Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
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이 작품은 P20GM10344 및 R01AI139248에 의해 Z. D. Dalebroux에 수여되었다.

1. 멤브레인 추출을 위한 일반 시약 및 매체 준비
<ol><li>세균 성장 매체: 철저하게 세척하고 오토클레이브한 2 L 플라스크에서 국물 1L을 준비하고 살균합니다.</li>
	<li>일반 재서스펜션 버퍼(1M Tris Buffer pH 7.5; 50 mL): H2O. 5M HCl로 pH를 7.5로 조정하는 30mL에 6.05g의 트리스 베이스를 용해하여 초순수 H2O로 최종 부피를 50mL로 조정합니다.</li>
	<li>divalent 양이온 킬레이션 용액 (0.5 M EDTA pH 8; 10...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

이 방법은 세균성 생리학 및 병인에 있는 세포 봉투의 역할을 이해에 있는 연구원을 돕기 위하여 계속할 것입니다. 순차적 초원심분리 단계에 이어 정제된 총, 내부 및 OM 분획을 얻을 수 있다. 이러한 멤브레인은 세포 단백질 국소화 및 기능, 주변을 가로지르는 수송 및 인신매매, 다양한 환경 조건 하에서 개별 이중층의 조성과 관련된 가설을 시험하기 위해 단독으로 분석될 수 있다. LOS/LPS 및 OM ?...

