Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
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这项工作由P20GM10344和R01AI139248资助，授予Z.D.Dalebroux。

1. 膜提取的一般试剂和介质制备
<ol><li>细菌生长介质：在彻底清洁和自洗的2 L烧瓶中制备和消毒1升肉汤。</li>
	<li>一般重新悬浮缓冲液（1 M Tris 缓冲 pH 7.5;50 mL）：在 30 mL 的 H2O. 将 pH 调整到 7.5 与 5 M HCl2的 Tris 基 6.05 g。</li>
	<li>二价阳化溶液（0.5 M EDTA pH 8;100 mL）主库存：加入18.6克二钠乙酸乙烯*2H2O至80 mLH2O.大力搅拌，用NaOH将pH调整至8.0。使用超纯 H2O 将?...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

该方法将继续帮助研究人员了解细胞包络在细菌生理学和发病机制中的作用。在顺序超中心化步骤之后，可以获得纯化的总、内和OM分数。这些膜可以单独检测，以测试与膜蛋白的定位和功能、跨近质的运输和贩运以及不同环境条件下单个双层的组成相关的假设。探索单个OM成分在发病机制（如LOS/LPS和OM蛋白）中的参与的生物研究，也可以使用该技术收集的分离膜分数在动物和细胞模型中进行。</p...

