Name: detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr
Uploaded: 2019-11-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Biz Patrizia Amelio, Alessandra Noto, Craig Fenwick ve Matthieu Perreau her zaman bizim çalışma ve AIDS İmmünopatogenez Laboratuvarı'nda tüm insanlar değerli teknik yardım için tartışmak için kullanılabilir olduğu için teşekkür ederiz. Biz de John ve Aaron Weddle VSB Associated Inc kim mükemmel sanat ile katkıda teşekkür etmek istiyorum. Son olarak, tüm hastalara çok özel teşekkürler, onsuz bu çalışma mümkün olmazdı. Bu çalışma herhangi bir finansman ajansı ndan özel bir hibe almadÄ±.

Bu çalışma, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Hiv-1HXB2 suşu ile periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMCs) enfeksiyonu
<ol><li>
1. Gün: PBMCS UYARITMA
	<ol>
<li>Sağlıklı bir donör buffy ceket PBMCs izole.</li>
		<li>Komple Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (R-10) içeren 1x106/ mL konsantr...

<ol>
	<li>Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+may+encode+a+novel+protein+on+the+genomic+DNA+plus+strand.">Human immunodeficiency virus may encode a novel protein on the genomic DNA plus strand.</a> Science. 239 (4846), 1420-1422 (1988).</li><li>Vanheebrossollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Natural+Antisense+Rna+Derived+from+the+Hiv-1+Env+Gene+Encodes+a+Protein+Which+Is+Recognized+by+Circulating+Antibodies+of+Hiv++Individuals.">A Natural Antisense Rna Derived from the Hiv-1 Env Gene Encodes a Protein Which Is Recognized by Circulating Antibodies of Hiv+ Individuals.</a> Virology. 206 (1), 196-202 (1995).</li><li>Briquet, S., Vaquero, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolocalization+studies+of+an+antisense+protein+in+HIV-1-infected+cells+and+viral+particles.">Immunolocalization studies of an antisense protein in HIV-1-infected cells and viral particles.</a> Virology. 292 (2), 177-184 (2002).</li><li>Clerc, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+expression+of+the+membrane+ASP+protein+derived+from+HIV-1+antisense+transcription+in+T+cells.">Polarized expression of the membrane ASP protein derived from HIV-1 antisense transcription in T cells.</a> Retrovirology. 8, 74 (2011).</li><li>Landry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization+and+regulation+of+antisense+transcripts+in+HIV-1.">Detection, characterization and regulation of antisense transcripts in HIV-1.</a> Retrovirology. 4, 71 (2007).</li><li>Kobayashi-Ishihara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-encoded+antisense+RNA+suppresses+viral+replication+for+a+prolonged+period.">HIV-1-encoded antisense RNA suppresses viral replication for a prolonged period.</a> Retrovirology. 9, 38 (2012).</li><li>Barbagallo, M. S., Birch, K. E., Deacon, N. J., Mosse, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+control+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+asp+expression+by+alternative+splicing+in+the+upstream+untranslated+region.">Potential control of human immunodeficiency virus type 1 asp expression by alternative splicing in the upstream untranslated region.</a> DNA Cell Biol. 31 (7), 1303-1313 (2012).</li><li>Laverdure, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Antisense+Transcription+Is+Preferentially+Activated+in+Primary+Monocyte-Derived+Cells.">HIV-1 Antisense Transcription Is Preferentially Activated in Primary Monocyte-Derived Cells.