Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Dette arbejde blev finansieret af P20GM10344 og R01AI139248 tildelt Z. D. Dalebroux.

1. Almene reagenser og medieforberedelse til membranekstraktion
<ol><li>Bakterievækst medier: Forbered og sterilisere 1 L bouillon medier i en grundigt rengjort og autoclaved 2 L kolbe.</li>
	<li>Generel resuspensionsbuffer (1 M Tris Buffer pH 7,5; 50 ml): Opløs 6,05 g Tris base i 30 ml H2O. Juster pH til 7,5 med 5 M HCl. Juster det endelige volumen til 50 ml med ultraren H2O.</li>
	<li>Stambouillon af divalent kationkelationopløsning (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Der tilsættes 18,6 g dinatriumet...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

Denne metode vil fortsætte med at hjælpe forskere med at forstå cellekuvertens rolle i bakteriel fysiologi og patogenese. Efter de sekventielle ultracentrifugeringstrin kan der opnås en renset total, indre og OM-fraktion. Disse membraner kan assayes isoleret for at teste hypoteser relateret til membran protein lokalisering og funktion, transport og menneskehandel på tværs af periplasm, og sammensætningen af de enkelte bilag under forskellige miljøforhold. Biologiske undersøgelser, der undersøger inddragelsen af...

Gram-negative bakterier producerer to membraner, der er adskilt af en periplasmic rum og en peptidoglycan celle væg1. Den indre membran (IM) omslutter cytosol og er en symmetrisk tolags af fosfolipider. Peptidoglycan beskytter mod turgor tryk og giver bakterien med en celleform, og er knyttet til den ydre membran (OM) af lipoproteiner2,3. OM omgiver periplasm og er overvejende asymmetrisk. Den indre folder består af fosfolipider og den ydre folder består af glycolipider kendt som lipooligosaccharider (LOS) eller lipopolysaccharider (LPS)4,5. Lipidasymmetrien og biokemien af LOS/LPS-molekylerne i den ydre folder giver barriereegenskaber til celleoverfladen , som beskytter bakterien mod farer i omgivelserne6,7.
LPS molekyler består af tre bestanddele: lipid en disaccharolipid, kernen oligosaccharid, og O-polysaccharid eller O-antigen. Lipid A er en formere acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharider består af 10-15 sukkerarter kendt som ru LPS eller R-LPS. Kernen er opdelt i den indre region, der består af 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic syre (kdo) og en eller flere heptose rester, og en ydre region, der består generelt af hexoses (glukose eller galactose) og heptoses, eller acetamido sukker5. Den ydre kerneregion er mere variabel i sine komponenter og struktur end den indre kerne. I Salmonella spp., kun én kernestruktur er blevet beskrevet; I Escherichia coli er der dog fem forskellige kernestrukturer (kaldet K-12, R1, R2, R3 og R4)8. E. coli K-12 DH5α, som vi bruger i denne procedure bærer en mutation, der resulterer i produktion R-LPS9. R-LPS molekyler mangler O-antigen moiety og har en lignende molekylvægt til LOS molekyler.
Tilføjelsen af O-antigen til R-LPS forvandler dette molekyle til glat LPS, eller S-LPS. O-antigenerne er bygget af korte 3-4 kulhydratunderenheder og består af flere modaliteter med varierende kædelængder10. Nogle LPS-producerende bakterier, som Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), vise en trimodal fordeling af LPS molekyler på deres overflade10,11. Meget lange kæde O-antigener kan indeholde over hundrede underenheder og vejer over hundrede kilodalton. O-antigener giver overflade egenskaber til bakterien, der er nødvendige for at modstå antibiotika, undgå predation af bakteriofager, og forårsage sygdom.
Arter af Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria og andre genererer LOS molekyler i stedet for LPS molekyler på deres overflade12. LOS molekyler består af lipid A og kerne oligosaccharider, men mangler O-antigen. Disse typer af Gram-negative bakterier ændre deres kerne oligosaccharider med yderligere sukker og kombinationer af sukker til at ændre overflade egenskaber12. Både LOS- og LPS-producerende mikrober derivatiserer fosfaterne på lipid A og kernemolekyler med kationiske moieties7. Disse tilføjelser omfatter fosforethanolamin, galactosamin og aminoarabinose substitutioner, som fungerer ved at neutralisere anioniske overflade ladning og dermed beskytte mod kationiske antimikrobielle peptider. Gram-negative bakterier også ændre kernen oligosaccharid struktur med variable ikke-stoichiometric substitutioner af sukker, eller ekstra kdo molekyler, og ændre antallet af acyl kæder på lipid-A disaccharolipider7.
