Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
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この作品は、P20GM10344とR01AI139248がZ.D.デールブルーに授与することによって資金提供されました。

1. 膜抽出のための一般的な試薬とメディアの調製
<ol><li>細菌増殖培地:完全に洗浄され、2 Lフラスコをオートクレーブにした1Lのスープ培地を調製し、殺菌します。</li>
	<li>一般リサスペンションバッファ(1 MトリスバッファpH 7.5;50 mL):H2 Oの30 mLでトリス2ベースの6.05 gを溶解し、5M HClでpHを7.5に調整し、超純粋なH2Oで50 mLに最終体積を調整します。</li>
	<li>二価カチオンキレート?...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

この方法は、細菌生理学および病因における細胞エンベロープの役割を理解する研究者を引き続き支援する。逐次超遠心分離工程に続いて、精製された総量、内面、およびOM画分が得られる。これらの膜は、膜タンパク質の局在化および機能、周囲の輸送および人身売買、および様々な環境条件下での個々の二重層の組成に関連する仮説を試験するために、単独でアッセイすることができる?...

グラム陰性菌は、周膜空間とペプチドグリカン細胞壁1によって分離された2つの膜を産生する。内膜(IM)は、細胞質ゾルを包み込み、リン脂質の対称的な二重層である。ペプチドグリカンは、ターゴール圧から保護し、細胞形状を有する細菌を提供し、そしてリポタンパク質22、33によって外膜(OM)に付着している。OM は周辺を取り囲み、主に非対称です。内側のリーフレットはリン脂質から成り、外葉はリプーリゴ糖(LOS)またはリポ多糖類(LPS)4,5として知られる糖脂質からなる。4,5外リーフレット中のLOS/LPS分子の脂質非対称性および生化学は、その環境における危険から細菌を保護する細胞表面に対するバリア性を与える66,7。
LPS分子は、脂質A二糖脂質、コアオリゴ糖、およびO-多糖類またはO抗原の3つの構成成分で構成されています。脂質Aは、増殖アシル化二糖分脂質である。コアオリゴ糖は、ラフLPSまたはR-LPSとして知られている10〜15の糖で構成されています。コアは、内領域に細分化され、2-ケト-3-デオキシ-D-マンノ-オクチュロソニック酸(kdo)および1つ以上のヘプトーゼ残基と、ヘキソス(グルコースまたはガラクトース)およびヘプトーゼ、またはアセタミド糖からなる外側領域から構成される。外側のコア領域は、内部コアよりもコンポーネントと構造の中で変数が多くなります。サルモネラ属のspp.では、1つのコア構造のみが記載されている。しかし、大腸菌には5つの異なるコア構造(K-12、R1、R2、R3、およびR4)があります。大腸菌K-12 DH5αは、この手順で使用し、生産R-LPS9をもたらす突然変異を運ぶ。R-LPS分子はO抗原部分を欠き、LOS分子と同様の分子量を有する。
R-LPSにO抗原を加えて、この分子は滑らかなLPS、またはS-LPSに変わります。O抗原は短い3-4炭水化物サブユニットから構築され、様々な鎖の長さを持つ複数のモダリティで構成されています10.いくつかの LPS 産生細菌,サルモネラ腸内細菌セロバー ティフィムリウム (S.チフィムリウム)は、その表面10,11にLPS分子の三様分布を11表示する。非常に長い鎖O-抗原は100個以上のサブユニットを含み、100キロダルトン以上の重量を量ることができる。O抗原は、抗生物質に抵抗し、バクテリオファージによる食前を回避し、病気を引き起こすのに必要な細菌に表面特性を提供する。
カンピロバクターの種は、ボルデテラ、アシネトバクター、ヘモフィルス、ネイセリア等が、その表面12にLPS分子の代わりにLOS分子を生成する。LOS分子は、脂質Aとコアオリゴ糖で構成されていますが、O抗原は欠いています。グラム陰性細菌のこれらのタイプは、表面特性を変更するために、追加の糖と糖の組み合わせでそれらのコアオリゴ糖を変更します12.LOSとLPS産生微生物の両方が、カチオン部分7で脂質Aとコア分子のリン酸塩を誘導体化する。これらの添加物には、ホスホエタノールアミン、ガラクトサミンおよびアミノアラビノース置換が含まれ、アニオン性表面電荷を中和し、それによってカチオン性抗菌ペプチドから保護することによって機能する。グラム陰性細菌はまた、糖の可変的な非ストキシオメトリック置換、または余分なkdo分子を用いてコアオリゴ糖構造を修飾し、脂質A二糖鎖にアシル鎖の数を変える7。
グラム陰性細菌のOMからIMを単離する能力は、抗菌性および疾患病態の病態の細胞エンベロープの役割を理解するのに役立った11,12。11,このアプローチの導出は、OMのタンパク質、リン脂質、および糖脂質成分の組み立て、維持、およびリモデリングのメカニズムを推測するために使用されてきました。
当社の研究室では、細菌性リピドミック解析を日常的に行い、様々なグラム陰性種におけるタンパク質媒介脂質調節と脂質機能を研究しています。プロトコルで使用される体積は、薄層クロマトグラフィーおよび液体クロマトグラフィータンデム質量分析13,14による非放射性標識リン脂質を分析するためのこの手順の日常的な使用を反映13している。
このプロトコルは、グラム陰性細菌の冷やされた懸濁液をスクロースの高い浸透膜溶液に曝露し、基底のペプチドグリカン層からOMを解離するためにリソザイムを加えることによって始まる(図1)12。EDTAは、次いでリゾチームの浸透を促進するために添加され、二価カチオンの隔離は隣接するLOS/LPS分子15間の横静電橋合動を破壊するので。私たちの適応された元のプロトコルは、球形膜とサイトゾルで構成されるグラム陰性細菌細胞形態である球体の形成を必要としましたが、ペプチドグリカン層とOMを欠いています。球状体は適合した方法で作り出される可能性があります。しかし、この技術は成功のために彼らの形成に依存したり、意図していません。代わりに、リソチームEDTA処理細菌は遠心分離によって急速に収穫され、加圧溶解の前にスクロース溶液中でより少ない濃度で再懸濁される。球形突体を形成して放出された可能性のあるOEMは、理論的には、処理された細胞の上清から収穫可能であるべきであるが、このアプローチは本明細書では詳述されていない。最終的に、処理された細胞は、従来の均質化および溶解に供され、膜分離手順16の効率および再現性を高める。
リシスの後、全膜は超遠心分離によって収集され、不連続なスクロース密度勾配に適用され、DMおよびOEMを分画する。古典的なアプローチは、少なくとも5つの異なるショ糖溶液11、12,12で構成される、より連続的なグラデーションを使用します。プロトコルの不連続勾配は、3つのスクロース溶液で構成され、二重層を2つの異なる分数17に分割します。グラム陰性細菌のOEM内のLOSおよびLPS分子は、エンベロープを駆動して上部茶色の低密度IM画分と下白高密度OM分率に分割する(図1および図2)。
アシネトバクターバウマンニーは、そのOMでLOS分子を産生し、18、19,19を分離することが困難である細胞エンベロープを建てる重要な多剤耐性ヒト病原体である。最近の研究は、我々がここで提示するプロトコルの派生は、これらの生物20の二重層を分割するために使用することができることを示唆している。したがって、我々はA.バウマンニ17978で私たちのプロトコルをテストしました。当初、手順は不十分でした。しかし、中密度溶液のスクロース濃度を大幅に改善し、分離を大幅に改善した(図2)。NADHデヒドロゲナーゼアッセイとLOS/LPS抽出および検出手順を使用して、野生型SであるA.バウマンニの分離を確認した。腸炎と2つのO抗原欠損腸菌遺伝子型;すなわち、galE-変異体S.腸炎と実験室株,大腸菌DH5α(図3および図4)。
この研究の目的は、グラム陰性細菌の膜を再現的に単離するための合理化されたアプローチを提供することです。プロトコルは、これらの微生物のための膜関連分子の多くのタイプを研究するために使用することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

