Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von P20GM10344 und R01AI139248 an Z. D. Dalebroux vergeben.

1. Allgemeine Reagenzien und Medienvorbereitung für die Membranextraktion
<ol><li>Bakterielle Wachstumsmedien: Bereiten Sie 1 L Brühemedien in einem gründlich gereinigten und autoklavten 2 L Kolben vor und sterilisieren.</li>
	<li>Allgemeiner Reaufhängungspuffer (1 M Tris Puffer pH 7,5; 50 ml): 6,05 g Tris-Basis in 30 ml H2O auflösen. pH auf 7,5 mit 5 M HCl einstellen. Endvolumen auf 50 ml mit Reinst h2O einstellen.</li>
	<li>Master-Vorrat an divalenter Kationen-Chelationslösung (0,5 M EDTA ...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. 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E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

Diese Methode wird den Forschern weiterhin dabei helfen, die Rolle der Zellhülle in der bakteriellen Physiologie und Pathogenese zu verstehen. Nach den sequenziellen Ultrazentrifugationsschritten kann eine gereinigte Gesamt-, Innen- und OM-Fraktion erhalten werden. Diese Membranen können isoliert untersucht werden, um Hypothesen im Zusammenhang mit der Lokalisierung und Funktion des Membranproteins, dem Transport und dem Handel über das Periplasma und die Zusammensetzung der einzelnen Doppelschichten unter verschieden...

