Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

העבודה הזאת ממומנת על ידי P20GM10344 ו R01AI139248 הוענק ז. ד. דלבריבלו.

1. ריאגנטים כללי ומדיה הכנה לכריית ממברנה
<ol><li>מדיה הצמיחה חיידקים: להכין ולחטא 1 L של התקשורת מרק ב ניקוי ביסודיות ובקבוקון 2 L.</li>
	<li>מאגר הבולם הכללי (1 מאגר טריס pH 7.5; 50 mL): התמוססות 6.05 g של בסיס Tris ב 30 מ ל של H2O. כוונן את ה-pH כדי 7.5 עם הHCl 5 מ '. כוונן את הנפח הסופי ל-50 ML עם H2O באולטרסאונד.</l...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

שיטה זו תמשיך לסייע לחוקרים להבין את התפקיד של מעטפת התא בפיזיולוגיה חיידקי ופתוגנזה. לאחר השלבים הרציפים של שלבים מטוהרים הכולל, הפנימי, ו-OM ניתן להשיג. ממברנות אלה יכולים להיות מותקפים בבידוד כדי לבדוק השערות הקשורות לוקליזציה של חלבון ממברנה ותפקוד, הובלה וסחר ברחבי הפריפלמטר, ואת הרכב...

חיידקים גראם שליליים לייצר שתי ממברנות כי הם מופרדים על ידי החלל הפריפלזמית והתא התאים פפטידוגליקן1. הממברנה הפנימית (IM) מנתיקים את הציטוזול והוא מהווה בינה סימטרית של פוספוליפידים. Peptidoglycan יכול להגן מפני לחץ טורגור ומספק את החיידק עם צורה תא, והוא מחובר הקרום החיצוני (אום) על ידי ליפופרוטאינים2,3. ה-OM מקיף את הפריפלמטר והוא ברובו אסימטרית. העלון הפנימי מורכב מפוספוליפידים והעלעל החיצוני כולל גליקולפידים המוכרים כ-lipooligosaccharides (LOS) או ליפופוליסכדים (lps)4,5. א-סימטריה השומנים וביוכימיה של מולקולות לוס/lps בעלון החיצוני מעניקים למאפייני המכשול את משטח התא המגן על החיידק מפני סכנות בסביבתו6,7.
מולקולות LPS מורכבות משלושה מרכיבים: ליפיד disaccharolipid, oligosaccharide הליבה, ואת O-רב-סוכר או O-אנטיגן. ליפיד A הוא disaccharolipid מכפלה. Core-oligosaccharides מורכב 10 – 15 סוכרים המכונה LPS מחוספס או R-LPS. הליבה מחולקת לתוך האזור הפנימי, המורכב מ-2-כתו-3-דיקסי-D-מאנאין-אובלי-אוטוסוניק (kdo) ואחד או יותר שאריות הפיז, ואזור חיצוני המורכב בדרך כלל מהקאוסס (גלוקוז או גלקטוז) והפטטוסים, או מרחמת סוכרים5. אזור הגרעין החיצוני משתנה יותר ברכיביו ובמבנה מאשר הליבה הפנימית. ב סלמונלה spp., רק מבנה אחד ליבה תוארה; עם זאת, ב Esהכלאיים coli יש חמישה מבני ליבה שונים (מיועד K-12, R1, R2, R3, ו-4)8. E. coli K-12 DH5α, שבו אנו משתמשים בהליך זה נושאת מוטציה שתוצאתה הייצור R-lps9. מולקולות R-LPS חסר הmoiety או אנטיגן ויש להם משקל מולקולרי דומה למולקולות LOS.
התוספת של O-אנטיגן ל-R-LPS הופך את המולקולה הזאת לחלקה LPS, או S-LPS. O-אנטיגנים בנויים קצר 3-4 שדות פחמימות משנה ומורכב של מספר מיטות עם אורכי שרשרת משתנים10. חיידקים מניבים מסוימים, כמו סלמונלה בידור בשיטת "היימוופיום" (S. Typhimurium), להציג התפלגות תלת מודאלית של מולקולות LPS על פני השטח שלהם10,11. מאוד ארוך שרשרת O-אנטיגנים יכולים להכיל מעל 100 יחידות משנה ושוקלים מעל 100 kilodaltons. O-אנטיגנים לספק תכונות פני השטח לחיידק כי הם נחוצים כדי להתנגד לאנטיביוטיקה, להתחמק מראש על ידי בקטריה, ולגרום למחלות.
מינים של קמפילובקטר, בורידילה, acineטבק, האמפילוס, NEISSERIA ואחרים לייצר מולקולות לוס במקום lps מולקולות על פני השטח שלהם12. מולקולות לוס מורכב ליפיד A ו oligosaccharides ליבה אבל חסר O-אנטיגן. סוגים אלה של חיידקים גראם שליליים לשנות את oligosaccharides הליבה שלהם עם סוכרים נוספים ושילובים של סוכרים כדי לשנות את השטח נכסים12. הן לוס ו-LPS הפקת חיידקים ללעג פוספטים על השומנים A ואת הליבה מולקולות עם moieties7ic. התוספות הללו כוללות פוספואנטואנאמין, גלטוסאמין והחלפות עמינח arabinose, אשר מתפקדים על ידי החלפת משטח הקרקע בנטרול ובכך הגנה מפני פפטידים מיקרוביאלית. חיידקים גראם שליליים גם לשנות את מבנה oligosaccharide הליבה עם משתנה שאינו stoichiometric החלפות של סוכרים, או מולקולות kdo נוספות, ולשנות את מספר שרשראות acyl על ליפיד-A disaccharolipids7.