革兰氏阴性细菌产生两个膜，由围皮空间和肽多基细胞壁1分离。内膜 （IM） 包裹细胞醇，是磷脂的对称双层。Peptidoglycan 可防止黄土压，并为细菌提供细胞形状，并通过脂蛋白2、33连接到外膜 （OM）。OM 环绕着周围，主要是不对称的。内单由磷脂组成，外单由被称为脂质糖（LOS）或脂质糖（LPS）4、5的糖脂组成。4,5外文中LOS/LPS分子的脂质不对称和生物化学赋予了细胞表面屏障特性，保护细菌免受其环境中的危害。,7
LPS分子由三个成分组成：脂质A脱糖脂、核心寡糖和O-多糖或O抗原。脂质A是一种成倍的青化脱糖脂。核心寡糖由 10-15 种糖组成，称为粗糙 LPS 或 R-LPS。核心被细分为内区，由2-keto-3-脱氧-D-八氯苯酚酸（kdo）和一个或多个异丙酮残留物组成，外区域通常由异丙酮（葡萄糖或乳糖）和异糖组成，或乙酰氨基糖5。外芯区域的组成和结构比内核更可变。在沙门氏菌中，只描述了一个核心结构;然而，在大肠杆菌中有五种不同的核心结构（指定K-12、R1、R2、R3和R4）8。8大肠杆菌K-12 DH5+，我们在这个过程中使用携带突变，导致生产R-LPS9。9R-LPS分子缺乏O抗原多性，其分子量与LOS分子相似。
在R-LPS中加入O抗原，使这种分子变成平滑的LPS，或S-LPS。O抗原由短3-4碳水化合物亚单位组成，由不同链长10的多种形态组成。一些产生LPS的细菌，如沙门氏菌肠血清菌型（S.典型，在其表面10，11,11上显示LPS分子的三模态分布。超长链O抗原可以包含超过一百个子单位，重量超过一百千元。O抗原为细菌提供表面特性，这些特性是抵抗抗生素、逃避噬菌体捕食和引起疾病所必需的。
弯曲杆菌、博尔德泰拉、阿辛托细菌、血友、奈塞利亚等物种在其表面12上产生LOS分子，而不是LPS分子。LOS分子由脂质A和核心寡糖组成，但缺乏O抗原。这些类型的克拉姆阴性细菌修改其核心寡糖与额外的糖和糖的组合，以改变表面属性12。LOS和LPS产生的微生物都衍生出脂质A和核心分子上的磷酸盐，具有阳离子莫伊酸7。这些添加物包括磷脂胺、乳糖胺和氨基拉比诺替代物，它们通过中和阴离子表面电荷发挥作用，从而防止阳离子抗菌肽。革兰氏阴性细菌还用糖的可变非糖基法替代或额外的kdo分子来改变核心寡糖结构，并改变脂质-A脱糖脂7上的acyl链的数量。
将IM从克拉姆阴性细菌的OM中分离的能力有助于了解细胞包络在抗微生物药物耐药性和疾病发病机制中的作用。,12该方法的推导用于推断OM的蛋白质、磷脂和糖脂成分的组装、维护和重塑机制。
我们的实验室定期进行细菌性脂质分析，以研究各种克拉姆阴性物种中蛋白质介导的脂质调节和脂质功能。协议中使用的体积反映了这个程序的常规使用，通过薄层色谱和液色谱串质谱13，14,14分析非放射性标记的磷脂。
该协议首先将克拉姆阴性细菌的冷冻悬浮液暴露在蔗糖的高渗透溶液中，并加入溶酶酶，将OM与底层的肽多解酶层分离（图1）12。然后添加EDTA以方便淋酶的渗透，因为二价阳离子固固会破坏相邻LOS/LPS分子15之间的横向静电桥接相互作用。我们原来的协议已经适应需要形成球蛋白，一种由血浆膜和细胞溶质组成的Gram阴性细菌细胞形式，但缺乏肽多解层和OM。有可能由经过调整的方法产生球体;然而，该技术并不依赖或打算依靠它们的形成来取得成功。相反，在加压淋液之前，通过离心和重新悬浮在浓度较低的蔗糖溶液中，解压酶-EDTA处理的细菌会迅速收获。理论上，可能通过形成球蛋白释放的OEM应该从经过处理的细胞的超钠中收集，但这种方法在这里没有详细说明。最终，经过处理的细胞受到传统的均质化和赖塞，提高了膜分离程序16的效率和可重复性。
在镇理作用后，通过超离心采集总膜，并应用于不连续蔗糖密度梯度，以分馏IM和OEM。经典方法使用一个更连续的梯度，包括至少五个不同的蔗糖溶液11，12。11,我们协议中的不连续梯度由三个蔗糖解组成，并将双层划分为两个不同的分数17。Gram阴性细菌的OM中的LOS和LPS分子驱动包络分割成上棕色低密度IM分数和低白色高密度OM分数（图1和图2）。
甲酸杆菌是重要的耐多药人类病原体，在OM中产生LOS分子，并竖立一个难以分离的,细胞包络。最近的研究表明，我们在这里介绍的协议的推导可以用来分割这些生物体的两层20。因此，我们在A. baumannii 17978 上测试了我们的协议。最初，程序不够充分。然而，我们修改了中密度溶液的蔗糖浓度，并大大提高了分离（图2）。NADH脱氢酶测定和LOS/LPS提取和检测程序用于确认野生S型A.baumannii的分离。典型和两个O抗原缺乏肠细菌基因型;即，加仑-突变S。典型和实验室菌株，大肠杆菌DH5+（图3和图4）。
这项工作的目的是提供一种简化的方法，以可重现地隔离Gram阴性细菌的膜。该协议可用于研究这些微生物的多种膜相关分子。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

该方法通过将Gram阴性细菌的包络分为全膜、内膜和外膜（OM）分数，最后进行检测，以评估双层的纯度。OM 与内膜相比，整体密度增加，这主要是由于外张中存在脂糖 （LOS） 和脂多糖 （LPS）。LOS 和 LPS 分子是具有类似结构的两栖糖脂，它由脂质-A 脱沙脂和核寡糖基物组成。然而，只有LPS分子用第三个子单位（称为O-多糖，或O抗原）装饰。存在的糖脂的类型和量将影响生物体的OM密度。因此，我们测试了糖脂含量变化的细菌膜是否可以使用我们的技术进行类似的分离。对于产生LPS的生物体，沙门氏菌血清型典型和大肠杆菌，膜很容易分离，LPS O抗原莫伊蒂不影响双层分裂。鲍曼尼阿辛托细菌产生LOS分子，其质量与O抗原不足的LPS分子相似;然而，这些微生物的膜最初无法分离。我们推断，A. Baumannii的OM比肠杆菌的密度小，因此对蔗糖梯度进行了调整，并分离了膜。因此，该技术可以进行调整和修改，以便与其他生物体一起使用。

该技术为灭尔巴氏阴性细菌的IM和OEM分离提供了一种有效的方法。说明了整个过程的大纲（图1）。一般来说，培养物的正常化到OD600的OD 600为0.6-0.8，在1升介质中，或在6.0×1011细菌细胞之间收获，将确保收集适量的膜材料，以便随后分离。
在裂化细菌和超脱乳时，超离心管底部会可以看到粘性棕色总膜颗粒。在刮擦、脱质均匀和超心化膜...