この方法は、グラム陰性細菌のエンベロープを総、内膜、および外膜(OM)分数に分割することによって機能し、二重層の純度を評価するためのアッセイで終了する。OMは、内膜に比べて全体的な密度が増加しており、主に外縁葉内にリプーリゴ糖(LOS)およびリポ多糖類(LPS)が存在するためである。LOSとLPS分子は、脂質-A二糖脂質とコアオリゴ糖置換基からなる類似の構造を有する両生性糖脂質である。しかし、LPS分子だけがO-多糖、またはO抗原として知られている第三のサブユニットで修飾されています。存在する糖脂質の種類と量は、生物のOM密度に影響を与えます。そこで、多様な糖脂質含量を有する細菌の膜が、我々の技術を用いて同様に単離できるかどうかを試験した。LPS産生生物のサルモネラ・エンテロニカ・チフィムリウムおよび大腸菌の場合、膜は容易に単離され、LPS O抗原部分は二重層の分割に影響を与えなかった。アシネトバクターバウマンニは、O抗原欠損LPS分子と同様の質量を有するLOS分子を産生する。しかし、これらの微生物の膜は最初は分離できませんでした。我々は、A.バウマンニのOMは腸内細菌科のOMよりも密度が低いと推論したので、スクロース勾配を調整し、膜を単離した。したがって、この技術は、他の生物と一緒に使用するために適応および変更することができる。

