Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Vi tackar Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick och Matthieu Perreau för att alltid vara tillgänglig för att diskutera vårt arbete och alla människor i laboratoriet för AIDS Immunopathogenes för deras dyrbara tekniskt bistånd. Vi skulle också vilja tacka John och Aaron Weddle från VSB Associated Inc. som bidrog med utmärkt konstverk. Slutligen, många speciella tack till alla patienter, utan vilka detta arbete inte skulle ha varit möjligt. Detta arbete fick inget särskilt bidrag från någon finansierings myndighet.

Denna studie godkändes av den institutionella prövnings nämnden vid Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).
1. infektion av perifera mononukleära blodceller (PBMCs) med HIV-1ande HXB2 stam
<ol><li>
Dag 1: PBMCs-stimulering
	<ol>
<li>Isolera PBMCs från en hälsosam donator Buffy Coat.</li>
		<li>Räkna och Omsuspendera PBMCs vid en koncentration av 1x106/ml i komplett Roswell Park Memorial Institute (rpmi) 1640 medium innehållande 10% feta...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

I denna rapport beskriver vi en strand-specifik RT-analys tillämpas för detektion av ASP-RNA i CD4 + T-celler isolerade från individer infekterade med HIV-1. Förekomsten av icke-specifik grundning under RT hämmar detekteringen av RNA-utskrifter med rätt polaritet, vilket leder till feltolkning av resultaten. Tidigare grupper har utvecklat flera strategier som syftar till att förebygga primer-oberoende cDNA-syntes under RT-reaktionen. Tagga omvänd primer vid 3 ' med sekvenser som inte är relaterade till hiv har v...

Den antisense protein (ASP) genen är en öppen läsbild (ORF) ligger på den negativa del av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) kuvert (ENV) gen, som spänner över korsningen gp120/gp411. Under de senaste 30 åren har flera rapporter visat att hiv ASP-genen verkligen transkriberas och översätts2,3,4,5,6,7,8,9. Även om ASP antisense-transkriptioner har präglats fullt ut in vitro, tills nyligen information om den faktiska produktionen av ASP RNA hos patienter saknades fortfarande.
Sekvensen av ASP är omvänd och kompletterar ENV. Detta är ett stort hinder när du försöker identifiera utskrifter för ASP. Standard metoden omvänd Transkription-polymeras kedjereaktion (RT-PCR) använder genspecifika antisense primers för att syntetisera kompletterande DNAs (cDNAs) av rätt polaritet. Detta tillvägagångssätt, dock inte tillåter att bestämma orientering (mening eller antisense) av den initiala RNA-mall, eftersom RNA hårnålar eller loopar kan Prime RT i båda riktningarna i avsaknad av primers10, ett fenomen som kallas RT Self-priming. De flesta ASP utredare kringgå problemet med RT Self-priming med primers märkta med sekvenser som inte är relaterade till hiv-111,12. Denna strategi eliminerar dock inte uppkomsten av fenomenet, och kan leda till potentiell överföring av icke-specifik cDNAs till PCR11.
Vi har nyligen utvecklat en ny strand-specifik RT-PCR-analys för studiet av antisense RNA och vi har använt det för ASP RNA detektion i en kohort av sex HIV-infekterade patienter, som visas i tabell 1. Det förfarande som beskrivs nedan har tidigare publicerats av Antonio Mancarella et al.13. I vårt protokoll undviker vi att produktionen av icke-specifika cDNAs med en dubbel metod. För det första eliminerar vi RNA sekundära strukturer genom denaturering RNA vid hög temperatur (94 ° c), och för det andra, vi omvänd transkribera ASP RNA med hjälp av en en ASP-specifik primer och affinitet-rena den resulterande cDNA. Genom detta tillvägagångssätt kan vi förstärka endast vårt mål cDNA, eftersom andra icke-specifika RT produkter antingen hindras från att genereras (hög temperatur denaturering av RNA) eller elimineras före PCR (affinitetsrening).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