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Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

革兰氏阴性细菌产生两个空间隔离膜。外膜由围皮层和气膜层从内膜分割。分离这些微生物的双层的能力对于了解它们的生理和发病机制至关重要。

将葛兰阴性细菌的细胞包络分离到内膜和外膜分数，对阿辛托巴基的培养素进行技术调整

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

研究微生物如何调节单个双层的化学成分，将告知我们对抗生素杀灭、抗微生物药物耐药性和疾病发病机制的了解。此技术将克阴性细菌的细胞包络分割成两个定义的分数，而无需使用洗涤剂。因此，脂质、蛋白质和糖可以在半原生的环境中进行评估。有些步骤取决于时间，需要重点和协调。最初，使用一个或两个示例。当一个人的舒适度升高时，可以添加更多的样品。一次处理样本不应超过六个。这是一个多天的过程，视觉检查点有助于评估有效性和错误。在执行此操作之前，有时执行最后步骤。将冷冻甘油库存中的细菌从新鲜阿加子板上划到新鲜阿加子板上。一旦菌落发展，将盘子储存在摄氏四度。使用单个菌落接种充满肉汤培养的五毫升管，并根据需要在一夜之间培养细菌。背部稀释隔夜细菌培养成一升首选的肉汤培养基，并孵育烧瓶。达到所需的光学密度后，从培养箱中取出烧瓶并将其放在冰上。以600纳米测量培养的光学密度，并计算相当于11个细菌群落形成单位的6至8倍的培养量。将这种培养量添加到离心管中，确保剩余的培养物在冰上停留，直到使用。以固定角度离心10分钟，在7000至10000倍的G和4摄氏度的高速离心机中对细菌进行离心。小心地将上一液丢弃。将每个细胞颗粒重新悬浮在12.5毫升缓冲液中，在细胞悬浮液中加入磁搅拌棒。在每个细胞再吸收中加入180微升，每毫升10毫克。通过离心收集解酶EDTA处理细菌后，迅速将蛋白酶抑制剂、氯化镁和核酸酶加入细菌体内，并迅速将细胞重新悬浮在缓冲液B.Stir中两分钟，将悬浮液留在冰上。接下来，向每个细胞重新悬浮添加12.5毫升1.5毫升EDTA溶液，并在冰上继续搅拌7分钟。将悬浮液放入 15 毫升锥形管中。在摄氏4度下将悬浮液在9000至11000次G下离心10分钟。将超自然剂丢弃到生物危害废物容器中，并保留在冰上颗粒。在每个细胞颗粒中加入25毫升的缓冲B。然后，加入55微升的一个摩尔氯化镁，一微升的rnase/dnase/核酸酶试剂和一微升蛋白酶抑制剂鸡尾酒。将颗粒重新放入混合物中。大力移液器和涡流，直到溶液看起来同质。将悬浮液存放在冰上。将样品倒入均质器样品缸中，使细胞为 20，000 PSI。为避免病原体气溶胶化，在缓冲液B中对加压装置进行调节，并在添加细菌悬浮液前调整压力水平。接合压力电池，并暗指10毫升缓冲B作为预防措施。在冰上收集50毫升圆锥管中的细胞解酸，同时将样品留在冰上。要实现完全的解解，请重复此过程三到五次。为了将剩余的、完好无损的细胞材料进行颗粒化，将 6、169 倍 G 和 4 摄氏度的磨液细菌样品离心 10 分钟。将现在含有均质膜的超自然剂分发到聚碳酸酯瓶中，进行超离心。超离心细胞在184，500倍G和4摄氏度下离水至少一小时。丢弃超自然剂，将膜颗粒保留在冰上。使用玻璃，Dounce 均质器，将膜颗粒重新在低密度等质蔗糖梯度溶液的一毫升中重新暂停。然后，使用玻璃，巴斯德移液器将样品均质转移到1.5毫升微离心管，并放在冰上。要准备蔗糖梯度，请将聚丙烯或超透明开顶管保持稍微倾斜的位置。慢慢加入两毫升的高密度蔗糖溶液。然后加入四毫升的低密度蔗糖溶液。准备密度梯度时，缓慢添加蔗糖溶液，以避免混合层。蔗糖层应稍微可见，并且通常被定义。接下来，加入以前在一毫升低密度、等糖溶液中重新暂停的总膜分数。最后，通过加入大约六毫升的低密度，等值的蔗糖梯度溶液来填充管的其余部分。在288，000倍的G和4摄氏度的左右温度下，使用摆动桶转子对样品进行16至23小时的超离心。从该点切下 P1000 移液器尖端约 5 毫升。离心完成后，使用移液器从管子上去除上棕色层。