</a> Journal of Virology. 86 (24), 13785-13789 (2012).</li><li>Zapata, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Immunodeficiency+Virus+1+ASP+RNA+promotes+viral+latency+by+recruiting+the+Polycomb+Repressor+Complex+2+and+promoting+nucleosome+assembly.">The Human Immunodeficiency Virus 1 ASP RNA promotes viral latency by recruiting the Polycomb Repressor Complex 2 and promoting nucleosome assembly.</a> Virology. 506, 34-44 (2017).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10 (5), 0120043 (2015).</li><li>Lerat, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+hepatitis+C+virus+minus+strand+RNA+in+hematopoietic+cells.">Specific detection of hepatitis C virus minus strand RNA in hematopoietic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 97 (3), 845-851 (1996).</li><li>Tuiskunen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-priming+of+reverse+transcriptase+impairs+strand-specific+detection+of+dengue+virus+RNA.">Self-priming of reverse transcriptase impairs strand-specific detection of dengue virus RNA.</a> J Gen Virol. 91, 1019-1027 (2010).</li><li>Mancarella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+antisense+protein+(ASP)+RNA+transcripts+in+individuals+infected+with+human+immunodeficiency+virus+type+1+(HIV-1).">Detection of antisense protein (ASP) RNA transcripts in individuals infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).</a> Journal of General Virology. , (2019).</li><li>Peyrefitte, C. N., Pastorino, B., Bessaud, M., Tolou, H. J., Couissinier-Paris, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+in+vitro+falsely-primed+cDNAs+that+prevent+specific+detection+of+virus+negative+strand+RNAs+in+dengue-infected+cells:+improvement+by+tagged+RT-PCR.">Evidence for in vitro falsely-primed cDNAs that prevent specific detection of virus negative strand RNAs in dengue-infected cells: improvement by tagged RT-PCR.</a> J Virol Methods. 113 (1), 19-28 (2003).</li><li>Boncristiani, H. F., Di Prisco, G., Pettis, J. S., Hamilton, M., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+to+the+analysis+of+deformed+wing+virus+replication+and+pathogenesis+in+the+honey+bee,+Apis+mellifera.">Molecular approaches to the analysis of deformed wing virus replication and pathogenesis in the honey bee, Apis mellifera.</a> Virol J. 6, 221 (2009).</li><li>Boncristiani, H. F., Rossi, R. D., Criado, M. F., Furtado, F. M., Arruda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+purification+of+biotinylated+cDNA+removes+false+priming+and+ensures+strand-specificity+of+RT-PCR+for+enteroviral+RNAs.">Magnetic purification of biotinylated cDNA removes false priming and ensures strand-specificity of RT-PCR for enteroviral RNAs.</a> J Virol Methods. 161 (1), 147-153 (2009).</li><li>Craggs, J. K., Ball, J. K., Thomson, B. J., Irving, W. L., Grabowska, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+strand-specific+RT-PCR+based+assay+to+detect+the+replicative+form+of+hepatitis+C+virus+RNA.">Development of a strand-specific RT-PCR based assay to detect the replicative form of hepatitis C virus RNA.</a> J Virol Methods. 94 (1-2), 111-120 (2001).</li><li>Barbeau, B., Mesnard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+out+of+antisense+transcription+in+human+T-cell+lymphotropic+viruses+(HTLVs).">Making sense out of antisense transcription in human T-cell lymphotropic viruses (HTLVs).</a> Viruses. 3 (5), 456-468 (2011).</li></ol>