I retrovirus, antisense transkription har beskrivits i både humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) och humant T-lymfotropic virus 1 (HTLV-1). Vid HIV-1 ligger antisense protein ASP-genen på den negativa del av ENV, i läsramen-2, som spänner över korsningen gp120/gp41. I avkänningen orientering, 3 ' slutet av ASP öppna läsbild överlappar gp120 hypervariabel regioner v4 och v5. Studiet av ASP RNA har omintetgjorts av ett fenomen som kallas RT-Self-priming, varvid RNA sekundära strukturer har förmågan att Prime RT i avsaknad av den specifika primer, genererar icke-specifika cDNAs. Den kombinerade användningen av hög RNA-denaturering med biotinylerade omvänd primers i RT reaktion, tillsammans med affinitet rening av cDNA på streptavidin-belagda magnetiska pärlor, har tillåtit oss att selektivt förstärka ASP RNA i CD4 + T-celler som härrör från individer infekterade med HIV-1. Vår metod är relativt låg kostnad, enkel att utföra, mycket tillförlitlig, och enkelt reproducerbara. I detta avseende är det ett kraftfullt verktyg för studiet av antisense transkription inte bara i HIV-1 utan även i andra biologiska system.

Hög temperatur RNA-denaturering kopplad till affinitetsrening av biotinylerat cDNA förhindrar förstärkning av icke-specifika ASP-produkter under PCR i PBMCs-infekterade in vitro och i CD4 + T-celler isolerade från patienter. RT Self-priming har visats inträffa vid omvänd Transkription av antisense rnas10,14,15,16,17. För att förhindra detta f...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA hårnålar och slingor kan fungera som primers för omvänd Transkription (RT) i avsaknad av sekvens-specifika primers, störa studien av överlappande antisense avskrifter. Vi har utvecklat en teknik som kan identifiera strandspecifika RNA, och vi har använt det för att studera HIV-1 antisense protein ASP.

Detektion av humant immunbrist virus typ 1 (HIV-1) RNA-avskrifter för antisense protein (ASP) hos patienter med programspecifika RT-PCR-

