Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
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Agradecemos a Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick y Matthieu Perreau por estar siempre disponibles para discutir nuestro trabajo y todas las personas en el Laboratorio de Inmunopatógenos del SIDA por su valiosa asistencia técnica. También nos gustaría dar las gracias a John y Aaron Weddle de VSB Associated Inc. que contribuyeron con excelentes obras de arte. Por último, muchas gracias especiales a todos los pacientes, sin los cuales este trabajo no habría sido posible. Este trabajo no recibió ninguna subvención específica de ninguna agencia de financiación.

Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Centro Hospitalario Universitario Vaudois (CHUV).
1. Infección de células mononucleares de sangre periférica (PPBCM) con cepaVIH-1 HXB2
<ol><li>
Día 1: ESTIMULACION DE PBMCs
	<ol>
<li>Aísle los PBL de un abrigo buffy de donante saludable.</li>
		<li>Contar y resuspender pbMUCs a una concentración de 1x106/ml en el medio completo Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 que co...

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	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

En este informe describimos un ensayo RT específico de hebra aplicado a la detección de ARN ASP en células T CD4+ aisladas de individuos infectados con VIH-1. La aparición de cebado no específico durante RT dificulta la detección de transcripciones de ARN con la polaridad derecha, lo que lleva a una interpretación errónea de los resultados. Grupos anteriores han desarrollado varias estrategias destinadas a prevenir la síntesis de ADNc independiente de imprimación durante la reacción RT. Etiquetar la imprimaci?...

El gen de la proteína antisentido (ASP) es un marco de lectura abierto (ORF) situado en la cadena negativa del gen de sobre de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), que abarca la unión gp120/gp411. En los últimos 30 años, varios informes han demostrado que el gen del VIH ASP es de hecho transcrito y traducido2,3,4,5,6,7,8,9. Aunque las transcripciones antisentido ASP se han caracterizado completamente in vitro,hasta hace poco faltaba información sobre la producción real de ARN ASP en pacientes.
La secuencia de ASP es inversa y complementaria a env. Esto representa un obstáculo importante al intentar detectar transcripciones para ASP. Los métodos estándar de reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa (RT-PCR) utilizan imprimaciones antisentidos específicas genéticas para sintetizar los ADN complementarios (CNNAs) de la polaridad derecha. Este enfoque, sin embargo, no permite determinar la orientación (sentido o antisentido) de la plantilla inicial de ARN, ya que las horquillas o bucles de ARN pueden preparar RT en ambas direcciones en ausencia de imprimaciones10,un fenómeno conocido como autocebado RT. La mayoría de los investigadores de ASP desvían el problema de la autocebación RT utilizando imprimaciones etiquetadas con secuencias que no están relacionadas con HIV-111,12. Esta estrategia, sin embargo, no elimina la ocurrencia del fenómeno, y puede conducir a la posible prórroga de los CDNa no específicos en el PCR11.
Recientemente hemos desarrollado un nuevo ensayo RT-PCR específico de hebra para el estudio del ARN antisentido y lo hemos utilizado para la detección de ARN ASP en una cohorte de seis pacientes infectados por el VIH, como se muestra en la Tabla 1. El procedimiento descrito a continuación ha sido publicado previamente por Antonio Mancarella et al.13. En nuestro protocolo, evitamos la producción de CDNA no específicos mediante un enfoque dual. En primer lugar, eliminamos las estructuras secundarias de ARN desnaturalizando el ARN a alta temperatura (94 oC) y, en segundo lugar, invertimos el ARN ASP mediante una imprimación biotinilada específica de ASP y purificamos la afinidad del ADNC resultante. Con este enfoque, somos capaces de amplificar sólo nuestro ADNc objetivo, ya que se impide que otros productos RT no específicos se generen (desnaturalización a alta temperatura del ARN) o se eliminen antes de la PCR (purificación de afinidad).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