그람 음성 박테리아는 주변 공간과 펩티도글리칸 세포벽1에의해 분리되는 2개의 막을 일으킵니다. 내부 막 (IM) 사이토솔을 감싸고 인지질의 대칭 이중층이다. 펩티도글리칸은 터고 압력으로부터 보호하고 세포 형상을 가진 박테리아를 제공하며, 지단백질2,,3에의해 외부 막(OM)에 부착된다. OM은 주변을 둘러싸고 있으며 주로 비대칭입니다. 내부 리플렛은 인지질로 구성되며 외부 리플리피드(LOS) 또는 리포폴리당당(LPS)4,,5로구성된다. 외부 리플렛에서 LOS/LPS 분자의 지질 비대칭 및 생화학은 그 환경의 위험으로부터 박테리아를 보호하는 세포 표면에 장벽특성을부여한다6,7.
LPS 분자는 3개의 성분으로 구성됩니다: 지질 A 이시카롤리피드, 코어 올리고당, 및 O-다당류 또는 O 항원. 지질 A는 곱한 비실화 된 디실로리피드입니다. 코어 올리고당은 거친 LPS 또는 R-LPS로 알려진 10-15 개의 설탕으로 구성됩니다. 코어는 2-케토-3-데옥시-D-만노 옥투로소닉산(kdo) 및 하나 이상의 헵토스 잔류물, 그리고 일반적으로 육각(포도당 또는 갈락토제) 및 헥토스, 또는 아세타미도 당분5로구성된 외부 영역으로 구성된 내부 영역으로 세분화된다. 외부 코어 영역은 내부 코어보다 구성 요소 및 구조에서 더 가변적입니다. 살모넬라 spp.,오직 하나의 코어 구조만 기술되었다; 그러나, 대장균에는 다섯 가지 핵심 구조 (K-12, R1, R2, R3 및 R4)가8있습니다. 이 절차에서 사용하는 대장균 K-12 DH5α는 생산 R-LPS9의결과를 초래하는 돌연변이를 전달합니다. R-LPS 분자는 O 항원 moiety 부족 하 고 LOS 분자와 비슷한 분자량을 가지고.
R-LPS에 O 항원추가는 이 분자를 매끄러운 LPS, 또는 S-LPS로 바꿉니다. O 항원 짧은 3-4 탄수화물 하위 단위에서 구축 하 고 다양 한 체인 길이 여러 양식으로 구성10. 살모넬라 테네리카 혈로바르 티피무리움(S.S 티피무리움) 표면10,,11에LPS 분자의 트리모달 분포를 표시한다. 매우 긴 사슬 O 항원은 100개 이상의 하위 유닛을 포함하고 100킬로달톤 이상의 무게를 견딜 수 있습니다. O 항원 항생제저항, 박테리오파지에 의한 포식 회피, 질병 유발에 필요한 박테리아에 표면 특성을 제공합니다.
캄필로박터, 보르데텔라, 아시네토박터, 헤모필루스, 네이세리아 등의 종은 표면에서 LPS 분자 대신 LOS 분자를 생성한다12. LOS 분자는 지질 A및 코어 올리고당으로 이루어져 있지만 O 항원이 부족하다. 이러한 유형의 그람 음성 박테리아는 표면 특성을 변경하기 위해 추가의 설탕 및 당조합으로 그들의 핵심 올리고당을수정한다 12. LOS 및 LPS 생산 미생물 모두 지질 A에 인산염을 생성하고 양이온성 모아티7을가진 코어 분자. 이러한 추가는 항이온성 표면 전하를 중화하고 양이온 항균 펩티드로부터 보호함으로써 기능하는 인산화탄올아민, 갈락토사민 및 아미노아라비노스 치환을 포함한다. 그람 음성 박테리아는 또한 당분, 또는 여분의 kdo 분자의 가변 비-stoichiometric 치환으로 코어 올리고당 구조를 수정하고, 지질-A 디사카롤리피드에 아실 사슬의 수를변경7.
그람 음성 박테리아의 OM으로부터 IM을 분리하는 능력은 항균성 내성 및 질병 병인에서 세포 봉투의 역할을 이해하는 데 중요한 역할을 하고있다11,,12. 이 접근법의 유도체는 OM에 대한 단백질, 인지질 및 글리콜리파이드 성분의 조립, 유지 보수 및 리모델링의 메커니즘을 추론하는 데 사용되어 왔다.
저희 실험실은 정기적으로 세균성 지질 분석을 수행하여 다양한 그람 음성 종에서 단백질 매개 지질 조절 및 지질 기능을 연구합니다. 프로토콜에 사용되는 부피는 얇은 층 크로마토그래피 및 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법에 의해 비 방사성 표지 된 인지질을 분석하기 위해이 절차의 일상적인 사용을반영13,,14.
프로토콜은 그람 음성 박테리아의 차가운 현탁액을 자당의 높은 삼투압 용액에 노출시키고 기본 펩티도글리칸 층으로부터 OM을 해리시키기 위해 리소자임(lysozyme)을 첨가함으로써 시작된다(도1)12. EDTA는 리소자이메의 침투를 용이하게 하기 위해 첨가되는데, 이는 인접한 LOS/LPS분자(15)사이의 측면 정전기 브리징 상호작용을 방해하기 때문에 양이온 격리가 중단되기 때문에. 우리의 적응 된 원래 프로토콜은 구형의 형성을 필요로, 플라즈마 막과 시토솔로 구성된 그람 음성 세균 세포 형태, 하지만 펩티도글리칸 층과 OM부족. 구형 세포가 적응 된 방법에 의해 생성 될 수 있습니다. 그러나, 기술은 성공을 위해 그들의 형성에 의존하거나 의도하지 않습니다. 대신, 리소자임-EDTA 처리 된 박테리아는 원심 분리에 의해 빠르게 수확되고 가압 용해 전에 낮은 농도의 자당 용액에서 다시 중단됩니다. 구형 세포를 형성하여 방출되었을 수 있는 OM은 이론적으로 처리된 세포의 상황체로부터 수확할 수 있어야 하지만, 이 접근법은 여기에 상세히 설명되어 있지 않다. 궁극적으로, 처리된 세포는 종래의 균질화 및 용해를 행하며, 이는 막 분리절차(16)의효율 및 재현성을 향상시킨다.
용해 후, 총 멤브레인은 초원심분리에 의해 수집되고 EM 및 OM을 분별하기 위해 불연속 자당 밀도 구배를 적용합니다. 고전적인 접근법은 적어도 5개의 상이한 자당 용액11,,12로구성된 보다 연속적인 그라데이션을 사용한다. 우리의 프로토콜의 불연속 그라데이션은 세 가지 자당 솔루션으로 구성되며 이중 층을 두 개의 별개의 분획17로분할합니다. 그람 음성 박테리아의 OM 내의 LOS 및 LPS 분자는 봉투를 상부 갈색 저밀도 IM 분획 및 하부 백색 고밀도 OM 분획으로 분할하도록 유도한다(도1 및 도 2).
아신토박터 바우만니는 그들의 OM에서 LOS 분자를 생성하고,18,19를분리하기 어려운 세포 봉투를 세우는 중요한 다제 내성 인간 병원체이다. 최근 연구는 우리가 여기에 존재하는 프로토콜의 유도가 이러한 유기체(20)의이중 층을 분할하는 데 사용될 수 있음을 시사한다. 따라서 A. baumannii 17978에서 프로토콜을 테스트했습니다. 처음에는 절차가 부적절했습니다. 그러나, 중간 밀도 용액의 자당 농도를 수정하고 분리를 크게 개선하였다(도2). NADH 탈수소 효소 분석 및 LOS/LPS 추출 및 검출 절차는 A. baumannii,야생형 S에 대한 분리를 확인하기 위해 사용되었다. 티피무륨 및 2개의 O-항원 결핍 장균 유전자형; 즉, galE-돌연변이 S. 티피무륨 및 실험실 균주, 대장균 DH5α(도3 및 도 4).
이 작업의 의도는 그람 음성 박테리아의 막을 재현 하 게 격리에 대 한 간소화 된 접근 방식을 제공 하는. 프로토콜은 이 세균을 위한 막 관련분자의 많은 모형을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