היכולת לבודד IM מן האום של חיידקים גראם שליליים כבר אינסטרומנטלי להבנת התפקיד של מעטפת התא בהתנגדות מיקרוביאלית המחלה פתוגנזה11,12. בגישה זו נעשה שימוש כדי להסיק מנגנונים של הרכבה, תחזוקה, ושיפוץ של חלבון, פוספוליפיד, ו גליקולפיד המרכיבים עבור האום.
המעבדה שלנו באופן שגרתי מבצעת ניתוחים lipidomic חיידקיים ללמוד חלבון בתיווך השומנים רגולציה ותפקוד השומנים במגוון של מינים גראם שליליים. אמצעי האחסון הנמצאים בשימוש בפרוטוקול משקפים את השימוש השגרתי בהליך זה כדי לנתח פוספוליפידים בעלי שכבה שאינה רדיוגרפית באמצעות13כרומטוגרפיה של שכבות דקות וכרומטוגרפיה כרומטוגרפית מאסיביתמסוג 13,14.
הפרוטוקול מתחיל על ידי חשיפת השעיית מקורר של חיידקים גראם שליליים לפתרון אוסמוטי גבוה של סוכרוז והוספת ליזוזים לנתק את האום מן השכבה הבסיסית של פפטידוגליקן (איור 1)12. EDTA לאחר מכן מתווסף כדי להקל על החדירה של lysozyme, מאז קיבוע על הקטיון משבש את האינטראקציות לרוחב אלקטרוסטטי גישור בין מולקולות LOS/LPS סמוכים15. הפרוטוקול המקורי שממנו שלנו הותאם נדרש היווצרות של כדורית, הטופס החיידק גרם-שלילי המכיל קרום פלזמה ו ציטוסול, אבל חסר את השכבה הפטיפדואפשר ואום. ייתכן כי הספרופור מיוצרים על ידי השיטה המותאמת; עם זאת, הטכניקה אינה מסתמכת או מתכוונת על היווצרות שלהם להצלחה. במקום זאת, החיידק lysozyme-EDTA מטופלים הם שנקטפו במהירות על ידי צנטריפוגה ומושעה מחדש בפתרון סוכות של ריכוז פחותה לפני הליזה בלחץ. OMs כי יכול להיות שוחרר על ידי יצירת ספרונטקיים צריך בתאוריה להיות harvestable מן הסופרנטנים של התאים התייחסו, אבל גישה זו לא מפורטת במסמך זה. בסופו של דבר, התאים התייחסו חשופים לטיפול הומוגון קונבנציונאלי, המשפר את היעילות והתוכקות של הליך הפרדת הממברנה16.
לאחר הליזה, הקרומים הכולל נאספים על ידי מעבר הדרגתי ומוחלים על צפיפות מתמשכת בדחיסות האנגיופלסטיקה של ה-IMs ו-OMs. הגישה הקלאסית משתמשת בדרגה רציפה יותר, המורכבת מחמישהמתוך חמש פתרונותשונים של סוכות,12. מעבר הדרגתי בפרוטוקול שלנו מורכב משלושה פתרונות של סוכות ומחיצות הבילאיירס לשני שברים נפרדים17. LOS ו-LPS מולקולות בתוך OMs של חיידקים גראם שליליים כונן את המעטפה למחיצה לתוך חום גבוה בצפיפות נמוכה IM שבר ושבריר נמוכה לבן נמוך בצפיפות גבוהה (איור 1 איור 2).
הביטוח העצמי של acineטבק הם גורמי האדם העמידים בפני תרופות רב-תרופתיים המייצרים לוס מולקולות באום שלהם והקמת מעטפת תא קשה להפריד18,19. העבודה האחרונה עולה כי הנגזרת של הפרוטוקול שאנו מציגים כאן ניתן להשתמש כדי לחלק את הבילאיירס של אורגניזמים אלה20. לכן, בדקנו את הפרוטוקול שלנו . בבית הביטוח העצמי 17978 בתחילה, ההליך היה מספיק. עם זאת, אנו שינו את ריכוז הסוכות של פתרון הצפיפות האמצעית ושיפור משמעותי בהפרדה (איור 2). השימוש בשיטת NADH דהידרוגנאז ובתהליך החילוץ והגילוי של לוס-אנג'לס שימש לאישור הפרדה של בעלי הבית, מסוגפראי . Typhimurium ושני מסוג O-אנטיגן לקויה הגנותיים; כלומר, מוטציה של גייל. Typhimurium ומאמץ מעבדה, E. coli DH5α (איור 3 ואיור 4).
כוונת העבודה הזאת היא לספק גישה מפושטת לבידוד הקרומים של חיידקים גראם שליליים. הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ללמוד סוגים רבים של מולקולות הקשורות לקרום עבור חיידקים אלה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