En retrovirus, la transcripción del antisentido se ha descrito tanto en el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) como en el virus t-linfotrópico humano 1 (HTLV-1). En HIV-1, el gen ASP de proteína antisentido se encuentra en la cadena negativa de env, en el marco de lectura -2, que abarca la unión gp120/gp41. En la orientación del sentido, el extremo de 3' del marco de lectura abierto ASP se superpone con las regiones hipervariables gp120 V4 y V5. El estudio del ARN ASP se ha visto frustrado por un fenómeno conocido como RT-autocebado, por el que las estructuras secundarias de ARN tienen la capacidad de primar RT en ausencia de la imprimación específica, generando cDNAs no específicos. El uso combinado de alta desnaturalización de ARN con imprimaciones inversas biotiniadas en la reacción RT, junto con la purificación de afinidad del ADNc sobre cuentas magnéticas recubiertas de estreptavidina, nos ha permitido amplificar selectivamente el ARN ASP en células T CD4+ derivadas de individuos infectados con VIH-1. Nuestro método es relativamente bajo costo, fácil de realizar, altamente confiable y fácilmente reproducible. En este sentido, representa una poderosa herramienta para el estudio de la transcripción antisentido no sólo en el VIH-1, sino también en otros sistemas biológicos.

La desnaturalización del ARN a alta temperatura acoplada a la purificación de afinidad de ADNc biotintilado evita la amplificación de productos ASP no específicos durante la PCR en PPBPc infectados in vitro y en células T CD4+ aisladas de pacientes. Se ha demostrado que el autocebado RT se produce durante la transcripción inversa de los ARN antisentido10,14,15,16,<sup ...

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Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Las horquillas y bucles de ARN pueden funcionar como imprimaciones para la transcripción inversa (RT) en ausencia de imprimaciones específicas de secuencia, interfiriendo con el estudio de transcripciones antisentido superpuestas. Hemos desarrollado una técnica capaz de identificar el ARN específico de las hebras, y lo hemos utilizado para estudiar la proteína antisentido VIH-1 ASP.

Detección de transcripciones de ARN de proteína antisentido (VIH-1) de proteína antisentido (VIH-1) en pacientes por RT-PCR específico de Hebra