이 방법은 그람 음성 박테리아의 봉투를 총, 내부 및 외부 멤브레인 (OM) 분획으로 분할하여 작동하고 이중 층의 순도를 평가하기 위해 분석으로 결론을 내립니다. OM은 외부 리플렛 내 리풀리고당(LOS) 및 리포폴리당류(LPS)의 존재로 인해 내부 멤브레인에 비해 전체 밀도가 증가합니다. LOS 및 LPS 분자는 지질-A 디사카롤리피드 및 코어-올리고당 치환제으로 구성된 유사한 구조를 가지는 양과병성 글리콜리피피이다. 그러나, 오직 LPS 분자만이 O-다당류 또는 O 항원으로 알려진 제3 소단위로 장식된다. 존재하는 글리콜리파이드의 종류와 양은 유기체의 OM 밀도에 영향을 미칩니다. 따라서, 우리는 다양한 글리콜리파이드 함량을 가진 박테리아의 막이 우리의 기술을 사용하여 유사하게 분리될 수 있는지 시험했습니다. LPS 생산 유기체의 경우, 살모넬라 테네리카 혈청염 혈청염 및 대장균,막을 쉽게 분리하고 LPS O-항원 모이어티는 이중층 분할에 영향을 미치지 않았다. 아신토박터 바우마니는 LOS 분자를 생산, 이는 O 항원 결핍 LPS 분자와 유사한 질량을 갖는다; 그러나, 이 세균의 막은 처음에 분리될 수 없었습니다. 우리는 A. baumannii의 OM이 장내 세균과보다 밀도가 낮기 때문에 자당 그라데이션을 조정하고 막을 분리했다고 추론했습니다. 따라서 이 기술은 다른 유기체와 함께 사용하기 위해 조정 및 수정될 수 있습니다.

이 기술은 그람 음성 박테리아에 대한 EM 및 OM을 분리하는 효과적인 수단을 제공합니다. 전체 절차의 개요가 도시되어있습니다(그림 1). 일반적으로, 배지의 1L에서 0.6-0.8의 OD600으로 배양물의 정상화, 또는 6.0 및 8.0 x10 11 세균 세포 사이에서 수확하는 것은 후속 분리를 위해 적절한 양의 막 물질이 수집되도록 할 것이다.
박테리아를 용해?...

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Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.