שיטה זו פועלת על ידי חלוקת המעטפה של חיידקים גראם שליליים לתוך הכולל, פנימי, הקרום החיצוני (OM) שברים מסכם עם בחני להעריך את הטוהר של bilayers. לאום יש צפיפות כוללת מוגברת לעומת הקרום הפנימי, בעיקר בשל נוכחות של lipooligosaccharides (לוס) וליפופוליסכלידיס (LPS) בתוך העלון החיצוני. לוס ו LPS המולקולות הם אמפיפתיים גליקולפידים כי יש מבנה דומה, אשר מורכב השומנים-disaccharolipid ו-core-oligosaccharide מתמיר. עם זאת, רק מולקולות LPS מעוטרים עם יחידת משנה שלישית המכונה O-רב-סוכר, או O-אנטיגן. הסוג והכמות של גליקולפידים הנוכחיים ישפיעו על צפיפות ה-OM של האורגניזם. לכן, בדקנו אם הקרומים של חיידקים עם תוכן גליקולפיד מגוון יכול להיות מבודד באופן דומה באמצעות הטכניקה שלנו. עבור האורגניזמים המייצרים LPS, סלמונלה בידור מסוג Typhimurium ואסאנכיה קולי, הקרומים היו מבודדים בקלות ו lps O-אנטיגן moiety לא השפעה על החלוקה bilayer. הביטוח העצמי מייצרת מולקולות לוס אנג'לס, אשר יש מסה דומה למולקולות lps לקויה של O-אנטיגן; עם זאת, הקרומים של חיידקים אלה לא יכלו בתחילה להיות מופרדים. החלטנו שהאום של המוסד לביטוח העצמי היה פחות צפוף מזה של באנקובאכריים, ולכן הכוונן את מעבר הסוכות והקרומים היו מבודדים. הטכניקה יכולה אפוא להיות מותאם ושונה לשימוש עם אורגניזמים אחרים.