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Los RT-PCR convencionales no permiten la discriminación entre las secuencias de sentido y anti-sentido cuando se utilizan para detectar ARN codificados por genes superpuestos. Este protocolo permite detectar ARN específicamente antien sentido. El uso de imprimaciones biotiliadas junto con altas temperaturas de desnaturalización del ARN permite la amplificación de los ARN antientales, evitando la formación de productos RT no específicos.Hemos utilizado este método para demostrar que ASP ya sea como un ARN anti-sentido o un precursor de proteínas, es un nuevo antígeno vih, lo hace potencialmente un nuevo objetivo de VIH para la terapia. Este método se puede aplicar a cualquier sistema, en el que se pueden detectar ARN antien sentido de genes superpuestos. Comience diseñando imprimaciones específicas para pacientes utilizando la secuencia de ADN pro-viral interna de las imprimaciones PanASP.A continuación, cuantifique el ARN y elimine la contaminación del ADN mediante el tratamiento de muestras con DNase. Transfiera entre 0,1 y un microgramo de ARN total a los pozos apropiados en una placa PCR de 96 pozos. A continuación, configure la transcripción inversa, o reacción RT, de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Prepare los controles RT endógenos añadiendo cinco microlitros de agua libre de nucleasas en lugar de la imprimación inversa ASP. Ponga la placa en el termociclador y caliente el ARN a 94 grados Celsius durante cinco minutos. A continuación, refrésquelo inmediatamente en agua helada durante al menos un minuto.Preparar la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros como se describe en el manuscrito de texto, luego transferir 17,5 microlitros a cada uno de los pozos que contienen ARN. La desnaturalización del ARN debe realizarse a 94 grados centígrados. Sin desnaturalización total, pueden producirse síntesis de productos no específicos a partir del ARN de detección, lo que conduce a la amplificación de los ARN no específicos.Mezclar el contenido de los pozos suavemente e incubar la placa a 55 grados Celsius durante 60 minutos. Luego, inactivar las reacciones calentando la placa a 70 grados Celsius durante 15 minutos. Prepare un litro de tampón de lavado y encuadernación 2X de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y filtre la solución.A continuación, prepare 50 mililitros de tampón de lavado y unión 1X con agua de grado PCR. Transfiera el número adecuado de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina a un tubo de 1,5 mililitros y lávelos añadiendo un volumen igual de tampón de lavado y unión 2X y vórtice el tubo durante 15 segundos. Coloque el tubo en un bastidor de separación magnética e in incubarlo durante tres minutos a temperatura ambiente.A continuación, retire cuidadosamente el sobrenadante sin alterar las perlas y agregue el mismo volumen del tampón de lavado y unión 2X que el volumen inicial de las perlas. Vórtice las perlas durante 30 segundos y transfiera 10 microlitros de la suspensión a un número adecuado de tubos de 1,5 mililitros. Coloque los tubos en el bastidor de separación magnética e incubarlos durante tres minutos a temperatura ambiente.A continuación, deseche el sobrenadante y agregue 50 microlitros de tampón de lavado y unión 2X. Añadir 50 microlitros de ADNc biotilatada a los tubos correspondientes con las perlas e incubarlos durante 30 minutos mientras gira suavemente. Después de la incubación, coloque los tubos en el bastidor de separación magnética durante tres minutos y luego lave las perlas con 200 microlitros de tampón de lavado y unión 1X, seguido de una incubación de tres minutos en el bastidor de separación.Deseche el sobrenadante y repita el lavado dos veces. Luego, resuspender las cuentas en 10 microlitros de agua de grado PCR. Preparar un volumen apropiado de PCR Master Mix de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Mezclar bien y girar rápidamente hacia abajo, a continuación, transferir 49 microlitros por pozo a una placa PCR de 96 pozos. Atrafirque cuidadosamente los tubos con el ADNc purificado durante 15 segundos y añada un microlitro de la suspensión a los pozos correspondientes. Ejecute el PCR y separe los productos en un gel de 1% de agarosa.Cortar las bandas del gel y clonar los productos amplificados en un plásmido PCR 2.1. A continuación, secuencia los clones y analiza cada secuencia. Las reacciones RT iniciales se realizaron con la imprimación antien sentido regular no biotilada y dieron lugar a una amplificación exitosa de ASP.Sin embargo, también se amplificó una banda con el mismo peso molecular y controles de imprimación menos. Para evitar este problema, la imprimación antien sentido específica fue etiquetada con biotón y el ADNn anti-detección resultante fue purificado antes de PCR. Esto hizo posible amplificar la secuencia ASP con una contaminación muy reducida del ADNc no específico en los controles de imprimación menos.La optimización adicional de este método se logró mediante la desnaturalización completa del ARN a 94 grados centígrados antes de RT, seguido de un enfriamiento inmediato en el agua helada, lo que dio lugar a una amplificación efectiva de la banda ASP y no hay productos no específicos. Se midió la cinética del ARN ASP y se aislaron las células CD4 de tres sujetos VIH positivos con viremia detectable y la ausencia de terapia tras la estimulación con anti-CD3/CD28. La cuantificación del ARN ASP también fue posible en pacientes sometidos a TAR, con viremia no detectable.En dos de cada tres pacientes, el ARN ASP se detectó en niveles bajos a los tres a cinco días después de la estimulación. Se analizaron dos pacientes para ASP y ENv RNAs, uno sin tratar y otro tratado. Para el paciente no tratado, ambos ARN podrían ser detectados.Para el paciente tratado, ASP y env fueron apenas detectables después de varios días de estimulación. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la desnaturalización linealiza el ARN para que se destruyan las estructuras secundarias capaces de primar rt. Mientras que, el lavado de las cuentas elimina los cDNAs no biotilidades.Después de la purificación de los cDNAs con la polaridad correcta, qPCR se puede realizar para analizar la expresión génica. Además, los cDNAs también se pueden clonar y utilizar para el análisis de secuencias. Este método permite estudiar genes superpuestos en orientación opuesta y puede ser útil para dilucidar la regulación y la patogénesis de una bacteria y una enfermedad relacionada con el virus, incluidos algunos tipos de cáncer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Análisis de terminación de la transcripción Uso Enfoque BrUTP-capítulo específico de la transcripción de ejecución en (TRO)

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Investigación

Genética

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Un ensayo para cuantificar la unión de proteínas y ARN en bacterias

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificación de Huellas de ARN:Complejos proteicos a través de la inmunoprecipitación de ARN en tándem seguido de secuenciación (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Discriminción y mapeo de las transcripciones primarias y procesadas en mitocondrion de maíz utilizando una estrategia circular basada en RT-PCR

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...