Bu raporda, HIV-1 ile enfekte olan bireylerden izole cd4+ T hücrelerinde ASP RNA tespitine uygulanan iplikçik spesifik RT tayini açıklanmıştır. RT sırasında spesifik olmayan astar oluşumu, RNA transkriptlerinin doğru polarite ile saptanmasını engelleyerek sonuçların yanlış yorumlanmasına yol açtı. Önceki gruplar RT reaksiyonu sırasında astar-bağımsız cDNA sentezini önlemeye yönelik çeşitli stratejiler geliştirmişlerdir. HIV ile ilgili olmayan dizileri ile 3 'sonunda ters astar etiketleme i...

Antisense protein (ASP) geni, insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) zarf (env) geninin negatif iplikçik üzerinde bulunan açık okuma çerçevesi (ORF) olup, gp120/gp411kavşağına yayılan bir gendir. Son 30 yıl içinde, çeşitli raporlar HIV ASP geni gerçekten transkripsiyonu ve tercüme olduğunu göstermiştir2,3,4,5,6,7,8,9. ASP antisense transkriptler tamamen in vitrokarakterize olmasına rağmen , yakın zamana kadar hastalarda ASP RNA gerçek üretimi hakkında bilgi hala eksikti.
ASP dizisi ters ve env tamamlayıcıdır. Bu, ASP transkriptlerini algılamaya çalışırken büyük bir engel teşkil eder. Standart ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemleri, doğru polaritenin tamamlayıcı NA'larını (cDNA'ları) sentezlemek için genlere özgü antisense astarlar kullanır. Ancak bu yaklaşım, rna saç tokaları veya döngüleri10astar yokluğunda her iki yönde de RT asal olabilir, rt kendini astar olarak bilinen bir fenomen, ilk RNA şablonunun yönünü (anlamda veya antisense) belirlemek için izin vermez. Çoğu ASP araştırmacıları HIV-111,12ile ilgili olmayan dizileri ile etiketlenmiş astarlar kullanarak RT kendini astar sorunu kenara . Ancak bu strateji, fenomenin oluşumunu ortadan kaldırmaz ve PCR11'espesifik olmayan CDNA'ların potansiyel olarak taşınmasına yol açabilir.
Yakın zamanda antisense RNA çalışması için yeni bir iplikçik özgü RT-PCR tayini geliştirdik ve Tablo 1'degösterildiği gibi, altı HIV enfekte hastanın bir kohort ASP RNA tespiti için kullandık. Aşağıda açıklanan prosedür daha önce Antonio Mancarella ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Protokolümüzde, spesifik olmayan CNA'ların çift yaklaşımla üretiminden kaçınıyoruz. İlk olarak, RNA'yı yüksek sıcaklıkta (94 °C) reddederek RNA ikincil yapılarını ortadan kaldırıyoruz ve ikinci olarak, biyotinylated ASP'ye özgü astar kullanarak ASP RNA'yı tersine çeviriyoruz ve elde edilen cDNA'yı arındırıyoruz. Bu yaklaşımla, spesifik olmayan diğer RT ürünlerinin üretilmesi (RNA'nın yüksek sıcaklık denatürasyonu) engellenmesi veya PCR (afinite arınma) öncesinde ortadan kaldırılması önlendiği için, sadece hedef cDNA'mızı yükseltebiliriz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR II</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4337450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Set (100 mM)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10297018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11205D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1010-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV Gag p24 flow cytometry antibody - Kc57-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6604665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-743</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61764-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>55329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers and Probes</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>BioConcept</td>
			<td>4-01F00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11304011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene Infection / Transfection Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4369016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPO TA Cloning Kit for Subcloning, with One Shot TOP10 chemically competent E. coli cells</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNase (2 U/&#181;L)</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375786</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human immunodeficiency virus type 1 (hiv-1) antisense protein (asp) rna transcripts in patients by strand-specific rt-pcr

Retrovirüslerde antisense transkripsiyon hem insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) hem de insan T-lenfotropik virüs 1 (HTLV-1) olarak tanımlanmıştır. HIV-1'de antisense protein ASP geni env'nin negatif iplikçiküzerinde, -2 okuma çerçevesinde gp120/gp41 kavşaklarını kapsayan bir proteinde bulunur. Asp açık okuma çerçevesinin 3' ucu gp120 hiperdeğişken bölgeler V4 ve V5 ile örtüşmektedir. ASP RNA çalışması RT-self-priming olarak bilinen bir fenomen tarafından engellenmiştir, rna ikincil yapılar belirli astar yokluğunda RT asal yeteneğine sahip, spesifik olmayan CD'ler üreten. RT reaksiyonunda biyotinylated ters astarlar ile yüksek RNA denatürasyonu kombine kullanımı, streptavidin kaplı manyetik boncuküzerine cDNA afinite ile birlikte, bize seçici OLARAK CD4 ASP RNA yükseltmek için izin verdi + T hücreleri HIV-1 ile enfekte bireylerden türetilen. Yöntemimiz nispeten düşük maliyetli, gerçekleştirmek için basit, son derece güvenilir ve kolayca tekrarlanabilir. Bu bağlamda, sadece HIV-1'de değil, diğer biyolojik sistemlerde de antisense transkripsiyon çalışması için güçlü bir araçtır.

Biyotinylated cDNA afinite ile birleştiğinde yüksek sıcaklık RNA denatürasyonu, pcr sırasında non-spesifik ASP ürünlerinin in vitro enfekte PCR ve hastalardan izole CD4 + T hücrelerinde amplifikasyon önler. RT kendini priming antisense RNA10ters transkripsiyon sırasında meydana gösterilmiştir10 ,14,15,16,17. Bu fenomeni önlemek için,...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR at JoVE.com

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIV-1 Antisense Protein ASP RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

RNA saç tokaları ve döngüler, sekansa özgü astarların yokluğunda ters transkripsiyon (RT) için astar işlevi görebilir ve üst üste gelen antisense transkriptlerin incelenmesine müdahale eder. İplik spesifik RNA'yı tanımlayabilen bir teknik geliştirdik ve bunu HIV-1 antisense protein ASP'yi incelemek için kullandık.