Evnen til at isolere iM fra OM af Gram-negative bakterier har været medvirkende til at forstå den rolle, som cellen kuvert i antimikrobiel resistens og sygdom patogenese11,12. Afledning af denne fremgangsmåde er blevet brugt til at udlede mekanismer til samling, vedligeholdelse og remodeling af protein, fosfolipid, og glycolipid bestanddele for OM.
Vores laboratorium udfører rutinemæssigt bakterielle lipidomiske analyser for at studere proteinmedieret lipidregulering og lipidfunktion i en række Gram-negative arter. De mængder , der anvendes i protokollen , afspejler den rutinemæssige anvendelse af denne procedure til at analysere ikke-radioaktivt mærkede fosfolipider ved tyndt lag kromatografi og flydende kromatografi tandem massespektrometri13,14.
Protokollen begynder med at udsætte en kølet suspension af Gram-negative bakterier for en høj osmolar opløsning af saccharose og tilføje lysozym at adskille OM fra det underliggende peptidoglycan lag (Figur 1)12. EDTA tilsættes derefter for at lette indtrængningen af lysozymen, da divalent kationbinding forstyrrer de laterale elektrostatiske overgangsinteraktioner mellem tilstødende LOS/LPS-molekyler15. Den oprindelige protokol, hvorfra vores er blevet tilpasset krævede dannelsen af sfærolaster, en Gram-negativ bakteriecelleform, der består af en plasmamembran og cytosol, men mangler peptidoglycan lag og en OM. Det er muligt, at sfæroplaster fremstilles ved hjælp af den tilpassede metode. men teknikken ikke stole eller har til hensigt at deres dannelse for succes. I stedet høstes de lysozyme-EDTA-behandlede bakterier hurtigt ved centrifugering og resuspenderes i en saccharoseopløsning med mindre koncentration før tryklysis. De OEM'er, der kunne være blevet frigivet ved at danne sfærolaster, bør i teorien kunne høstes fra supernatanterne i de behandlede celler, men denne fremgangsmåde er ikke beskrevet heri. I sidste ende udsættes de behandlede celler for konventionel homogenisering og lysis, hvilket øger effektiviteten og reproducerbarheden af membranseparationsproceduren16.
Efter lysis opsamles de tosamlede membraner ved ultracentrifugering og påføres en diskontinuerlig saccharosetæthedsgradient for at brøkse IMs og OEM'er. Den klassiske tilgang anvender en mere kontinuerlig gradient , der består af mindst fem forskellige saccharoseopløsninger11,12. Den diskontinuerlige gradient i vores protokol består af tre saccharoseopløsninger og partitionerer de to lag i to forskellige fraktioner17. LOS- og LPS-molekylerne i de gramnegative bakteriers OEM-bakteriers OEM-kortskaber driver konvolutten til at opdele den i en øvre brun imfraktion med lav densitet og en lavere hvid OM-fraktion med høj densitet (figur 1 og figur 2).
Acinetobacter baumannii er vigtige multiresistente humane patogener , der producerer LOS molekyler i deres OM og opføre en celle kuvert, der er vanskeligt at adskille18,19. Nylige arbejde tyder på, at en afledning af den protokol, vi præsenterer her, kan bruges til at opdele de tolag af disse organismer20. Derfor testede vi vores protokol på A. baumannii 17978. I første omgang var proceduren utilstrækkelig. Vi har imidlertid ændret saccharosekoncentrationen af mellemtæthedsopløsningen og forbedret separationen betydeligt (figur 2). En NADH dehydrogenase analyse og en LOS / LPS udvinding og detektion procedure blev brugt til at bekræfte adskillelse for A. baumannii, vilde type S. Typhimurium og to O-antigen mangelfuld enterobakterielle genotyper; nemlig galE-mutant S. Typhimurium og en laboratoriestamme, E. coli DH5α (Figur 3 og Figur 4).
Hensigten med dette arbejde er at levere en strømlinet tilgang til reproducerbart isolere membraner af Gram-negative bakterier. Protokollen kan bruges til at studere mange typer af membran-associerede molekyler til disse mikrober.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

