Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

تم تمويل هذا العمل من قبل P20GM10344 و R01AI139248 الممنوحة لZ. D. Dalebroux.

1. الكواشف العامة وإعداد وسائل الإعلام لاستخراج الغشاء
<ol><li>وسائل الإعلام النمو البكتيرية: إعداد وتعقيم 1 لتر من وسائل الإعلام مرق في تنظيفها تماما وأوتوكلاف 2 L قارورة.</li>
	<li>العازلة العامة لإعادة التعليق (1 M تريس المؤقت درجة الحموضة 7.5; 50 مل): حل 6.05 غرام من قاعدة تريس في 30 مل من H2O. ضبط د?...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

هذه الطريقة سوف تستمر في مساعدة الباحثين في فهم دور مغلف الخلية في علم وظائف الأعضاء البكتيرية ومسببات الأمراض. بعد خطوات ultrarifugation متتابعة يمكن الحصول على مجموع منقى، الداخلية، وOM كسر. يمكن أن تكون هذه الأغشية في عزلة لاختبار الفرضيات المتعلقة بتوطين بروتين الأغشية ووظيفتها ، والنقل والا...

البكتيريا سالبة الغرام تنتج اثنين من الأغشية التي يتم فصلها عن طريق الفضاء periplasmic وجدار الخلية peptidoglycan1. الغشاء الداخلي (IM) يغلف السيتوسول وهو ثنائي طبقة متماثلة من الفوسفوليبيدات. Peptidoglycan يحمي ضد ضغط تورغور ويوفر البكتيريا مع شكل الخلية، وتعلق على الغشاء الخارجي (OM) عن طريق البروتينات الدهنية2،3. وOM تحيط periplasm وغير المتماثلة في الغالب. تتكون النشرة الداخلية من الفوسفوليبيدات وتتكون النشرة الخارجية من غليكوليبيدات تعرف باسم ليبوليغوساكيريديس (LOS) أو ليبوبوليكيساسيدس (LPS)4،5. عدم التماثل في الدهون والكيمياء الحيوية لجزيئات لوس / LPS في المنشور الخارجي يضفي خصائص الحاجز على سطح الخلية التي تحمي البكتيريا من المخاطر في بيئتها6,7.
تتكون جزيئات LPS من ثلاثة مكونات: الدهون A disaccharolipid ، وoligosaccharide الأساسية ، وO-polysaccharide أو O-مستضد. الدهون A هو disaccharolipid متضاعف. تتكون core-oligosaccharides من 10-15 السكريات المعروفة باسم LPS الخام أو R-LPS. وينقسم اللب إلى المنطقة الداخلية، ويتألف من 2-كيتو-3-ديوكسي-د-مانو-حمض الثمانية وثماني سونيك (kdo) واحد أو أكثر من بقايا heptose، والمنطقة الخارجية التي تتكون عموما من الهكسوس (الجلوكوز أو الجالاكتوز) وهيبتوس، أو السكريات الأسيتاميد5. المنطقة الأساسية الخارجية هي أكثر متغيرة في مكوناتها وبنيتها من النواة الداخلية. في السالمونيلا spp., وقد وصفت هيكل واحد فقط الأساسية; ومع ذلك، في الإشريكية القولونية هناك خمسة هياكل أساسية مختلفة (المعينة K-12، R1، R2، R3، و R4)8. E. القولونية K-12 DH5α، التي نستخدمها في هذا الإجراء يحمل طفرة أن يؤدي إلى إنتاج R-LPS9. جزيئات R-LPS تفتقر إلى moiety O-مستضد ولها وزن جزيئي مماثل لجزيئات لوس.
إضافة O-مستضد إلى R-LPS يحول هذا الجزيء إلى LPS على نحو سلس، أو S-LPS. تم بناء المستضدات O من الوحدات الفرعية الكربوهيدرات 3-4 قصيرة وتتكون من طرائق متعددة مع أطوال سلسلة متفاوتة10. بعض البكتيريا المنتجة LPS، مثل السالمونيلا enterica سيروفار تيفيموريوم(S. Typhimurium), عرض توزيع ثلاثي الوسائط من جزيئات LPS على سطحها10,11. سلسلة طويلة جدا O-المستضدات يمكن أن تحتوي على أكثر من مائة وحدة فرعية وتزن أكثر من مائة كيلودالتون. توفر المستضدات O خصائص سطحية للبكتيريا الضرورية لمقاومة المضادات الحيوية ، والتهرب من الافتراس عن طريق البكتيريا ، وتسبب المرض.
أنواع كامبيلوباكتر، بوردتيلا، Acinetobacter، Haemophilus، النسيرية وغيرها تولد جزيئات لوس بدلا من جزيئات LPS على سطحها12. تتكون جزيئات LOS من الدهون A وoligosaccharides الأساسية ولكنها تفتقر إلى المستضد O. هذه الأنواع من البكتيريا السلبية غرام تعديل oligosaccharides الأساسية مع السكريات إضافية وتركيبات من السكريات لتغيير خصائص السطح12. كل من الميكروبات التي تنتجها لوس وLPS اشتقاق الفوسفات على الدهون A والجزيئات الأساسية مع moieties cationic7. وتشمل هذه الإضافات فوسفوإيثانولامين، والجالاكتوزامين وبدائل الأنف الأميني، والتي تعمل عن طريق تحييد الشحنة السطحية الأنيونية وبالتالي الحماية من الببتيدات المضادة للميكروبات الكاتيونية. البكتيريا سالبة الجرام أيضا تعديل بنية أوليغوساكاريد الأساسية مع بدائل متغيرة غير stoichiometric من السكريات، أو جزيئات إضافية الكدو، وتغيير عدد سلاسل أسيل على الدهون-A disaccharolipids7.
