (чувство или антисмысл) первоначального шаблона РНК, так как РНК шпильки или петли могут премьер RT в обоих направлениях в отсутствие праймеров10, явление, известное как RT само-priming. Большинство следователей ASP обойти проблему RT самопремьера с помощью грунтовки помечены последовательностей, которые не связаны с ВИЧ-111,12. Эта стратегия, однако, не устраняет возникновение этого явления, и может привести к потенциальному переносу неспецифических CDNA в ПЦР11.
Недавно мы разработали новый strand-специфический RT-PCR исследование для изучения антисмысловой РНК, и мы использовали его для обнаружения ASP РНК в когорте из шести ВИЧ-инфицированных пациентов, как показано в таблице 1. Процедура, описанная ниже, была ранее опубликована Антонио Mancarella и др.13. В нашем протоколе мы избегаем производства неспецифических КДНС с помощью двойного подхода. Во-первых, мы устраняем РНК вторичных структур путем денатурации РНК при высокой температуре (94 градусов по Цельсию), а во-вторых, мы вспять транскрибирования АСП РНК с помощью биотиниляции ASP-специфической грунтовки и сродство-очистить результирующую кДНК. При таком подходе мы можем усилить только нашу целевую кДНК, так как другие неспецифические продукты RT либо предотвращаются от генерирования (высокая денатурация РНК), либо устраняются до ПЦР (очистка сродства).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

В ретровирусах антисмысловая транскрипция была описана как в вирусе иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), так и в Т-лимфотропном вирусе человека 1 (HTLV-1). В ВИЧ-1, антисмыслового белка ASP ген расположен на отрицательной нити env, в кадре чтения -2, охватывающих соединение gp120/gp41. В смысле ориентации, 3' конец ASP открытой рамки чтения перекрывается с gp120 гиперпеременных регионов V4 и V5. Изучение АСП РНК было сорвано явление, известное как RT-само-первичности, в котором РНК вторичных структур имеют возможность премьер RT в отсутствие конкретных грунтовки, генерации неспецифических cDNAs. Комбинированное использование высокой денатурации РНК с биотинизатированными обратными грунтовками в реакции RT, а также очищение кДНК на стрептавидин-покрытие магнитных бусинов, позволило нам селективно усилить АСП РНК в CD4 "T-клеток, полученных от лиц, инфицированных ВИЧ-1. Наш метод относительно недорогой, простой в исполнении, очень надежный и легко воспроизводимый. В этом отношении он представляет собой мощный инструмент для изучения антисмысловой транскрипции не только в ВИЧ-1, но и в других биологических системах.

Высокая температура ДНК-денатурации в сочетании с очищением сродства биотинизатной кДНК предотвращает усиление неспецифических продуктов ASP во время ПЦР в ПБМК, инфицированных в пробирке и в клетках CD4 'T, изолированных от пациентов. Было показано, что самоприящеество RT происходит...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

РНК шпильки и петли могут функционировать в качестве праймеров для обратной транскрипции (RT) в отсутствие последовательности конкретных грунтовки, вмешиваясь в изучение перекрывающихся антисмысловых стенограмм. Мы разработали метод, способный выявлять РНК, специфичную для прядей, и мы использовали ее для изучения антисмыслового белка ВИЧ-1 ASP.

Обнаружение вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) Антисмысление белка (ASP) РНК Стенограммы у пациентов Strand-специфический RT-PCR