טכניקה זו מספקת אמצעים יעילים כדי לבודד את IMs ו-OMs עבור חיידקים גראם שליליים. קו מיתאר של ההליך כולו מומחש (איור 1). באופן כללי, נורמליזציה של תרבויות ל-OD600 של 0.6-0.8 ב 1 L של אמצעי תקשורת, או קציר בין 6.0 ו 8.0 x 1011 תאים חיידקיים יבטיחו כי הכמות המתאימה של חומר ממברנה נאסף עב...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

חיידקים גראם שליליים מייצרים שתי ממברנות בעלי הפרדה. הקרום החיצוני מחולק מהקרום הפנימי על ידי פריפלמטר ושכבת פטיפדוגליקן. היכולת לבודד את הbilayers כפול של חיידקים אלה היה קריטי להבנת הפיזיולוגיה שלהם פתוגנזה.

הפרדת מעטפת התא עבור חיידקים גראם שליליים לתוך שברים פנימיים וחיצוניים ממברנה עם כוונונים טכניים עבור בעלי הביטוח העצמי

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

לימוד כיצד מיקרואורגניזמים לווסת את ההרכב הכימי של bilayers בודדים יודיעו הידע שלנו של מנגנונים של הרג אנטיביוטי, עמידות מיקרוביאלית ופתוגנזה המחלה. טכניקה זו מחיצות מעטפת התא של חיידקים גרם שלילי לשני שברים מוגדרים ללא שימוש בחומר ניקוי. לכן, שומנים, חלבונים וסוכרים ניתן להעריך בסביבה כי הוא יליד למחצה.חלק מהצעדים תלויים בזמן ודורשים מיקוד וקואורדינציה. בתחילה, השתמש בדגמה אחת או שתיים. כאשר רמת הנוחות של אחד עולה, ניתן להוסיף דגימות נוספות.לא יותר משש דגימות צריך להיות מטופל בבת אחת. זהו הליך רב-ימים ונקודות ביקורת חזותיות מועילות להערכת היעילות והשגיאה. לפני ביצוע שלבים לפעמים סופיים.מפוספסים את החיידקים ממלאי גליצרול קפוא על צלחות אגר טריות. ברגע שהמושבות מתפתחות, מאחסנים את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס. השתמש במושבה אחת כדי לחסן צינור חמישה מיליליטר מלא במדיה מרק ותרבות החיידקים כרצונך בן לילה.בחזרה לדלל את התרבות החיידקית לילה לתוך ליטר אחד של התקשורת מרק המועדף להידגר flasks. כאשר הצפיפות האופטית הרצויה הושגה, להסיר את flasks מהחממה ולה מניח אותם על קרח. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר ולחשב את נפח התרבות המקבילה בין שש לשמונה פעמים 10 למושבה החיידקית האחת עשרה להרכיב יחידות.הוסף נפח זה של תרבות לצינור צנטריפוגה ולהבטיח כי התרבויות הנותרות להישאר על הקרח עד שהם ישמשו. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ina זווית קבועה, צנטריפוגה במהירות גבוהה ב 7, 000 עד 10, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. בזהירות decant העל-טבעי ולהשליך אותו.תוסיפו שוב כל גלולת תא ב-12.5 מיליליטר של חיץ A.Add פס ערבוב מגנטי לתליית התא. הוסף 180 מיקרוליטרים של 10 מיליגרם למיליליטר ליזוזיים לכל תא התדלדלות. לאחר איסוף חיידקים lysozyme EDTA מטופלים על ידי צנטריפוגה, להוסיף במהירות את מעכב פרוטאז, מגנזיום כלוריד ונוקלאז לחיידקים במהירות resuspend התאים במאגר B.Stir במשך שתי דקות, שמירה על המתלים על קרח.