القدرة على عزل الدردشة من OM من البكتيريا السلبية غرام كان مفيدا لفهم دور مغلف الخلية في مقاومة مضادات الميكروبات ومرض المرض11,12. وقد استخدمت اشتقاقات هذا النهج لاستخلاص آليات التجميع والصيانة وإعادة عرض مكونات البروتين والفوسفوليبيد والغليكبيدين لـ OM.
يقوم مختبرنا بشكل روتيني بإجراء تحليلات الدهون البكتيرية لدراسة تنظيم الدهون بوساطة البروتين ووظيفة الدهون في مجموعة متنوعة من الأنواع السلبية للجرام. تعكس الأحجام المستخدمة في البروتوكول الاستخدام الروتيني لهذا الإجراء لتحليل الفوسفوليبيدات غير الملصقة بالراديو بواسطة كروماتوغرافيا طبقة رقيقة وكروماتوغرافيا سائلة جنباإلى جنب الطيف الكتلي13،14.
يبدأ البروتوكول بتعريض تعليق مبرد للبكتيريا سالبة الجرام إلى محلول سكروز عالي السكروز وإضافة الليسوزيمي لفصل OM عن طبقة peptidoglycan الأساسية(الشكل 1)12. ثم يتم إضافة EDTA لتسهيل اختراق الليسوزيم ، لأن عزل التقاض المقسوم يعطل تفاعلات التجسير الكهروستاتيكي ة الجانبية بين جزيئات LOS / LPS المجاورة15. البروتوكول الأصلي الذي تم تكييفلنا يتطلب تشكيل spheroplasts، شكل الخلية البكتيرية السلبية غرام التي تتكون من غشاء البلازما والسيتوسول، ولكن يفتقر إلى طبقة peptidoglycan وOM. فمن الممكن أن يتم إنتاج spheroplasts عن طريق طريقة تكييفها; ومع ذلك ، فإن هذه التقنية لا تعتمد أو تنوي تشكيلها للنجاح. بدلا من ذلك ، يتم حصاد البكتيريا المعالجة lysozyme-EDTA بسرعة عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في محلول السكروز من تركيز أقل قبل الانحلال المضغوط. وينبغي نظرياً أن تكون الآليات اللوائية التي قد تكون قد أُفرج عنها عن طريق تشكيل السُبل الكروية قابلة للحصاد من الخلايا الخارقة، ولكن هذا النهج غير مفصل هنا. في نهاية المطاف ، تخضع الخلايا المعالجة للتجانس التقليدي وتحلال الدم ، مما يعزز كفاءة وتكرار إجراء فصل الغشاء16.
بعد الانزل ، يتم جمع الأغشية الإجمالية عن طريق ultracentrifugation وتطبيقها على تدرج كثافة السكروز متقطع ة لكسور IMs و OMs. النهج الكلاسيكي يستخدم التدرج أكثر مستمرة التي تتكون من ما لا يقل عن خمسة حلول السكروز مختلفة11،12. التدرج المتقطع في بروتوكولنا يتكون من ثلاثة حلول السكروز ويقسم الطبقات الثنائية إلى كسرين متميزين17. جزيئات لوس وLPS داخل OMs من البكتيريا سالبة الغرام محرك المغلف لتقسيم إلى أعلى البني منخفضة الكثافة IM جزء وأسفل أبيض عالي الكثافة OM كسر(الشكل 1 والشكل 2).
Acinetobacter baumannii هي أهم مسببات الأمراض البشرية المقاومة للأدوية التي تنتج جزيئات LOS في OM الخاصة بهم وإقامة مغلف الخلية التي يصعب فصل18،19. يشير العمل الأخير إلى أن اشتقاق البروتوكول الذي نقدمه هنا يمكن استخدامه لتقسيم الطبقات الثنائية لهذه الكائنات20. لذلك، اختبرنا بروتوكولنا على A. baumannii 17978. في البداية، كان الإجراء غير كاف. ومع ذلك، قمنا بتعديل تركيز السكروز من محلول الكثافة الوسطى وتحسنت كثيرا فصل(الشكل 2). تم استخدام فحص NADH dehydrogenase وإجراءات استخراج كشف LOS/LPS لتأكيد الانفصال عن A. baumannii، من النوع البري S. التيفيموريوم واثنين من O-مستضد نقص الأنماط الجينية البكتيرية; وهي، galE-متحولة S. التيفيموريوم وسلالة مختبرية، E. coli DH5α(الشكل 3 والشكل 4).
الغرض من هذا العمل هو توفير نهج مبسط لعزل أغشية البكتيريا السلبية الجرامية بشكل مستنسخ. يمكن استخدام البروتوكول لدراسة العديد من أنواع الجزيئات المرتبطة بالأغشية لهذه الميكروبات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