Gram-negative Bakterien produzieren zwei Membranen, die durch einen periplasmischen Raum und eine peptidoglykanische Zellwand1getrennt sind. Die innere Membran (IM) umschließt das Zytosol und ist eine symmetrische Bischicht von Phospholipiden. Peptidoglycan schützt vor Turgordruck und verleiht dem Bakterium eine Zellform und wird durch Lipoproteine2,3an der äußeren Membran (OM) befestigt. Das OM umgibt das Periplasma und ist überwiegend asymmetrisch. Die innere Packungsbeilage besteht aus Phospholipiden und die äußere Packungsbeilage besteht aus Glycolipiden, die als Lipooligosaccharide (LOS) oder Lipopolysaccharide (LPS)4,5bekannt sind. Die Lipidasymmetrie und die Biochemie der LOS/LPS-Moleküle in der äußeren Packungsbeilage verleihen der Zelloberfläche Barriereeigenschaften, die das Bakterium vor Gefahren in seiner Umgebung schützen6,7.
LPS-Moleküle bestehen aus drei Bestandteilen: dem Lipid A Disaccharolipid, dem Kernoligosaccharid und dem O-Polysaccharid oder O-Antigen. Lipid A ist ein multipliziertes acyatiertes Disaccharolipid. Kernoligosaccharide bestehen aus 10–15 Zuckern, die als grobes LPS oder R-LPS bekannt sind. Der Kern ist in den inneren Bereich unterteilt, der aus 2-Keto-3-Deoxy-D-Manno-Octulosesäure (kdo) und einem oder mehreren Heptoserückständen besteht, und einem äußeren Bereich, der im Allgemeinen aus Hexosen (Glucose oder Galaktose) und Häptosen oder Acetamidozuckern5besteht. Der äußere Kernbereich ist in seinen Komponenten und seiner Struktur variabler als der innere Kern. In Salmonella spp. wurde nur eine Kernstruktur beschrieben; In Escherichia coli gibt es jedoch fünf verschiedene Kernstrukturen (bezeichnet K-12, R1, R2, R3 und R4)8. E. coli K-12 DH5, die wir in diesem Verfahren verwenden, trägt eine Mutation, die in der Produktion R-LPS9führt. Den R-LPS-Molekülen fehlt die O-Antigen-Moiety und sie haben ein ähnliches Molekulargewicht wie LOS-Moleküle.
Die Zugabe von O-Antigen zu R-LPS verwandelt dieses Molekül in glattes LPS oder S-LPS. Die O-Antigene sind aus kurzen 3-4 Kohlenhydrat-Untereinheiten gebaut und bestehen aus mehreren Modalitäten mit unterschiedlichen Kettenlängen10. Einige LPS-produzierende Bakterien, wie Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), zeigen eine trimodale Verteilung von LPS-Molekülen auf ihrer Oberfläche10,11. Sehr lange Ketten-O-Antigene können über hundert Untereinheiten enthalten und mehr als hundert Kilodaltonen wiegen. Die O-Antigene verleihen dem Bakterium Oberflächeneigenschaften, die notwendig sind, um Antibiotika zu widerstehen, Raubüberfällen durch Bakteriophagen zu entgehen und Krankheiten zu verursachen.
Arten von Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria und andere erzeugen LOS Moleküle anstelle von LPS Moleküle auf ihrer Oberfläche12. LOS-Moleküle bestehen aus Lipid A und Kern-Oligosacchariden, aber das O-Antigen fehlt. Diese Arten von Gram-negativen Bakterien modifizieren ihre Kernoligosaccharide mit zusätzlichen Zuckern und Zuckerkombinationen, um die Oberflächeneigenschaften zu verändern12. Sowohl LOS- als auch LPS-produzierende Mikroben leiten die Phosphate auf Lipid A und Kernmoleküle mit kationischen Molekülen7ab. Zu diesen Zusätzen gehören Phosphoethanolamin, Galactosamin und Aminoarabinosesubstitutionen, die durch Neutralisierung der anionischen Oberflächenladung und damit zum Schutz vor kationischen antimikrobiellen Peptiden funktionieren. Gram-negative Bakterien verändern auch die Kern-Oligosaccharid-Struktur mit variablen nicht-stoichiometrischen Substitutionen von Zuckern oder zusätzlichen kdo-Molekülen und verändern die Anzahl der Acylketten auf Lipid-A-Disaccharolipiden7.
Die Fähigkeit, das IM aus dem OM von Gram-negativen Bakterien zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis der Rolle der Zellhülle bei der antimikrobiellen Resistenz und Krankheitspathogenese11,12. Ableitungen dieses Ansatzes wurden verwendet, um Mechanismen der Montage, Wartung und Umgestaltung des Proteins, Phospholipid, und Glykolipid Bestandteile für die OM abzuleiten.