לאחר מכן, להוסיף 12.5 מיליליטר של 1.5 מילימולר פתרון EDTA לכל תא המתלה מחדש ולהמשיך לבחוש על קרח במשך שבע דקות נוספות. Decant המתלים לתוך צינורות חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה המתלים ב 9, 000 עד 11, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את העל-טבעיים לתוך מיכל פסולת ביולוגית ושמור את הכדורים על הקרח. הוסף 25 מיליליטר של מאגר B לכל גלולת תא. לאחר מכן, הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מגנזיום כלוריד אחד, מיקרוליטר אחד של רנז/dnase/nuclease reagent ומיקרוליטר אחד של קוקטייל מעכב פרוטאז.תן מחדש את כדורי בתערובת. פיפטה ומערבולת נמרצות עד שהפתרונות נראים הומוגניים. אחסן את המתלים על קרח.יוצקים את הדגימה לתוך גליל מדגם homogenizer ולהביא את התא ל 20, 000 PSI. כדי למנוע אירוסוליזציה של פתוגנים, תנאי המנגנון בלחץ במאגר B ולהתאים את רמות הלחץ לפני הוספת השעיה חיידקית. לעסוק בתא הלחץ ולהרומז 10 מיליליטר של חיץ B כאמצעי זהירות.לאסוף את התא lysate ב 50 צינורות חרוט מיליליטר על קרח תוך שמירה על הדגימות על קרח. כדי להשיג תזה מלאה, חזור על תהליך זה שלוש עד חמש פעמים. כדי גלולה הנותרים, שלם, חומר התא, צנטריפוגה דגימות חיידקים lysed ב 6, 169 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.הפץ את supernatants אשר מכילים כעת את הממברנות הומוגנית, לתוך בקבוקי פוליקרבונט עבור אולטרה מרכז. Ultracentrifuge התא lysates ב 184, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס לפחות שעה אחת. השליכו את העל-טבעיים ושמור את כדורי הממברנה על הקרח.באמצעות, Dounce homogenizer, resuspend כדורי קרום במיליליטר אחד של פתרון שיפוע סוכרוז isopycnic בצפיפות נמוכה. לאחר מכן, השתמש בזכוכית, פיפט פסטר להעביר את הומוגנטי מדגם לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולה מניחים את הצינור על קרח. כדי להכין את שיפוע סוכרוז, החזק פוליפרופילן או צינור פתוח ברור במיוחד במצב מוטה מעט.לאט להוסיף שני מיליליטר של פתרון סוכרוז בצפיפות גבוהה יותר. לאחר מכן להוסיף ארבעה מיליליטר של פתרון סוכרוז בצפיפות נמוכה יותר. בעת הכנת מעבר הצבע של הצפיפות, מוסיפים לאט את תסכול העצם כדי למנוע ערבוב של השכבות.שכבות סוכרוז צריך להיות גלוי מעט להופיע בדרך כלל מוגדר. לאחר מכן, להוסיף את שבר הממברנה הכולל אשר היה בעבר resuspended במיליליטר אחד של צפיפות נמוכה, פתרון סוכרוז איזופיקני. לבסוף, למלא את שאר הצינור על ידי הוספת כ שישה מיליליטר של צפיפות נמוכה, פתרון שיפוע סוכרוז isopycnic.Ultracentrifuge את הדגימות באמצעות רוטור דלי מתנדנד ב 288, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 16 עד 23 שעות. חותכים את הקצה את טיפ פיפטה P1000 על חמישה מיליליטר מהנקודה. לאחר השלמת הצנטריפוגה, השתמשו בפיפטה כדי להסיר את השכבה החומה העליונה מהצינור.מעבירים שכבה זו, המכילה את שבר הממברנה הפנימי, לבקבוק פוליקרבונט לתנופה אולטרה-מרכזית. השאירו כשני מיליליטר של פתרון סוכרוז מעל הממשק בין 53%sucrose ו 73% סוכרוז כדי להבטיח כי החלק התחתון, לבן, הממברנה החיצונית לא לחצות לזהם את שבר הממברנה הפנימית. שוב באמצעות קצה פיפטה P1000 עם הקצה הוסר, להסיר את שכבת הממברנה החיצונית ולהעביר אותו לבקבוק פוליקרבונט.