İplik Spesifik RT-PCR ile Hastalarda İnsan İmmün Yetmezlik Virüs Tip 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transkriptlerinin Saptanması

In retroviruses, antisense transcription has been described in both human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T-lymphotropic virus 1 (HTLV-1). ...

Konvansiyonel RT-PCR'ler, çakışan genler tarafından kodlanmış RNA'ları tespit etmek için kullanıldığında duyu ve anti-duyu dizileri arasında ayrımcılığa izin vermez. Bu protokol, özellikle anti-sense RNA'ları algılamayı mümkün kılar. Yüksek RNA denatürasyon sıcaklıkları ile birlikte biyotimlansae astar kullanımı anti-duyu cDNA amplifikasyon sağlar, non-spesifik RT ürünlerinin oluşumunu engelleyen.Bu yöntemi, ASP'nin ya Bir RNA anti-duyusu ya da protein öncüsü olarak, yeni bir HIV antijeni olduğunu, tedavi için potansiyel olarak yeni bir HIV hedefi olduğunu göstermek için kullandık. Bu yöntem, çakışan genlerden anti-duyu RNA'ları tespit edilebilen herhangi bir sisteme uygulanabilir. PanASP astarları dahili pro-viral DNA dizisi kullanarak hastaya özel astarlar tasarlayarak başlayın.Daha sonra, RNA'yı ölçün ve dna kontaminasyonunu DNase ile tedavi ederek ortadan kaldırın. 0.1 ile bir mikrogram toplam RNA'yı 96 iyi pcr plakalı uygun kuyulara aktarın. Sonra el yazması yönlere göre ters transkripsiyon veya RT reaksiyonu ayarlayın.ASP ters astar yerine beş mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek endojen RT kontrollerini hazırlayın. Plakayı termocycler'a yerleştirin ve RNA'yı 5 dakika boyunca 94 dereceye ısıtın. Sonra hemen en az bir dakika buzlu suda soğutun.Metin el yazmasında açıklandığı gibi 1,5 mililitrelik bir tüpte reaksiyon karışımını hazırlayın, ardından 17,5 mikrolitreyi kuyu içeren RNA'nın her birine aktarın. RNA denatürasyonu 94 santigrat derecede yapılmalıdır. Toplam denatürasyon olmadan, duyu RNA non-spesifik ürünlerin sentezleri oluşabilir, non-spesifik cDA amplifikasyon yol.Kuyuların içeriğini hafifçe karıştırın ve plakayı 55 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 15 dakika boyunca 70 santigrat dereceye plaka ısıtarak reaksiyonları inaktive. Bir litre 2X yıkama ve ciltleme tamponu el yazması talimatlara göre hazırlayın ve çözümü filtreleyin.Ardından, PCR sınıfı su kullanarak 50 mililitre 1X yıkama ve bağlama tamponu hazırlayın. Streptavidin konjuge manyetik boncukların uygun sayıda 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra 2X yıkama ve bağlama tampon eşit hacim ekleyerek onları yıkayın ve 15 saniye boyunca tüp girdap. Tüpü manyetik ayırma rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, dikkatle boncuk rahatsız etmeden supernatant çıkarın ve boncuk ların ilk hacmi olarak 2X yıkama ve bağlayıcı tampon aynı hacmi ekleyin. 30 saniye boyunca boncukvor ve 10 mikrolitre süspansiyon 1.5 mililitre tüpler uygun sayıda aktarın. Tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin ve oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yatırın.Sonra, supernatant atın ve 2X yıkama ve bağlama tampon 50 mikrolitre ekleyin. Boncuklar ile ilgili tüplere biyotim 50 mikrolitre ekleyin ve yavaşça dönerken 30 dakika kuluçka. Kuluçkadan sonra tüpleri manyetik ayırma rafına üç dakika yerleştirin ve boncukları 200 mikrolitre 1X yıkama ve bağlama tamponuyla yıkayın ve ardından ayırma rafında üç dakikalık bir kuluçka alanı edin.Supernatant atın ve iki kez yıkama tekrarlayın. Daha sonra, PCR sınıf su 10 mikrolitre boncuk resuspend. El yazması talimatlara göre uygun bir PCR Master Mix hacmi hazırlayın.İyice karıştırın ve hızlı bir şekilde aşağı spin, sonra iyi başına 49 mikrolitre aktarın 96 iyi PCR plaka. 