将含有内膜分数的这层转移到聚碳酸酯瓶中，进行超离心。在53%蔗糖和73%蔗糖之间的界面上方留下大约两毫升的蔗糖溶液，以确保下部、白色外膜部分不会交叉污染内膜分数。再次使用 P1000 移液器尖端，端端拆下外膜层并将其转移到聚碳酸酯瓶中。用隔离膜储存缓冲液填充聚碳酸酯瓶的剩余空隙，通过反转或管道混合。将样品保留在冰上。为了收集膜，超离心聚碳酸酯瓶在184，500倍G和4摄氏度一个小时。最后，丢弃超钠，添加 500 到 1000 微升的存储缓冲液。通过 Dounce 均质重新暂停膜。在两毫升微离心管中收集样品。总膜颗粒被刮掉，Dounce均匀化，在蔗糖密度梯度上超离心，以分离内膜和外膜。蔗糖密度梯度为20%53%73%足以分割一些细菌菌株。但不是为分区 A. baumannii， 这是成功地分区使用 20%45%73% 梯度。为了评估分离的效率，对膜样品进行了NADH脱氢酶测试，这是一种位于细菌内膜中的酶。340纳米的光学密度下降表明酶的存在。对来自野生型S.typhimurium、大肠杆菌K12 DH5a和galE突变S.typhimurium的50微克内膜和外膜分数样本测量了光学密度。在测定A.baumannii膜分数的纯度时，蛋白质的浓度更高，因为使用50微克的初步测定表明，A.baumannii的NADH脱氢酶的相对水平低于其他细菌菌株。为了评估内膜分数与外膜分数的交叉污染，提取并可视化LPS和 LOS。提取物被加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并沾染了Pro-Q翡翠300。阿辛托菌鲍曼尼是头等大事，耐多药，人类病原体。该协议应有助于研究人员了解利皮利戈糖、磷脂和脂蛋白在这种独特而重要的病原体的抗药性和毒性机制中的作用。此方法非常适合下游分析磷脂、糖脂碳水化合物、蛋白质和小分子，这些分子通常存在于克阴性细菌的双膜中。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

热酚水提取纯化及革兰氏阴性菌脂多糖的可视化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

科研

免疫与感染

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

听话的哺乳动物细胞原生动物引发的细菌感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

荧光显微镜方法测定细菌在协会的可行性与哺乳动物细胞

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

革兰从血培养液使用MALDI-TOF质谱阴性细菌快速鉴定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

在抗菌蓝光治疗的体内研究的多药耐药鲍曼不动杆菌感染烧伤利用生物发光成像

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

嗜肺军团菌外膜囊泡：隔离及对巨噬细胞促炎潜力分析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

在小鼠小腿上应用一致的按摩样扰动，并监测由此产生的肌肉压力变化

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

将鼠皮皮和皮米与热解辛分离，以检测部位特异性炎症mRNA和蛋白质

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

革兰阴性细菌败血症的新生儿成像模型

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

非编码小RNA MicC有助于肠炎 沙门氏菌 外膜蛋白的毒力

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...