아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

미생물이 개별 이중층의 화학 적 조성을 어떻게 조절하는지 연구하면 항생제 살인, 항균 내성 및 질병 병인의 메커니즘에 대한 지식을 알 릴 수 있습니다. 이 기술은 세제를 사용하지 않고 그램 음성 박테리아의 세포 봉투를 두 개의 정의된 분획으로 분할합니다. 따라서 지질, 단백질 및 설탕은 반 네이티브 환경에서 평가될 수 있습니다.일부 단계는 시간에 따라 다르며 초점과 조정이 필요합니다. 처음에는 하나 또는 두 개의 샘플을 사용합니다. 편안함 수준이 높아지면 더 많은 샘플을 추가할 수 있습니다.6개 이상의 샘플을 한 번에 처리해서는 안 됩니다. 이것은 다일 절차이며 시각적 검사점은 효능과 오류를 평가하는 데 도움이됩니다. 이 작업을 수행하기 전에 때로는 최종 단계를 수행합니다.냉동 글리세롤 주식에서 신선한 한천 접시에 박테리아를 줄입니다. 식민지가 발달하면 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 단일 콜로니를 사용하여 국물 매체로 채워진 5 밀리리터 튜브를 접종하고 하룻밤 동안 원하는 대로 박테리아를 배양하십시오.다시 바람직한 국물 매체의 한 리터로 하룻밤 세균 배양을 희석하고 플라스크를 배양. 원하는 광학 밀도가 달성되면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 600 나노미터에서 배양의 광학 밀도를 측정하고 11번째 세균식민지 형성 단위에 6~8배 10배 사이의 배양량을 계산한다.원심분리기 튜브에 이 문화양을 추가하고 나머지 문화권이 사용될 때까지 얼음 위에 머무르도록 합니다. 10분 동안 원심분리에 의해 박테리아를 펠트렛은 고정 각도, 고속 원심분리기 7, 000 ~ 10, 000배 G 및 섭씨 4도입니다. 신중하게 상체를 장식하고 폐기.버퍼 A.의 12.5 밀리리터에서 각 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 각 세포 재서스펜션에 밀리리터 리조지메 당 10 밀리그램의 180 마이크로리터를 추가합니다. 리소지메 EDTA 처리된 박테리아를 원심분리에 의한 후, 프로테아제 억제제, 염화 마그네슘 및 뉴클레아아제를 박테리아에 빠르게 추가하고 완충 B.Stir에서 세포를 2분 간 빠르게 재보페치하여 얼음에 현탁액을 유지합니다.다음으로, 각 셀재서스펜션에 1.5 밀리리터 1.5 밀리리터를 추가하고 7분 동안 얼음위를 계속 저어줍니다. 서스펜션을 15밀리리터 원뿔 튜브로 디산합니다. 서스펜션은 섭씨 9, 000에서 11, 000배 G로 섭씨 4도에서 10분 동안 정지를 분리합니다.수퍼나츠를 생물위험 폐기물 용기에 버리고 얼음 위에 펠릿을 보관하십시오. 각 셀 펠릿에 버퍼 B 25 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 1개의 어금니 마그네슘 염화물, rnase/dnase/nuclease 시약의 1개의 마이크로리터 및 프로테아제 억제제 칵테일의 1개의 마이크로리터의 55마이크로리터를 추가합니다.혼합물의 펠릿을 다시 중단합니다. 솔루션이 균일하게 나타날 때까지 적극적으로 파이펫과 소용돌이. 서스펜션을 얼음 위에 보관합니다.균질화 샘플 실린더에 샘플을 붓고 세포를 20, 000 PSI로 가져옵니다. 병원균의 에어로졸화를 피하기 위해, 가압 장치를 완충 B로 조건화하고 세균 현탁액을 추가하기 전에 압력 수준을 조절한다. 압력 셀을 참여시키고 예방 조치로 버퍼 B의 10 밀리리터를 암시하십시오.얼음에 50 밀리리터 원판 튜브에 세포 lysate를 수집하는 동시에 얼음에 샘플을 유지합니다. 완전한 리시스를 얻으려면 이 프로세스를 3~5회 반복합니다. 나머지, 그대로, 세포 물질, 1심 분리기는 10 분 동안 6, 169 시간 G 및 섭씨 4도에서 lysed 세균 샘플을 원심분리합니다.이제 균질화된 멤브레인을 포함하는 초나츠를 극심분리용 폴리카보네이트 병에 분배합니다. 초원심분리기 세포는 184, 500배 G 및 4°C에서 적어도 한 시간 동안 용해됩니다. 수퍼네이츠를 버리고 얼음 위에 멤브레인 펠릿을 유지합니다.유리를 사용하여, Dounce 균질화, 저밀도 이소피크닉 자당 그라데이션 용액의 1 밀리리터에서 멤브레인 펠릿을 재연. 그런 다음 유리, 파스퇴르 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 미세 센심 분리기 튜브로 균형 샘플을 전송하고 튜브를 얼음에 놓습니다. 자당 그라데이션을 준비하려면 약간 기울어진 위치에 폴리 프로필렌 또는 울트라 클리어 오픈 탑 튜브를 유지하십시오.