15 saniye boyunca saflaştırılmış cDNA ile tüpleri dikkatlice girdap ve ilgili kuyulara süspansiyon bir mikrolitre ekleyin. PCR çalıştırın ve% 1 agarose jel ürünleri ayırın.Jel bantları kesin ve bir PCR 2.1 plazmid içine amplifiye ürünleri klonlamak. Sonra klonları sıralayın ve her diziyi analiz edin. İlk RT reaksiyonları düzenli non-biotynylated anti-sense primer ile yapıldı ve ASP başarılı amplifikasyon ile sonuçlandı.Ancak, aynı molekül ağırlığı ve astar eksi kontrolleri bir bant da güçlendirilmiştir. Bu sorunu atlamak için, spesifik anti-sense astar biotyn ile etiketlendi ve ortaya çıkan anti-sense cDNA PCR önce saflaştırılmış. Bu, ASP dizisini astar eksi kontrollerde spesifik olmayan cDNA'dan büyük ölçüde azaltılmış kontaminasyonla güçlendirmeyi mümkün kıldı.Bu yöntemin daha fazla optimizasyonu RT'den önce RNA'nın 94 santigrat derecede tam olarak denatürasyonu ile sağlandı ve ardından buzlu suda hemen soğutuldu ve asp bandının etkili bir şekilde amplifikasyonu sağlandı ve spesifik olmayan ürünler yok. ASP RNA'nın kinetikleri ölçüldü ve CD4 hücreleri saptanabilir viremi olan üç HIV pozitif denekten izole edildi ve anti-CD3/CD28 ile uyarılma sonrasında tedavi yokluğu yapıldı. ART uygulanan hastalarda, saptanamayan viremi olan hastalarda ASP RNA'nın sayısallaştırılması da mümkündür.Her üç hastadan ikisinde asp RNA stimülasyonu ndan sonra 3-5 gün düşük seviyelerde saptandı. Asp ve env RNA'lar için iki hasta incelendi, biri tedavi edilmedi, biri tedavi edildi. Tedavi edilmeyen hasta için her iki RNA da tespit edilebilir.Tedavi edilen hasta için, ASP ve env ancak stimülasyon birkaç gün sonra tespit edildi. Bu yordamı denerken, denatürasyonun RNA'yı doğrusallaştırdığını ve böylece RT'ye ulabilen ikincil yapıların yok edildiğini unutmamak gerekir. Oysa, boncuk yıkama olmayan biyotynylated cDNA'lar sifon.CDNA'ların doğru polarite ile arındırılmasından sonra gen ekspresyonunu analiz etmek için qPCR yapılabilir. Ayrıca, CDNA'lar klonlanabilir ve dizi analizi için kullanılabilir. Bu yöntem, zıt yönde örtüşen genlerin incelenmesine olanak sağlar ve bir bakterinin ve bazı kanser türleri de dahil olmak üzere virüse bağlı hastalıkların düzenlenmesi ve patogenezi nin aydınlatılmasında yararlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Antisense Protein (ASP) RNA Transcripts in Patients by Strand-Specific RT-PCR

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on TRO Approach

BrUTP iplikli özgü Transkripsiyon Run-on (TRO) Yaklaşımı ile Transkripsiyon Feshi Analizi

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

3' adapte CDNA hızlı amplifikasyon transkript kanser eşlemek için sona erer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplifikasyon tam uzunlukta HIV-1 Proviruses yakınındaki yeni nesil sıralama için

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Ters transkripsiyon enfekte hücreleri içinde belirleyici 3'-Termini ve HIV-1 sırasında doğmakta olan tek iplikçikli Viral DNA moleküllerinin dizileri

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

RNA 'nın ayak Izleri tanımlaması: proteinli kompleksleri RNA Immunoprecipitation ile tandem sonra sıralamayı (RIPiT-seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

Discrimintion and Mapping of the Primary and Processed Transcripts in Maize Mitochondrion Using a Circular RT-PCR-based Strategy

Dairesel bir RT-PCR tabanlı strateji kullanarak Maize mitochondrion 'da primer ve Işlenmiş transkriptlerin ayrımcılık ve haritalama

In plant mitochondria, some steady-state transcripts have 5&#39; triphosphate derived from transcription initiation (primary transcripts), while the ...