この技術は、グラム陰性細菌のDMとOEMを単離する効果的な手段を提供します。手順全体の概要を示します (図 1)。一般に、培養物を1Lの培地中の0.6-0.8のOD600に正規化するか、または6.0〜8.0 x10 11細菌細胞の間で収穫することで、その後の分離のために適切な量の膜材料が収集されることを保証する。
細菌を拭き取り、リゼートを超遠回...

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Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

グラム陰性細菌は、2つの空間的に分離された膜を生成する。外膜は、内膜から、ペリプラズムとペプチドグリカン層によって分割される。これらの微生物の二重二重層を単離する能力は、その生理学と病因を理解するために重要であった。

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

微生物が個々の二重層の化学組成をどのように調節するかを研究することは、抗生物質の殺傷、抗菌性および疾患病因のメカニズムに関する我々の知識を知らせるだろう。この技術は、グラム陰性細菌の細胞エンベロープを洗剤を使用せずに2つの定義された分数に分割する。したがって、脂質、タンパク質および糖は、半ネイティブである環境で評価することができる。一部のステップは時間に依存し、フォーカスと調整が必要です。最初は、1 つまたは 2 つのサンプルを使用します。快適性レベルが上がると、より多くのサンプルを追加できます。一度に6つ以下のサンプルを扱う必要があります。これは複数日の手順であり、目視チェックポイントは、有効性とエラーを評価するのに役立ちます。これを実行する前に、時には最終ステップを実行します。冷凍グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌をストリーク。コロニーが発達したら、プレートを摂氏4度で保管します。単一コロニーを使用して、スープ培地で満たされた5ミリリットルのチューブを接種し、所望の一晩で細菌を培養する。バックは、好ましいブロス培地の1リットルに一晩細菌培養物を希釈し、フラスコをインキュベートします。望ましい光学密度が得られたら、インキュベーターからフラスコを取り出し、氷の上に置きます。600ナノメートルで培養液の光学密度を測定し、11番目の細菌コロニー形成ユニットの6〜8倍の間に相当する培養量を計算します。遠心分離管にこの量の培養液を加え、残りの培養物が使用されるまで氷の上にとどまるようにします。ペレット菌は、固定角度で10分間遠心分離し、高速遠心分離機を7,000~10,000倍Gと摂氏4度でペレット化する。上清を慎重にデカントし、廃棄します。各細胞ペレットを12.5ミリリットルのバッファーAに再懸濁し、磁気攪拌バーを細胞懸濁液に加えます。各細胞の再懸濁液に1ミリリットル10ミリグラムの180マイクロリットルを加えます。遠心分離によってリソチームEDTA処理細菌を採取した後、プロテアーゼ阻害剤、塩化マグネシウムおよびヌクレアーゼを細菌に素早く添加し、細胞を緩衝B.Stir中で2分間急速に再懸濁し、懸濁液を氷上に保ちます。次に、各細胞の再懸濁液に1.5ミリモルEDTA溶液12.5ミリリットルを加え、さらに7分間氷上で攪拌を続けます。15ミリリットル円錐形チューブに懸濁液をデカントします。サスペンションを摂氏4度で10分間9,000~11,000倍Gで遠心分離します。上清をバイオハザード廃棄物容器に捨て、氷の上にペレットを保持します。各細胞ペレットに25ミリリットルのバッファーBを加える。次に、塩化モルマグネシウム1個55マイクロリットル、rnase/dnase/ヌクレアーゼ試薬1マイクロリットル、プロテアーゼ阻害剤カクテル1マイクロリットルを加えます。混合物中のペレットを再中断します。溶液が均質に見えるまで、激しくピペットと渦。懸濁液を氷の上に保管してください。ホモジナイザーのサンプルシリンダーにサンプルを注ぎ、20,000 PSIにセルを持って来ます。病原体のエアロゾル化を避けるために、加圧装置をバッファーBに入れ、細菌懸濁液を加える前に圧力レベルを調整します。予防措置として、圧力セルとバッファーBの10ミリリットルをほのめかします。また、氷の上にサンプルを維持しながら、氷の上に50ミリリットルの円錐管に細胞ライセートを収集します。完全なリシスを達成するには、このプロセスを3〜5回繰り返します。残りのペレットに、そのまま、細胞材料、6、169回Gおよび4度摂氏10分間での分離菌サンプルを遠心分離する。現在、均質化された膜を含む上清をポリカーボネートボトルに分配して超遠心分離します。超遠心分離機細胞は、少なくとも1時間、184、500倍G、摂氏4度でライセートする。上清を捨て、氷の上に膜ペレットを保持します。ガラスを用いて、Dounceホモジナイザーは、低密度イソピクニックショ糖勾配溶液の1ミリリットルで膜ペレットを再懸濁する。