고밀도 자당 용액의 2밀리리터를 천천히 추가합니다. 그런 다음 저밀도 자당 용액의 4 밀리리터를 추가합니다. 밀도 그라데이션을 준비할 때 자당 용액을 천천히 추가하여 레이어를 혼합하지 않도록 합니다.자당 층은 약간 표시되어야하며 일반적으로 정의 된 것처럼 보입니다. 다음으로, 이전에 저밀도, 이소피크닉 자당 용액의 1 밀리리터로 재중단된 총 멤브레인 분획을 추가합니다. 마지막으로, 저밀도, 이소피크닉 자당 그라데이션 용액의 약 6 밀리리터를 추가하여 튜브의 나머지 부분을 채웁니다.초원심분리기는 16~23시간 동안 288회, 000배, 섭씨 4도에서 스윙 버킷 로터를 사용하여 샘플을 채취한다. 지점에서 약 5 밀리리터에 대한 P1000 파이펫 팁을 끝을 잘라. 원심분리가 완료되면 파이펫을 사용하여 튜브에서 상부, 갈색 층을 제거합니다.내부 멤브레인 분획을 포함하는 이 층을 극심분리용 폴리카보네이트 병으로 옮긴다. 53%의 자당과 73% 자당 사이의 인터페이스 위에 자당 용액의 약 2밀리리터를 남겨두어 하부, 흰색, 외부 멤브레인 분획이 내부 멤브레인 분획을 오염시키지 않도록 한다. 끝이 제거된 P1000 파이펫 팁을 다시 사용하여 외부 멤브레인 층을 제거하고 폴리카보네이트 병으로 옮킵니다.폴리카보네이트 병의 나머지 공백을 격리된 멤브레인 저장 버퍼로 채우고 반전 이나 핍펫팅으로 섞는다. 얼음 에 샘플을 유지합니다. 멤브레인을 수집하기 위해 폴리 카보네이트 병을 184, 500 배 G 및 섭씨 4도에서 1 시간 동안 초원심 분리합니다.마지막으로, 슈퍼네틱을 버리고 500에서 1, 000 마이크로리터의 스토리지 버퍼를 추가합니다. Dounce 균질화에 의해 멤브레인을 다시 중단합니다. 2밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 샘플을 수집합니다.총 멤브레인 펠릿은 내부 및 외부 멤브레인을 분리하기 위해 자당 밀도 그라데이션위에 균질화되고 초원성 분리되었다. 자당 밀도 그라데이션20%53%73%는 세균균을 분할하기에 충분했다. 그러나 20%45%73%의 그라데이션을 사용하여 성공적으로 분할된 A.baumannii를 분할하는 것은 아닙니다.분리의 효율을 평가하기 위해, 멤브레인 샘플은 세균 내막에 위치한 효소인 NADH 탈수소효소를 테스트하였다. 340 나노미터에서 광학 밀도의 감소는 효소의 존재를 나타냈다. 광학 밀도는 야생 형 S.typhimurium, E.coli K12 DH5a 및 galE 돌연변이 S.typhimurium에서 내부 및 외부 멤브레인 분획의 50 마이크로그램 샘플을 측정하였다.50 마이크로그램을 사용한 초기 분석이 NADH 탈수소효소의 상대적 수준이 다른 세균균균에 비해 A.baumannii에 대해 더 낮았다는 것을 시사했기 때문에 A.baumannii 막 분획의 순도를 분석할 때 단백질의 더 높은 농도가 추가되었습니다. 외부 멤브레인 분획을 가진 내부 막 분획의 교차 오염을 평가하기 위해 LPS 및 LOS는 추출및 시각화되었습니다. 추출물은 폴리아크릴아미드 젤에 적재되어 Pro-Q 에메랄드 300으로 염색되었습니다.아신토박터 바우만이는 최우선 과제, 다중 약물 내성, 인간 병원균이다. 이 프로토콜은 이 독특하고 중요한 병원체의 저항 그리고 독성 기계장치에 있는 lipooligosaccharides, 인지질 및 지단백질의 역할을 이해하는 연구원을 원조해야 합니다. 이 방법은 일반적으로 그람 음성 박테리아의 이중 막 내에 존재하는 인지질, 글리콜리피드 탄수화물, 단백질 및 작은 분자의 다운스트림 분석에 이상적입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

연구

면역학 및 감염병학

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

다제 내성 항 감염 블루 라이트 치료의 생체 조사에서 아시네 토 박터 바우 마니는 생물 발광 영상을 사용하여 감염을 굽기

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

마우스 종아리에 일관된 마사지와 같은 섭동을 적용하고 근육 내 압력 변화를 모니터링

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

부위별 염증성 mRNA 및 단백질을 검출하기 위해 열립신과 쥐 표피 및 진피의 분리

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

암호화되지 않은 작은 RNA MicC는 살모넬라 엔테리티디스의 외막 단백질에서 독성에 기여합니다

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...