تعمل هذه الطريقة عن طريق تقسيم مغلف البكتيريا السالبة للجرام إلى كسور غشاء إجمالي وداخلي وخارجي (OM) وتختتم بمقالات لتقييم نقاء الطبقات الثنائية. وOM لديها زيادة الكثافة الإجمالية بالمقارنة مع الغشاء الداخلي، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى وجود lipooligosaccharides (لوس) وlipopolysaccharides (LPS) داخل النشرة الخارجية. جزيئات لوس وLPS هي الدهون الغليكوليبيدات الأمبيباثية التي لها بنية مماثلة ، والتي تتكون من الدهون - A disaccharolipid والأساسية oligosaccharide substituent. ومع ذلك، يتم تزيين جزيئات LPS فقط مع وحدة فرعية ثالثة تعرف باسم O-polysaccharide، أو O-مستضد. سيؤثر نوع وكمية الدهون الغليكوبيدية الموجودة على كثافة OM للكائن الحي. لذلك ، اختبرنا ما إذا كانت أغشية البكتيريا ذات محتوى الغليكوبيد المتنوع يمكن عزلها بالمثل باستخدام تقنيتنا. بالنسبة للكائنات الحية المنتجة لـ LPS ، السالمونيلا enterica serovar Typhimurium وEscherichia coli، تم عزل الأغشية بسهولة ولم يؤثر MOS O-antigen على التقسيم الثنائي الطبقات. Acinetobacter baumannii تنتج جزيئات لوس, التي لديها كتلة مماثلة لجزيئات إل بي س المستضد ناقص O; ومع ذلك ، لا يمكن فصل أغشية هذه الميكروبات في البداية. لقد قمنا بمعلل أن OM of A. baumannii كانت أقل كثافة من تلك التي من Enterobacteriaceae ، لذلك تم تعديل تدرج السكروز وعزل الأغشية. وبالتالي يمكن تكييف هذه التقنية وتعديلها لاستخدامها مع الكائنات الحية الأخرى.