Denne metode virker ved at opdele kuverten af Gram-negative bakterier i total, indre og ydre membran (OM) fraktioner og slutter med analyser til at vurdere renheden af de tolage. OM har en øget samlet tæthed i forhold til den indre membran, hovedsagelig på grund af tilstedeværelsen af lipooligosaccharider (LOS) og lipopolysaccharider (LPS) i den ydre folder. LOS og LPS molekyler er amøse glycolipider, der har en lignende struktur, som består af en lipid-A disaccharolipid og core-oligosaccharid substituent. Men kun LPS molekyler er dekoreret med en tredje underenhed kendt som O-polysaccharid, eller O-antigen. Typen og mængden af glycolipider til stede vil påvirke en organismes OM tæthed. Derfor testede vi, om membranerne af bakterier med varieret glycolipid indhold kunne være tilsvarende isoleret ved hjælp af vores teknik. For de LPS-producerende organismer, Salmonella enterica serovar Typhimurium og Escherichia coli, var membranerne let isolerede, og LPS O-antigenmoiety påvirkede ikke tolagsopdelingen. Acinetobacter baumannii producerer LOS molekyler, som har samme masse som O-antigen mangelfuld LPS molekyler; membranerne i disse mikrober kunne dog ikke i første omgang adskilles. Vi ræsonnerede, at OM af A. baumannii var mindre tæt end enterobakterier, så saccharosegradienten blev justeret, og membranerne blev isoleret. Teknikken kan derfor tilpasses og ændres til brug sammen med andre organismer.

Denne teknik giver et effektivt middel til at isolere IMs og OEM'er for Gram-negative bakterier. En oversigt over hele proceduren er illustreret (Figur 1). Generelt vil normalisering af kulturer til en OD600 på 0,6-0,8 i 1 L af medier, eller høst mellem 6,0 og 8,0 x 1011 bakterieceller sikre, at den passende mængde membranmateriale indsamles til efterfølgende adskillelse.
Ved lysing af bakterierne og ultracentrifugering af lysatet vil en ...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negative bakterier producerer to rumligt adskilte membraner. Den ydre membran er opdelt fra den indre membran af en periplasm og et peptidoglycan lag. Evnen til at isolere de dobbelte tolag af disse mikrober har været afgørende for at forstå deres fysiologi og patogenese.