Unser Labor führt routinemäßig bakterielle lipidomische Analysen durch, um die proteinvermittelte Lipidregulation und Lipidfunktion bei einer Vielzahl von Gram-negativen Arten zu untersuchen. Die im Protokoll verwendeten Volumina spiegeln die routinemäßige Anwendung dieses Verfahrens zur Analyse nicht radioaktiv markierter Phospholipide durch Dünnschichtchromatographie und Flüssigchromatographie Tandemmassenspektrometrie13,14wider.
Das Protokoll beginnt damit, eine gekühlte Suspension von Gram-negativen Bakterien einer hochosmolaren Lösung von Saccharose auszusetzen und Lysozym hinzuzufügen, um das OM von der zugrunde liegenden Peptidoglykanschicht zu trennen (Abbildung 1)12. EDTA wird dann hinzugefügt, um das Eindringen des Lysozym zu erleichtern, da die divalente Kationsequestrierung die lateralen elektrostatischen Überbrückungswechselwirkungen zwischen benachbarten LOS/LPS-Molekülen15stört. Das ursprüngliche Protokoll, von dem unser Protokoll angepasst wurde, erforderte die Bildung von Spheroplasten, einer gramnegativen Bakterienzellform, die aus einer Plasmamembran und Zytosol besteht, aber die Peptidyllykanschicht und ein OM fehlt. Es ist möglich, dass Spheroplaste nach dem angepassten Verfahren hergestellt werden; jedoch, die Technik nicht verlassen oder beabsichtigen auf ihre Bildung für den Erfolg. Stattdessen werden die lysozym-EDTA-behandelten Bakterien schnell durch Zentrifugation geerntet und in einer Saccharoselösung mit geringerer Konzentration vor der Drucklyse wieder suspendiert. Die OMs, die durch die Bildung von Spheroplasten freigesetzt worden sein könnten, sollten theoretisch aus den Überstand der behandelten Zellen geerntet werden können, aber dieser Ansatz ist hierin nicht detailliert. Letztlich werden die behandelten Zellen einer konventionellen Homogenisierung und Lyse unterzogen, was die Effizienz und Reproduzierbarkeit des Membrantrennverfahrens verbessert16.
Nach der Lyse werden die Gesamtmembranen durch Ultrazentrifugation gesammelt und auf einen diskontinuierlichen Saccharosedichtegradienten aufgetragen, um die IMs und OMs zu fraktionieren. Der klassische Ansatz verwendet einen kontinuierlicheren Gradienten, der aus mindestens fünf verschiedenen Saccharoselösungenbesteht 11,12. Der diskontinuierliche Gradient in unserem Protokoll besteht aus drei Saccharoselösungen und teilt die Doppelschichten in zwei unterschiedliche Brüche17. Die LOS- und LPS-Moleküle innerhalb der OMs von Gram-negativen Bakterien treiben die Hülle in eine obere braune IM-Fraktion mit niedriger Dichte und eine niedrigere weiße OM-Fraktion mit hoher Dichte(Abbildung 1 und Abbildung 2).
Acinetobacter baumannii sind wichtige multiresistente menschliche Krankheitserreger, die LOS-Moleküle in ihrem OM produzieren und eine Zellhülle aufrichten, die schwer zu trennen ist18,19. Jüngste Arbeiten deuten darauf hin, dass eine Ableitung des Protokolls, das wir hier präsentieren, verwendet werden kann, um die Doppelschichten dieser Organismen zu partitionieren20. Deshalb haben wir unser Protokoll auf A. baumannii 17978 getestet. Anfangs war das Verfahren unzureichend. Allerdings haben wir die Saccharosekonzentration der Lösung mit mittlerer Dichte modifiziert und die Trennung stark verbessert (Abbildung 2). Ein NADH-Dehydrogenase-Assay und ein LOS/LPS-Extraktions- und Detektionsverfahren wurden verwendet, um die Trennung für A. baumannii, Wildtyp S, zu bestätigen. Typhimurium und zwei O-Antigen-defizide enterobakterielle Genotypen; nämlich galE-mutant S. Typhimurium und ein Laborstamm, E. coli DH5 (Abbildung 3 und Abbildung 4).
Die Absicht dieser Arbeit ist es, einen schlanken Ansatz für die reproduzierende Isolierung der Membranen von Gram-negativen Bakterien zu liefern. Das Protokoll kann verwendet werden, um viele Arten von membranassoziierten Molekülen für diese Mikroben zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