توفر هذه التقنية وسيلة فعالة لعزل IMs و OMs للبكتيريا سالبة الجرام. ويوضح الخطوط العريضة للإجراء بأكمله(الشكل 1). بشكل عام، تطبيع الثقافات إلى OD600 من 0.6-0.8 في 1 لتر من وسائل الإعلام، أو الحصاد بين 6.0 و 8.0 × 1011 الخلايا البكتيرية سوف تضمن أن يتم جمع كمية مناسبة من المواد ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

تنتج البكتيريا السالبة للجرام غشاءين منفصلين مكانًا. يتم تقسيم الغشاء الخارجي من الغشاء الداخلي بواسطة periplasm وطبقة peptidoglycan. كانت القدرة على عزل الطبقات الثنائية من هذه الميكروبات حاسمة لفهم فسيولوجيا ها ومسببات الأمراض.

فصل مغلف الخلية للبكتيريا سالبة الجرام إلى كسور الغشاء الداخلي والخارجي مع التعديلات التقنية لـ Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

دراسة كيفية تنظيم الميكروبات التركيب الكيميائي للbilayers الفردية سوف أبلغ معرفتنا بآليات القتل بالمضادات الحيوية، ومقاومة مضادات الميكروبات ومرض pathogenesis. هذه التقنية تقسم غلاف الخلية من البكتيريا السالبة الغرام إلى كسرين محددين دون استخدام المنظفات. لذلك، يمكن تقييم الدهون والبروتينات والسكريات في بيئة شبه أصلية.بعض الخطوات تعتمد على الوقت وتتطلب التركيز والتنسيق. في البداية، استخدم عينة أو اثنتين. عندما يزيد مستوى الراحة للمرء، يمكن إضافة المزيد من العينات.ولا ينبغي معالجة أكثر من ست عينات في وقت واحد. هذا هو إجراء لعدة أيام ونقاط التفتيش البصرية مفيدة لتقييم فعالية والخطأ. قبل تنفيذ هذه الخطوات النهائية في بعض الأحيان.خط البكتيريا من الأسهم المجمدة الجلسرين على لوحات أجار الطازجة. بمجرد تطوير المستعمرات، وتخزين لوحات في أربع درجات مئوية. استخدام مستعمرة واحدة لتلقح أنبوب خمسة ملليلتر مليئة وسائل الإعلام مرق والثقافة البكتيريا كما هو مطلوب بين عشية وضحاها.مرة أخرى تمييع الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في لتر واحد من وسائل الإعلام مرق المفضل واحتضان القارورة. عندما يتم تحقيق الكثافة البصرية المطلوبة، وإزالة القارورة من الحاضنة ووضعها على الجليد. قياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر وحساب حجم الثقافة التي تعادل ما بين ستة وثماني مرات 10 إلى الحادي عشر مستعمرة البكتيريا تشكيل وحدات.أضف هذا الحجم من الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي وتأكد من أن الثقافات المتبقية تبقى على الجليد حتى يتم استخدامها. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ina زاوية ثابتة، والطرد المركزي عالية السرعة في 7، 000 إلى 10، 000 مرات G وأربع درجات مئوية. بعناية طهر المابير وتجاهله.Resuspend كل بيليه الخلية في 12.5 ملليلتر من العازلة A.إضافة شريط ضجة المغناطيسي إلى تعليق الخلية. إضافة 180 ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل ملليلتر lysozyme إلى كل resuspension الخلية. بعد جمع البكتيريا المعالجة lysozyme EDTA عن طريق الطرد المركزي ، قم بسرعة بإضافة مثبطات البروتياز وكلوريد المغنيسيوم والنيوكلاز إلى البكتيريا وتجميل الخلايا بسرعة في Buffer B.Stir لمدة دقيقتين ، مع الحفاظ على التعليقات على الجليد.بعد ذلك، أضف 12.5 ملليلتر من محلول EDTA 1.5 ملليمولار لكل خلية إعادة تعليق والاستمرار في التحريك على الجليد لمدة سبع دقائق إضافية. decant التعليقات في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. الطرد المركزي تعليق في 9، 000 إلى 11، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.