ממלאים את החלל הנותר של בקבוק פוליקרבונט עם מאגר אחסון קרום מבודד ומערבבים על ידי היפוך או פיפטינג. שמור את הדגימות על קרח. כדי לאסוף את הממברנות, ultracentrifuge בקבוקי פוליקרבונט ב 184, 500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לבסוף, השלך את העל-טבעיים והוסף 500 עד 1,000 מיקרוליטרים של מאגר אחסון. תן מחדש את הממברנות על ידי הומוגניזציה Dounce. לאסוף את הדגימות בשני צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר.כדורי קרום סה"כ היו מגרדים, Dounce הומוגני ו ultracentrifuged מעל שיפוע צפיפות סוכרוז להפריד את הממברנות הפנימיות והחיוניות. שיפוע צפיפות סוכרוז של 20%53%73% הספיק לחלוקת זנים חיידקיים מסוימים. אך לא עבור חלוקה למחיצות של A.baumannii אשר מחולק בהצלחה באמצעות מעבר צבע של 20%45%73%..כדי להעריך את יעילות ההפרדה, נבדקו דגימות קרום עבור NADH dehydrogenase, אנזים הממוקם בממברנה הפנימית החיידקית. ירידה בצפיפות האופטית ב-340 ננומטר הצביעה על נוכחות האנזים. צפיפות אופטית נמדדה עבור 50 דגימות מיקרוגרם של שברי קרום פנימיים וחיצוניים מסוג פראי S.typhimurium, E.coli K12 DH5a ו- galE מוטציה S.typhimurium.ריכוז גבוה יותר של חלבון נוסף כאשר מסמן את הטוהר של שברי קרום A.baumannii כי בדיקה ראשונית באמצעות 50 מיקרוגרם הציע כי רמות יחסיות של NADH dehydrogenase היו נמוכים יותר עבור A.baumannii מאשר עבור זנים חיידקיים אחרים. כדי להעריך זיהום צולב של שברי הממברנה הפנימית עם שברי קרום חיצוני, LPS ו- LOS הוצאו והודמיו. התמציות הועמסו על ג'ל פוליאקרילמיד והוכתמו באזמרגד Pro-Q 300.Acinetobacter baumannii הוא בראש סדר העדיפויות, עמידים לתרופות מרובות, פתוגן אנושי. פרוטוקול זה אמור לסייע לחוקרים להבין את התפקידים של lipooligosaccharides, פוספוליפידים וליפופרוטאינים במנגנוני ההתנגדות והארסיות של פתוגן ייחודי וחשוב זה. שיטה זו אידיאלית לניתוח במורד הזרם של פוספוליפידים, פחמימות גליקולפידים, חלבונים ומולקולות קטנות הקיימות בדרך כלל בתוך הממברנות הכפולות של חיידקים גראם שליליים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

טיהור ויזואליזציה של Lipopolysaccharide של חיידקים גראם שליליים, על ידי הפקת מימית, פנול חם

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

שיטות מיקרוסקופית הקרינה לקביעת הכדאיות של חיידקים באיגוד עם תאי יונקים

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In vivo חקירת טיפול באור כחול אנטימיקרוביים multidrug עמידים baumannii Acinetobacter צרוב דלקות באמצעות הדמיה פליטת אור

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

יישום של רטבאליות העיסוי העקבי של העכבר וניטור השינויים הנובעים בלחץ שרירי

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

הפרדת אפידרמיס ראט ודרמיס עם תרמוליסין לזיהוי mRNA וחלבון דלקתיים ספציפיים לאתר

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

מודל הדמיה יילודים של אלח דם חיידקי גרם שלילי

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...