Diese Methode arbeitet, indem die Hülle von Gram-negativen Bakterien in Total-, Innen- und Außenmembranfraktionen (OM) aufgeteilt wird, und schließt mit Assays, um die Reinheit der Bilayer zu bewerten. Das OM hat eine erhöhte Gesamtdichte im Vergleich zur inneren Membran, hauptsächlich aufgrund des Vorhandenseins von Lipooligosacchariden (LOS) und Lipopolysacchariden (LPS) innerhalb der äußeren Packungsbeilage. LOS- und LPS-Moleküle sind amphipathische Glykolipide, die eine ähnliche Struktur haben, die aus einem Lipid-A-Disaccharolipid und Einem Kern-Oligosaccharid-Substituenten besteht. Allerdings sind nur LPS-Moleküle mit einer dritten Untereinheit, die als O-Polysaccharid oder O-Antigen bekannt ist, verziert. Die Art und Menge der vorhandenen Glykolipide wirkt sich auf die OM-Dichte eines Organismus aus. Daher haben wir getestet, ob die Membranen von Bakterien mit unterschiedlichem Glykolipidgehalt mit unserer Technik ähnlich isoliert werden können. Für die LPS-produzierenden Organismen, Salmonella enterica serovar Typhimurium und Escherichia coli,waren die Membranen leicht zu isolieren und die LPS-O-Antigen-Moiety wirkte sich nicht auf die Bilayer-Partitionierung aus. Acinetobacter baumannii produziert LOS-Moleküle, die eine ähnliche Masse wie O-Antigen-mangelhafte LPS-Moleküle haben; Die Membranen dieser Mikroben konnten jedoch zunächst nicht getrennt werden. Wir argumentierten, dass das OM von A. baumannii weniger dicht war als das von Enterobacteriaceae, so dass der Saccharosegradient angepasst wurde und die Membranen isoliert wurden. Die Technik kann daher für den Einsatz mit anderen Organismen angepasst und modifiziert werden.