次に、ガラスのパスツールピペットを使用して、サンプルホモジネートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、チューブを氷の上に置きます。スクロース勾配を調製するには、ポリプロピレンまたは超透明のオープントップチューブをわずかに傾けた位置に保持します。より高密度のスクロース溶液を2ミリリットルゆっくりと添加します。次に、低密度スクロース溶液の4ミリリットルを加える。密度勾配を調製する際には、スクロース溶液をゆっくりと添加して、層を混合しないようにします。スクロースレイヤーはわずかに表示され、一般的に定義されているように見える必要があります。次に、以前に低密度の1ミリリットル、イソピクチンスクロース溶液に再懸濁した全膜画分を加える。最後に、低密度の約6ミリリットルのイソピクニックショ糖勾配溶液を添加して、チューブの残りの部分を充填します。288、000倍G、摂氏4度のスイングバケットローターを16〜23時間使用してサンプルを超遠心分離します。P1000ピペットチップをポイントから約5ミリリットル切り落とします。遠心分離が完了したら、ピペットを使用してチューブから上の茶色の層を取り除きます。内膜分率を含むこの層を、超遠心分離のためのポリカーボネートボトルに移します。53%スクロースと73%スクロースの間の界面の上に約2ミリリットルのスクロース溶液を残して、下部、白、外膜分画が内膜分率を汚染しないようにします。再び、P1000ピペットチップを使用して、端を取り除き、外膜層を除去し、ポリカーボネートボトルに移します。ポリカーボネートボトルの残りの空隙を単離膜貯蔵バッファーで満たし、反転またはピペットによって混合します。氷の上にサンプルを保持します。膜を収集するために、ポリカーボネートボトルを184、500倍G、摂氏4度で1時間超遠心分離する。最後に、上清を捨て、500~1,000マイクロリットルのストレージバッファを追加します。Dounce均質化によって膜を再懸濁する。2ミリリットルのマイクロ遠心チューブでサンプルを収集します。全膜ペレットを掻き取り、Dounceホモジナイズ化し、スクロース密度勾配を超遠心化して内膜と外膜を分離した。20%53%73%のスクロース密度勾配は、いくつかの細菌株を区分するのに十分であった。しかし、20%45%73%の勾配を使用して正常に分割されたA.baumanniiを分割する必要はありません。分離の効率を評価するために、膜サンプルは、細菌内膜に位置する酵素であるNADHデヒドロゲナーゼについて試験した。340ナノメートルでの光学密度の低下は、酵素の存在を示した。光学密度は、野生型S.typhimurium、大腸菌K12 DH5aおよびgalE変異体S.typhimuriumからの内および外膜画分の50マイクログラムサンプルについて測定した。50マイクログラムを使用した最初のアッセイでは、NADHデヒドロゲナーゼの相対レベルが他の細菌株よりもA.baumannasiiの相対レベルが低いことが示唆されたため、A.baumannii膜画分の純度をアッセイする際に、より高い濃度のタンパク質が追加された。外膜画分を有する内膜画分の交差汚染を評価するために、LPSおよびLOSを抽出し、可視化した。抽出物をポリアクリルアミドゲルにロードし、Pro-Qエメラルド300で染色した。アシネトバクターバウマンニは、最優先の多剤耐性、ヒト病原体である。このプロトコルは、研究者がこのユニークで重要な病原体の抵抗および病原性メカニズムにおけるリプーリゴ糖、リン脂質およびリポタンパク質の役割を理解する上で役立つべきである。この方法は、グラム陰性細菌の二重膜内に典型的に存在するリン脂質、糖脂質炭水化物、タンパク質および小分子の下流分析に理想的である。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

ホット水 - フェノール抽出によるグラム陰性菌からの精製とリポ多糖の可視化

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

哺乳動物細胞に関連して細菌の生存を決定するための蛍光顕微鏡法

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF質量分析法を使用した血液培養ブロスからのグラム陰性菌の迅速な同定

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

生物発光イメージングを使用した多剤耐性アシネトバクターバウマニバーン感染症のための抗菌ブルーライトセラピーのインビボでの調査に

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

グラム陰性細菌敗血症の新生児画像モデル

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...