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Konventionella RT-PCRs tillåter inte diskriminering mellan förnuftet och anti-sense sekvenser när de används för att upptäcka RNAs kodas av överlappande gener. Detta protokoll gör det möjligt att upptäcka specifikt anti-sense RNAs. Användningen av en biotynylated primers tillsammans med höga RNA denaturering temperaturer möjliggör förstärkning av anti-sense cDNAs, förhindra bildandet av icke-specifika RT-produkter.Vi har använt denna metod för att visa att ASP antingen som en RNA anti-sense eller ett protein föregångare, det är en ny HIV-antigen, gör det potentiellt en ny HIV-mål för terapi. Denna metod kan tillämpas på alla system, där anti-sense RNAs från överlappande gener kan upptäckas. Börja med att designa patientspecifika primers med hjälp av pro-viral DNA-sekvensen interna till PanASP primers.Därefter kvantifiera RNA och eliminera DNA-kontaminering genom att behandla prover med DNase. Överför mellan 0,1 och ett mikrogram totalt RNA till lämpliga brunnar på en 96 brunns PCR-platta. Sedan ställa in den omvända transkription, eller RT reaktion, enligt manuskript riktningar.Förbered de endogena RT-kontrollerna genom att tillsätta fem mikroliter av nukleasfritt vatten istället för ASP-backprimer. Sätt plattan i termocyklaren och värm RNA till 94 grader Celsius i fem minuter. Sedan omedelbart kyla den i iskallt vatten i minst en minut.Förbered reaktionsblandningen i ett 1,5 milliliterrör enligt beskrivningen i textmanuskriptet och överför sedan 17,5 mikroliter till vart och ett av de RNA som innehåller brunnar. RNA denaturering måste utföras vid 94 grader Celsius. Utan total denaturering kan syntet av icke-specifika produkter från sense RNA förekomma, vilket leder till förstärkning av icke-specifika cDNAs.Blanda innehållet i brunnarna försiktigt och inkubera plattan i 55 grader Celsius i 60 minuter. Sedan inaktivera reaktionerna genom att värma plattan till 70 grader Celsius i 15 minuter. Förbered en liter 2X tvätt och bindningsbuffert enligt manuskriptriktningar och filtrera lösningen.Därefter förbereder du 50 milliliter 1X tvätt- och bindningsbuffert med hjälp av PCR-gradvatten. Överför lämpligt antal streptavidin-konjugerade magnetiska pärlor till ett 1,5 milliliterrör tvätta dem sedan genom att lägga till en lika stor volym av 2X tvätt och bindningsbuffert och vortexa röret i 15 sekunder. Placera röret i en magnetisk separation rack och inkubera den i tre minuter i rumstemperatur.Ta sedan försiktigt bort supernatanten utan att störa pärlorna och tillsätt samma volym av 2X-tvätt- och bindningsbufferten som den ursprungliga volymen av pärlorna. Vortexa pärlorna i 30 sekunder och överför 10 mikroliter av suspensionen till ett lämpligt antal 1,5 milliliterrör. Placera rören i den magnetiska separationsstället och inkubera dem i tre minuter i rumstemperatur.Sedan, kasta supernatant och tillsätt 50 mikroliter av 2X tvätt och bindning buffert. Tillsätt 50 mikroliter av biotynylated cDNA till motsvarande rör med pärlorna och inkubera dem i 30 minuter medan försiktigt rotera. Efter inkubationen, placera rören på den magnetiska separationsstället i tre minuter sedan tvätta pärlorna med 200 mikroliter av 1X tvätt och bindningsbuffert, följt av en tre minuters inkubation på separationsracket.Kassera supernatanten och upprepa tvätten två gånger. Sedan, resuspend pärlorna i 10 mikroliter av PCR-kvalitet vatten. Förbered en lämplig volym av PCR Master Mix enligt manuskriptet riktningar.Blanda det väl och snabbt snurra ner den, sedan överföra 49 mikroliter per brunn till en 96 väl PCR-platta. Vortexa försiktigt rören med den renade cDNA i 15 sekunder och tillsätt en mikroliter av suspensionen till motsvarande brunnar. Kör PCR och separera produkterna på en 1%agarosgel.Skär banden från gelen och klona de förstärkta produkterna till en PCR 2.1 plasmid. sekvens sedan klonerna och analysera varje sekvens. De första RT reaktionerna utfördes med den regelbundna icke-biotynylated anti-sense primer och resulterade i framgångsrik förstärkning av ASP.Men ett band av samma molekylvikt och primer minus kontroller var också förstärks. För att kringgå detta problem, var den specifika anti-sense primer märkt med biotyn och den resulterande anti-sense cDNA renades före PCR. Detta gjorde det möjligt att förstärka ASP-sekvensen med kraftigt minskad kontaminering från den icke-specifika cDNA i primern minus kontroller.Ytterligare optimering av denna metod uppnåddes genom fullständig denaturering av RNA vid 94 grader Celsius före RT, följt av omedelbar kylning på isvatten, vilket resulterade i effektiv förstärkning av ASP-bandet och inga icke-specifika produkter. Kinetics av ASP RNA mättes och CD4 celler isolerade från tre HIV positiva ämnen med påvisbara viremia och en avsaknad av terapi efter stimulering med anti-CD3/CD28. Kvantifiering av ASP RNA var också möjligt hos patienter som genomgår ART, med icke-påvisbara viremia.I två av tre patienter, ASP RNA upptäcktes i låga nivåer vid tre till fem dagar efter stimulering. Två patienter analyserades för ASP och env RNAs, en obehandlad och en behandlas. För den obehandlade patienten kunde båda RNA upptäckas.För den behandlade patienten var ASP och env knappt detekterbara efter flera dagar av stimulering. När man försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att denaturering linjäriserar RNA så att sekundära strukturer kunna prime RT förstörs. Medan tvättning av pärlor spolar bort icke-biotynylated cDNAs.Efter rening av cDNAs med rätt polaritet kan qPCR utföras för att analysera genuttryck. Dessutom kan cDNAs också klonas och användas för sekvensanalys. Denna metod gör det möjligt att studera gener överlappande i motsatt riktning och kan vara användbara för att belysa reglering och patogenes av en bakterie och en virusrelaterade sjukdomar inklusive vissa typer av cancer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

Analys av terminering av transkription Använda BrUTP strängspecifik transkription Run-on (TRO) Approach

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Anpassa 3' slutar snabb förstärkning av CDNA för att mappa avskrifter i Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medierad omorganiseringen av kromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Avgörande 3'-Termini och sekvenser av begynnande enkelsträngat virala DNA-molekyler under HIV-1 omvänd Transkription i infekterade celler

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Ett test för att kvantifiera protein-RNA-bindning i bakterier

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifiering av spår av RNA: protein komplex via RNA immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Diskriminering och kartläggning av de primära och bearbetade Transkripterna i Mitokonskbaserade majs med hjälp av en cirkulär RT-PCR-baserad strategi

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...