Adskillelse af cellekonvolutten for Gram-negative bakterier i indre og ydre membranfraktioner med tekniske justeringer for Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Undersøgelse af, hvordan mikrober regulerer den kemiske sammensætning af de enkelte tolagser vil informere vores viden om mekanismer af antibiotika drab, antimikrobiel resistens og sygdomspatogenese. Denne teknik opdeler cellekonvolutten for gram-negative bakterier i to definerede fraktioner uden brug af vaskemiddel. Derfor kan lipider, proteiner og sukker vurderes i et miljø, der er semi-native.Nogle af trinene er tidsafhængige og kræver fokus og koordinering. Brug i første omgang en eller to prøver. Når ens komfort niveau stiger, kan flere prøver tilføjes.Der må ikke behandles mere end seks prøver på én gang. Dette er en flerdagsprocedure, og visuelle kontrolpunkter er nyttige til at vurdere effektivitet og fejl. Før du udfører dette nogle gange sidste trin.Streak bakterierne fra frosne glycerol bestande på friske agar plader. Når kolonier udvikle, gemme pladerne på fire grader Celsius. Brug en enkelt koloni til at vaccinere en fem milliliter rør fyldt med bouillon medier og kultur bakterierne som ønsket natten over.Tilbage fortynde natten bakteriekultur i en liter af de foretrukne bouillon medier og inkubere kolber. Når den ønskede optiske tæthed er opnået, fjernes kolberne fra inkubatoren, og de anbringes på is. Mål kulturens optiske tæthed ved 600 nanometer, og beregn den mængde kultur, der svarer til mellem seks og otte gange 10 til den ellevte bakteriekoloni, der danner enheder.Tilsæt denne mængde kultur til et centrifugerør, og sørg for, at de resterende kulturer forbliver på is, indtil de skal bruges. Pellet bakterierne ved centrifugering i 10 minutter ina en fast vinkel, høj hastighed centrifuge på 7, 000 til 10, 000 gange G og fire grader Celsius. Supernatanten dekanteres forsigtigt, og den kasseres.Resuspend hver celle pellet i 12,5 milliliter buffer A.Tilføj en magnetisk røre bar til cellen suspension. Der tilsættes 180 mikroliter på 10 mg pr. milliliterlyozym til hver celle resuspension. Efter indsamling af lysozym EDTA behandlede bakterier ved centrifugering, hurtigt tilføje protease hæmmer, magnesiumchlorid og nuklease til bakterier og hurtigt resuspend cellerne i buffer B.Stir i to minutter, holde suspensioner på is.Dernæst tilsættes 12,5 milliliter 1,5 millimolar EDTA-opløsning til hver celle re-suspension og fortsætte omrøring på is i yderligere syv minutter. Suspensionerne dekanteres i 15 milliliter koniske rør. Centrifuge suspensioner på 9, 000 til 11, 000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Kassér supernatanterne i en beholder til biofarligt affald, og opbevar pillerne på is. Der tilsættes 25 milliliter buffer B til hver cellepellet. Derefter tilsættes 55 mikroliter af en molære magnesiumchlorid, en mikroliter af rnase/dnase/nukleoser og en mikroliter proteasehæmmercocktail.Opspræn opsprænt pellets i blandingen. Kraftigt pipette og vortex, indtil opløsningerne ser homogene ud. Opbevar suspensionerne på is.Prøven hældes i homogenisatorprøvecylinderen, og cellen bringes op på 20.000 PSI. For at undgå aerosolisering af patogener, betingelse det trykregulerede apparat i buffer B og justere trykniveauer, før du tilføjer bakteriel suspension. Trykcellen aktiveres, og der skal være 10 milliliter buffer B som en sikkerhedsforanstaltning.Cellerne opsamls i 50 milliliter koniske rør på is, samtidig med at prøverne opbevares på is. For at opnå fuldstændig lysis gentages denne proces tre til fem gange. At pellet de resterende, intakt, cellemateriale, centrifuge de lysed bakterielle prøver på 6, 169 gange G og fire grader Celsius i 10 minutter.Fordel supernatanterne, som nu indeholder de homogeniserede membraner, i polycarbonatflasker til ultracentrifugering. Ultracentrifuge cellen lyser ved 184, 500 gange G og fire grader Celsius i mindst en time. Kassér supernatanterne og opbevar membranpillerne på is.Ved hjælp af et glas, Dounce homogenisator, resuspend membran piller i en milliliter af lav densitet isopycnic saccharose gradient løsning. Brug derefter et glas, Pasteur pipette til at overføre prøven homogenat til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og placere røret på is. For at forberede saccharosegradienten skal du holde et polypropylen- eller Ultra-clear Open-Top-rør i en let vippet position.Tilsæt langsomt to milliliter af den højere densitet saccharoseopløsning. Derefter tilsættes fire milliliter af den lavere densitet saccharoseopløsning. Når tætheden er ved udarbejdelsen, tilsættes saccharoseopløsningen langsomt for at undgå at blande