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Обычные РТ-ПЦР не допускают дискриминации между смыслом и анти-чувственных последовательностей при использовании для обнаружения РНК, кодируемых перекрывающимися генами. Этот протокол позволяет обнаруживать конкретно анти-смысл РНК. Использование биотинилированных грунтовок наряду с высокой температурой денатурации РНК позволяет усиление анти-чувственных цДНК, предотвращая образование неспецифических продуктов RT.Мы использовали этот метод, чтобы продемонстрировать, что ASP либо как РНК анти-чувство или белка предшественника, это новый антиген ВИЧ, делает это потенциально новый целевой ВИЧ для терапии. Этот метод может быть применен к любой системе, в которой анти-чувство РНК от перекрывающихся генов могут быть обнаружены. Начните с проектирования пациента конкретных грунтовки с использованием провирусной последовательности ДНК внутренних PanASP грунтовки.Далее, количественно РНК и устранить загрязнение ДНК путем лечения образцов с DNase. Передача от 0,1 до одного микрограмма общей РНК в соответствующие скважины на 96 скважин ПЦР пластины. Затем установите обратную транскрипцию, или реакцию RT, в соответствии с рукописными указаниями.Подготовьте эндогенные элементы управления RT, добавив пять микролитров нуклеазной свободной воды вместо реверсной грунтовки ASP. Положите пластину в термоциклер и нагреть РНК до 94 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем немедленно охладить его в ледяной воде, по крайней мере одну минуту.Подготовь реакционной смеси в 1,5 миллилитровую трубку, как описано в текстовой рукописи, а затем передать 17,5 микролитров для каждой из РНК, содержащей скважины. ДЕНАтурация РНК должна проводиться при 94 градусах по Цельсию. Без тотальной денатурации могут возникать синтезы неспецифических продуктов из смысловой РНК, что приводит к усилению неспецифических цДНА.Смешайте содержимое колодцев осторожно и инкубировать пластину при 55 градусах по Цельсию в течение 60 минут. Затем инактивировать реакции, нагревая пластину до 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Подготовь один литр 2X стирального и связывающего буфера в соответствии с рукописными указаниями и отфильтруй решение.Затем подготовьте 50 миллилитров 1X стирального и связывающего буфера с использованием воды класса PCR. Перенесите соответствующее количество стрептавидин-конъюгированных магнитных бусин в 1,5 миллилитровую трубку, затем помойте их, добавив равный объем 2X стирального и связывающего буфера и вихревого трубки в течение 15 секунд. Поместите трубку в магнитную стойку разделения и инкубировать его в течение трех минут при комнатной температуре.Затем аккуратно удалите супернатант, не нарушая бисера и добавьте тот же объем 2X стирального и связывающего буфера, что и первоначальный объем бисера. Вихрь бисера в течение 30 секунд и передачи 10 микролитров подвески в соответствующее количество 1,5 миллилитров труб. Поместите трубки в магнитную стойку разделения и инкубировать их в течение трех минут при комнатной температуре.Затем отбросьте супернатант и добавьте 50 микролитров 2X стирального и связывающего буфера. Добавьте 50 микролитров биотинилированного кДНА в соответствующие трубки с бисером и инкубировать их в течение 30 минут, мягко вращаясь. После инкубации поместите трубки на магнитную стойку разделения в течение трех минут, затем помойте бисер 200 микролитров 1X стирального и связывающего буфера, а затем трехминутную инкубацию на стойке разделения.Откажитесь от супернатанта и повторите стирку дважды. Затем, повторного незаменимия бисера в 10 микролитров воды класса ПЦР. Подготовь соответствующий том PCR Master Mix в соответствии с рукописными указаниями.Смешайте его хорошо и быстро спина его вниз, а затем передать 49 микролитров на колодец в 96 хорошо ПЦР пластины. Тщательно вихревые трубки с очищенным cDNA в течение 15 секунд и добавить один микролитер подвески к соответствующим скважинам. Запустите ПЦР и разделите продукты на 1%agarose гель.Вырежьте полосы из геля и клонировать усиленные продукты в ПЦР 2.1 плазмида. Затем секвенируйте клонов и проанализируйте каждую последовательность. Первоначальные реакции RT были выполнены с регулярной не биотинилированной анти-смысл грунтовка и привело к успешному усилению ASP.Тем не менее, полоса того же молекулярного веса и грунтовки минус элементы управления также была усилена. Чтобы обойти эту проблему, специфическая анти-чувство грунтовка была помечена биотина и в результате анти-чувство cDNA был очищен до ПЦР. Это позволило усилить последовательность ASP с значительно уменьшенным загрязнением от неспецифического cDNA в грунтовки минус управления.Дальнейшая оптимизация этого метода была достигнута путем полной денатурации РНК при 94 градусах Цельсия до RT, а затем немедленного охлаждения ледяной воды, что привело к эффективному усилению полосы ASP и отсутствие неспецифических продуктов. Кинетики ASP РНК были измерены и CD4 клетки изолированы от трех ВИЧ-позитивных субъектов с обнаруживаемой вирусемии и отсутствие терапии после стимуляции с анти-CD3/CD28. Количественная оценка РНК ASP также возможна у пациентов, проходящих АРТ, с необнамечиваемой вирусемией.У двух из трех пациентов, ASP РНК была обнаружена в низких уровнях в три-пять дней после стимуляции. Два пациента были проанализированы на ASP и env РНК, один необработанных и один лечение. Для необработанного пациента, оба РНК могут быть обнаружены.Для лечения пациента, ASP и env были едва заметны после нескольких дней стимуляции. При попытке этой процедуры, важно помнить, что денатурация linearizes РНК так, что вторичные структуры, способные премьер RT разрушаются. В то время как мытье бисера смывает не биотинилированные цДНА.После очищения цДНК с правильной полярностью, qPCR может быть выполнен для анализа экспрессии генов. Кроме того, cDNAs также могут быть клонированы и использованы для анализа последовательности. Этот метод позволяет изучать гены, перекрывающиеся в противоположной ориентации, и может быть полезен в выяснении регуляции и патогенеза бактерий и связанных с вирусом заболеваний, включая некоторые виды рака.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Анализ терминации транскрипции с помощью BrUTP прядей специфичную Транскрипция выбега (TRO) подход

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Определение последовательности зарождающейся вирусной ДНК одноцепочечной молекул во время ВИЧ-1 и 3'-Термини обратный транскрипции в инфицированных клетках

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Анализ для количественной протеино-РНК Связывания в бактериях

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Идентификация следов РНК:Белковые комплексы через РНК иммунопреципиция в Тандеме После секвенирования (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Дискриминация и картирование первичных и обработанных стенограмм в митохондрии кукурузы с использованием круговой стратегии на основе РТ-ПЦР

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...