تخلص من المواد الخارقة في حاوية نفايات الخطر الحيوي واحتفظ بالكريات على الجليد. إضافة 25 ملليلتر من المخزن المؤقت B إلى كل بيليه الخلية. ثم، إضافة 55 ميكرولتررس من كلوريد المغنيسيوم الضرس واحد، ميكرولتر واحد من rnase / dnase / nuclease الكاشف وميكر واحد من كوكتيل مثبطات البروتياز.resuspend الكريات في الخليط. بقوة ماصة ودوامة حتى الحلول تبدو متجانسة. تخزين التعليقات على الجليد.صب العينة في الاسطوانة عينة المهيجين وتقديم الخلية إلى 20،000 PSI. لتجنب الهباء الجوي من مسببات الأمراض، شرط الجهاز المضغوط في المخزن المؤقت B وضبط مستويات الضغط قبل إضافة تعليق البكتيرية. إشراك خلية الضغط والتلميح 10 ملليلتر من العازلة B كإجراء وقائي.جمع الخلية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر على الجليد مع الحفاظ أيضا على عينات الجليد. لتحقيق التحلل الكامل ، كرر هذه العملية ثلاث إلى خمس مرات. ل بيليه المتبقية، سليمة، والمواد الخلوية، الطرد المركزي العينات البكتيرية lysed في 6، 169 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.توزيع المواد العملاقة التي تحتوي الآن على الأغشية المتجانسة، في زجاجات البولي للطرد فائقة المركز. فائقة التركيز lysates الخلية في 184، 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. تجاهل supernatants والاحتفاظ الكريات الغشاء على الجليد.باستخدام الزجاج، Dounce التجانس، resuspend الكريات الغشاء في ملليلتر واحد من محلول التدرج sucrose isopycnic منخفضة الكثافة. ثم، استخدام الزجاج، ماصة باستور لنقل التجانس العينة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ووضع الأنبوب على الجليد. لتحضير تدرج السكروز، أمسك أنبوبًا مفتوحًا مكشوفًا جدًا أو أنبوبًا مفتوحًا جدًا في وضع مائل قليلاً.إضافة ببطء مليلتر من محلول السكروز أعلى كثافة. ثم إضافة أربعة ملليلترات من محلول السكروز أقل كثافة. عند إعداد تدرج الكثافة، أضف محلول السكروز ببطء لتجنب خلط الطبقات.وينبغي أن تكون طبقات السكروز مرئية قليلا وتظهر محددة بشكل عام. بعد ذلك ، أضف الكسر الكلي للغشاء الذي تم إعادة الاعتماد عليه سابقًا في ملليلتر واحد من الكثافة المنخفضة ، محلول السكروز ال isopycnic. وأخيرا، ملء ما تبقى من الأنبوب بإضافة ما يقرب من ستة ملليلتر من الكثافة المنخفضة، محلول التدرج sucrose isopycnic.فائقة التركيز طرد العينات باستخدام الدوار دلو يتأرجح في 288، 000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 23 ساعة. قطع نهاية قبالة تلميح P1000 ماصة حوالي خمسة ملليلتر من هذه النقطة. بعد اكتمال الطرد المركزي، استخدم الماصة لإزالة الطبقة العلوية البنية من الأنبوب.نقل هذه الطبقة، التي تحتوي على جزء الغشاء الداخلي، إلى زجاجة البولي للطرد فائقة التركيز. ترك حوالي مليلتر من محلول السكروز فوق الواجهة بين السكروز 53٪و 73٪ سكروز لضمان أن الجزء السفلي من الغشاء الأبيض الخارجي لا يعبر تلويث جزء الغشاء الداخلي. مرة أخرى باستخدام طرف P1000 ماصة مع نهاية إزالتها، وإزالة طبقة الغشاء الخارجي ونقله إلى زجاجة البولي.ملء الفراغ المتبقي من زجاجة البولي مع العازلة تخزين غشاء معزولة ومزيج عن طريق عكس أو pippetting. احتفظ بالعينات على الجليد. لجمع الأغشية، طرد زجاجات البولي في 184، 500 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.