Diese Technik bietet ein wirksames Mittel, um die IMs und OMs für Gram-negative Bakterien zu isolieren. Ein Überblick über das gesamte Verfahren ist dargestellt (Abbildung 1). Im Allgemeinen stellt die Normalisierung der Kulturen auf eine OD600 von 0,6-0,8 in 1 L Medien oder die Ernte zwischen 6,0 und 8,0 x 1011 Bakterienzellen sicher, dass die entsprechende Menge an Membranmaterial für die nachfolgende Trennung gesammelt wird.
Beim Lysin...

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Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Die Untersuchung, wie Mikroben die chemische Zusammensetzung der einzelnen Doppelschichten regulieren, wird unser Wissen über Mechanismen der Antibiotika-Tötung, antimikrobiellen Resistenz und Krankheitspathogenese informieren. Diese Technik teilt die Zellhülle von gramnegativen Bakterien in zwei definierte Fraktionen ohne Waschmittel auf. Daher können die Lipide, Proteine und Zucker in einer Umgebung beurteilt werden, die halbnativ ist.Einige der Schritte sind zeitabhängig und erfordern Fokus und Koordination. Verwenden Sie zunächst ein oder zwei Beispiele. Wenn der Komfort steigt, können mehr Proben hinzugefügt werden.Es sollten nicht mehr als sechs Proben gleichzeitig behandelt werden. Dies ist ein mehrtägiges Verfahren und visuelle Checkpoints sind hilfreich, um Wirksamkeit und Fehler zu bewerten. Bevor Sie dies manchmal letzte Schritte ausführen.Die Bakterien aus gefrorenen Glyzerinbeständen auf frische Agarplatten aufbrechen. Sobald sich Kolonien entwickeln, lagern Sie die Platten bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine einzige Kolonie, um eine fünf Milliliter-Röhre mit Brühe Medien gefüllt zu impfen und kulturieren Sie die Bakterien wie gewünscht über Nacht.Die über Nacht bakterielle Kultur wieder in einen Liter der bevorzugten Brühemedien verdünnen und die Kolben inkubieren. Wenn die gewünschte optische Dichte erreicht ist, entfernen Sie die Kolben aus dem Inkubator und legen Sie sie auf Eis. Messen Sie die optische Dichte der Kultur mit 600 Nanometern und berechnen Sie das Kulturvolumen, das zwischen sechs und acht mal 10 bis zu den elften bakteriellen Koloniebildenden Einheiten entspricht.Fügen Sie dieses Kulturvolumen zu einem Zentrifugenrohr hinzu und stellen Sie sicher, dass die verbleibenden Kulturen auf Eis bleiben, bis sie verwendet werden. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation für 10 Minuten in einem festen Winkel, Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 7,000 bis 10, 000 mal G und vier Grad Celsius. Dekantieren Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen Sie ihn.Setzen Sie jedes Zellpellet in 12,5 Milliliter Puffer A.Add einen magnetischen Rührbalken zur Zellsuspension aus. Fügen Sie 180 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Lysozym zu jeder Zellresuspension hinzu. Nach dem Sammeln der Lysozym EDTA behandeltbakterien durch Zentrifugation, schnell den Protease-Inhibitor, Magnesiumchlorid und Nuklease zu den Bakterien hinzufügen und schnell die Zellen in Puffer B.Stir für zwei Minuten wieder suspendieren, halten die Suspensionen auf Eis.Als nächstes fügen Sie 12,5 Milliliter 1,5 Milliliter 1,5 Millimolar EDTA-Lösung zu jeder Zelle Wiedersuspension und weiter rühren auf Eis für weitere sieben Minuten. Dekantiert die Suspensionen in 15 Milliliter konische Röhren. Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 9.000 bis 11.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Entsorgen Sie die Überstoffe in einem Biorisiko-Abfallbehälter und behalten Sie die Pellets auf Eis. Fügen Sie jedem Zellpellet 25 Milliliter Puffer B hinzu. Dann 55 Mikroliter eines mollaren Magnesiumchlorids, einen Mikroliter Rnase/Dnase/Nuklease-Reagenz und einen Mikroliter Proteasehemmer-Cocktail hinzufügen.Die Pellets in der Mischung wieder aussetzen. Kräftig Pipette und Wirbel, bis die Lösungen homogen erscheinen. Bewahren Sie die Aufhängungen auf Eis auf.Gießen Sie die Probe in den Homogenisator-Probenzylinder und bringen Sie die Zelle auf 20.000 PSI. Um die Aerosolisierung von Krankheitserregern zu vermeiden, konditionieren Sie das Druckgerät in Puffer B und passen Sie die Druckpegel an, bevor Sie eine bakterielle Suspension hinzufügen. Engagieren Sie die Druckzelle und zeigen Sie vorsorglich 10 Milliliter Puffer B an.Sammeln Sie die Zelle lysieren in 50 Milliliter konische Röhren auf Eis, während auch die Proben auf Eis zu halten. Um eine vollständige Lyse zu erreichen, wiederholen Sie diesen Vorgang drei- bis fünfmal. Um das verbleibende, intakte Zellmaterial zu pellet, zentrifugieren Sie die lysierten Bakterienproben bei 6, 169 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Verteilen Sie die Überstandmittel, die nun die homogenisierten Membranen enthalten, in Polycarbonatflaschen zur Ultrazentrifugation. Ultrazentrifugieren Sie die Zelle lysiert bei 184, 500 mal G und vier Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Entsorgen Sie die Überräube und behalten Sie die Membranpellets auf Eis.Mit einem Glas, Dounce Homogenisator, setzen Sie die Membranpellets in einem Milliliter der isopycnischen Saccharose-Gradientenlösung mit geringer Dichte wieder auf. Dann verwenden Sie ein Glas, Pasteur Pipette, um die Probe homogenat auf eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu übertragen und legen