lagene.Saccharoselagene skal være svagt synlige og fremstå som almindeligt definerede. Dernæst tilsættes den samlede membranfraktion, som tidligere blev resuspenderet i en milliliter lav tæthed, isopynic saccharoseopløsning. Endelig fyldes resten af røret ved at tilsætte ca. seks milliliter den lave massefylde, isopykniske saccharosegradientopløsning.Ultracentrifuge prøverne ved hjælp af en svingende spand rotor ved 288, 000 gange G og fire grader Celsius i 16 til 23 timer. Skær enden af en P1000 pipette spids omkring fem milliliter fra det punkt. Når centrifugering er afsluttet, skal du bruge pipetten til at fjerne det øverste, brune lag fra røret.Overfør dette lag, som indeholder den indre membranfraktion, til en polycarbonatflaske til ultracentrifugering. Der efterlades ca. to milliliter af saccharoseopløsningen over grænsefladen mellem 53%sucrose og 73%saccharose for at sikre, at den nederste, hvide, ydre membranfraktion ikke krydsforurerer den indre membranfraktion. Igen ved hjælp af en P1000 pipette spids med enden fjernet, fjerne den ydre membran lag og overføre det til en polycarbonat flaske.Fyld det resterende tomrum af polycarbonatflaske med isoleret membranlagringsbuffer og bland ved inversion eller pippetting. Opbevar prøverne på is. For at indsamle membranerne, ultracentrifuge polycarbonat flasker på 184, 500 gange G og fire grader Celsius i en time.Endelig kassere supernatants og tilføje 500 til 1, 000 mikroliter af opbevaring buffer. Resuspend membranerne ved Dounce homogenisering. Prøverne udtages i to milliliter mikrocentrifugerør.Total membran pellets blev skrabet, Dounce homogeniseret og ultracentrifugeret over saccharosetæthed gradienter at adskille de indre og ydre membraner. En saccharosetæthed gradient på 20%53%73% var tilstrækkelig til partitionering nogle bakterielle stammer. Men ikke for partitionering A.baumannii, som blev partitioneret ved hjælp af en 20%45%73%gradient.For at vurdere adskillelsens effektivitet blev membranprøver testet for NADH dehydrogenase, et enzym placeret i den bakterielle indre membran. Et fald i optisk tæthed ved 340 nanometer indikerede tilstedeværelsen af enzymet. Optisk tæthed blev målt for 50 mikrogram prøver af indre og ydre membranfraktioner af vild type S.typhimurium, E.coli K12 DH5a og galE mutant S.typhimurium.En højere koncentration af protein blev tilføjet ved analyse af renheden af A.baumannii membranfraktioner, fordi en indledende analyse med 50 mikrogram tydede på, at de relative niveauer af NADH-dehydrogenase var lavere for A.baumannii end for de andre bakteriestammer. For at vurdere krydskontaminering af de indre membranfraktioner med ydre membranfraktioner blev LPS og LOS ekstraheret og visualiseret. Ekstrakterne blev læsset på en polyarylamid gel og farves med Pro-Q Emerald 300.Acinetobacter baumannii er en topprioritet, multi resistent, humant patogen. Denne protokol bør hjælpe forskere med at forstå rollerne af lipooligosaccharider, fosfolipider og lipoproteiner i resistens og virulens mekanismer af denne unikke og vigtige patogen. Denne metode er ideel til downstream analyse af fosfolipider, glycolipids kulhydrater, proteiner og små molekyler, der typisk findes inden for de dobbelte membraner af gram-negative bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Oprensning og visualisering af lipopolysaccharid fra Gram-negative bakterier ved varm vandig-phenolekstraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Medgørlige pattedyrscellelinier Infektioner med protozo-primede Bakterier

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi Metoder til bestemmelse af levedygtighed Bakterier i foreningen med pattedvrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In vivo Undersøgelse af antimikrobielle Blue Light terapi for multiresistent Acinetobacter baumannii Burn Infektioner Brug Bioluminescens Imaging

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ydermembranvesikler: Isolering og analyse af deres pro-inflammatorisk potentiale på makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse af konsekvente massage lignende forstyrrelser på muse kalve og overvågning af de resulterende intramuskulære trykændringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Adskillelse af Rotte Epidermis og Dermis med termolysin til at opdage site-specifikke inflammatoriske mRNA og protein

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

En neonatal Imaging Model af Gram-Negative bakteriel sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

En ikke-kodende lille RNA-mikrofon bidrager til virulens i ydre membranproteiner i Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...