وأخيرا ، والتخلص من كبرى وإضافة 500 إلى 1 ، 000 ميكرولترات من المخزن العازلة. إعادة تعليق الأغشية عن طريق التجانس Dounce. جمع العينات في اثنين ملليلتر microcentrifuge أنابيب.تم كشط الكريات الغشاء الكلي، Dounce متجانسة و ultracentrifuged على التدرجات كثافة السكروز لفصل الأغشية الداخلية والخارجية. وكان تدرج كثافة السكروز بنسبة 20٪ 53٪73٪ كافياً لتقسيم بعض السلالات البكتيرية. ولكن ليس لتقسيم A.baumannii التي تم تقسيمها بنجاح باستخدام 20٪ 45 ٪ 73 ٪ التدرج.لتقييم كفاءة الفصل، تم اختبار عينات غشاء لdhydrogenase NADH، وهو إنزيم يقع في الغشاء الداخلي البكتيري. انخفاض في الكثافة البصرية في 340 نانومتر يشير إلى وجود الانزيم. تم قياس الكثافة البصرية ل50 ميكروغرام عينات من كسور الغشاء الداخلي والخارجي من نوع البرية S.typhimurium، E.coli K12 DH5a وgale متحولة S.typhimurium.أضيف تركيز أعلى من البروتين عند تحليل نقاء كسور غشاء A.baumannii لأن الفحص الأولي باستخدام 50 ميكروغرام يشير إلى أن المستويات النسبية من dehydrogenase NADH كانت أقل بالنسبة لـ A.baumannii من السلالات البكتيرية الأخرى. لتقييم التلوث المتقاطع لكسور الغشاء الداخلي مع كسور الغشاء الخارجي، تم استخراج LPS و LOS وتصور. تم تحميل المقتطفات على هلام بولياكريلاميد وملطخة برو كيو الزمرد 300.Acinetobacter baumannii هو أولوية قصوى ، متعددة الأدوية المقاومة ، مسببات الأمراض البشرية. وينبغي أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في فهم أدوار lipooligosaccharides، فوسفوليبيدات وبروتينات الدهون في آليات المقاومة والفوعة من هذا الممرض فريدة ومهمة. هذه الطريقة مثالية لتحليل المصب من الفوسفوليبيدات، الكربوهيدرات الجليجليبيدس، والبروتينات والجزيئات الصغيرة التي توجد عادة داخل الأغشية المزدوجة من البكتيريا السلبية الغرام.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

لين العريكة التهابات خلايا الثدييات مع طفيل وحيد الخلية، تستعد البكتيريا

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

مضان المجهري طرق لتحديد الجدوى من البكتيريا في جمعية مع خلايا الثدييات

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

في فيفو التحقيق من مضادات الميكروبات العلاج الضوء الأزرق للمقاومة للأدوية المتعددة baumannii الراكدة حرق العدوى عن طريق تلألؤ بيولوجي التصوير

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

البكتيريا المستروحة الخارجي غشاء الحويصلات: عزل وتحليل إمكاناتهم الموالية للالتهابات في الضامة

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

تطبيق اضطرابات متناسقة تشبه التدليك على عجول الماوس ومراقبة التغيرات الناتجة عن الضغط العضلي العضلي

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

فصل البشرة الجرذ والأدمة مع Thermolysin للكشف عن موقع محدد الحمض النووي الريبي الالتهابي والبروتين

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

نموذج تصوير حديثي الولادة من تعفن الدم البكتيري السلبي للجرام

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

يساهم ميكروفون الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر في الفوعة في بروتينات الغشاء الخارجي في السالمونيلا المعوية

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...