Sie die Röhre auf Eis. Zur Vorbereitung des Saccharosegradienten halten Sie ein Polypropylen oder ein ultraklares Open-Top-Rohr in leicht geneigter Position.Fügen Sie langsam zwei Milliliter der Saccharoselösung mit höherer Dichte hinzu. Dann fügen Sie vier Milliliter der Saccharoselösung mit niedrigerer Dichte hinzu. Bei der Vorbereitung des Dichtegradienten fügen Sie die Saccharoselösung langsam hinzu, um das Mischen der Schichten zu vermeiden.Die Saccharose-Schichten sollten leicht sichtbar sein und allgemein definiert erscheinen. Als nächstes fügen Sie die gesamte Membranfraktion hinzu, die zuvor in einem Milliliter niedriger Dichte, Isopycnic-Saccharoselösung, resuspendiert wurde. Schließlich füllen Sie den Rest des Rohres, indem Sie etwa sechs Milliliter der niedrigen Dichte, Isopycnic Saccharose Gradient Lösung hinzufügen.Ultrazentrifugieren Sie die Proben mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 288, 000 mal G und vier Grad Celsius für 16 bis 23 Stunden. Schneiden Sie das Ende von einer P1000 Pipettenspitze etwa fünf Milliliter vom Punkt. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, verwenden Sie die Pipette, um die obere, braune Schicht aus dem Rohr zu entfernen.Übertragen Sie diese Schicht, die die innere Membranfraktion enthält, in eine Polycarbonatflasche zur Ultrazentrifugation. Lassen Sie etwa zwei Milliliter der Saccharoselösung über der Schnittstelle zwischen der 53%Saccharose und der 73%Saccharose, um sicherzustellen, dass die untere, weiße, äußere Membranfraktion die innere Membranfraktion nicht kreuzt. Wieder mit einer P1000 Pipettenspitze mit dem Ende entfernt, entfernen Sie die äußere Membranschicht und übertragen Sie sie in eine Polycarbonat-Flasche.Füllen Sie die restliche Lücke der Polycarbonatflasche mit isoliertem Membranspeicherpuffer und mischen Sie sie durch Inversion oder Rohrleitung. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf. Um die Membranen zu sammeln, ultrazentrieren Sie die Polycarbonatflaschen bei 184, 500 mal G und vier Grad Celsius für eine Stunde.Schließlich entsorgen Sie die Überstande und fügen Sie 500 bis 1.000 Mikroliter Speicherpuffer hinzu. Setzen Sie die Membranen durch Dounce Homogenisierung aus. Sammeln Sie die Proben in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhren.Totalmembranpellets wurden abgekratzt, Dounce homogenisiert und ultrazentrifugiert über Saccharosedichtegradienten, um die innere und äußere Membranezutrennung zu trennen. Ein Saccharosedichtegradient von 20%53%73% reichte aus, um einige Bakterienstämme zu partitionieren. Aber nicht für die Partitionierung von A.baumannii, die erfolgreich mit einem 20%45%73%Gradient partitioniert wurde.Um die Wirksamkeit der Trennung zu beurteilen, wurden Membranproben auf NADH-Dehydrogenase getestet, ein Enzym, das sich in der bakteriellen inneren Membran befindet. Eine Abnahme der optischen Dichte bei 340 Nanometern deutete auf das Vorhandensein des Enzyms hin. Die optische Dichte wurde für 50 Mikrogrammproben von inneren und äußeren Membranfraktionen vom Wildtyphimurium, E.coli K12 DH5a und galE mutant S.typhimurium gemessen.Eine höhere Konzentration von Protein wurde hinzugefügt, wenn die Reinheit der A.baumannii Membranfraktionen, weil ein erster Test mit 50 Mikrogramm darauf hindeutet, dass die relativen Konzentrationen von NADH-Dehydrogenase waren niedriger für A.baumannii als für die anderen Bakterienstämme. Zur Beurteilung der Kreuzkontamination der inneren Membranfraktionen mit äußeren Membranfraktionen wurden LPS und LOS extrahiert und visualisiert. Die Extrakte wurden auf ein Polyacrylamid-Gel geladen und mit Pro-Q Emerald 300 gebeizt.Acinetobacter baumannii ist eine top-Priorität, multi-medikamentös resistent, menschliche Krankheitserreger. Dieses Protokoll sollte Forschern helfen, die Rolle von Lipooligosacchariden, Phospholipiden und Lipoproteinen in den Resistenz- und Virulenzmechanismen dieses einzigartigen und wichtigen Erregers zu verstehen. Diese Methode ist ideal für die nachgeschaltete Analyse von Phospholipiden, Glycolipiden Kohlenhydraten, Proteinen und kleinen Molekülen, die typischerweise innerhalb der Dualmembranen gramnegativer Bakterien existieren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluoreszenz-Mikroskopie-Methoden zur Bestimmung der Lebensfähigkeit der Bakterien in Verbindung mit Säugerzellen

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In - vivo - Untersuchung von Antimicrobial Blau Lichttherapie für Multiresistente Acinetobacter baumannii Brennen Infektionen Biolumineszenz - Bildgebung

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila der äußeren Membran - Vesikeln: Isolierung und Analyse ihrer Pro-inflammatorische Potential auf Makrophagen

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anwendung konsistenter massageähnlicher Störungen an Mauskälbern und Überwachung der daraus resultierenden intramuskulären Druckänderungen

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Trennung von Rattenepidermis und Dermis mit Thermolysin zum Nachweis ortsspezifischer entzündlicher mRNA und Proteine

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Eine nicht-kodierende kleine RNA MicC trägt zur Virulenz von Proteinen der äußeren Membran in Salmonella enteritidis bei

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...