Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Dette arbeidet ble finansiert av P20GM10344 og R01AI139248 tildelt Z. D. Dalebroux.

1. Generelle reagenser og medieforberedelse for membranekstraksjon
<ol><li>Bakteriellvekstmedia: Forbered og steriliser 1 L buljongmedier i en grundig rengjort og autoklet 2 L kolbe.</li>
	<li>Generell resuspensjonsbuffer (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 ml): Oppløs 6,05 g Tris-sokkel i 30 ml H2O. Juster pH til 7,5 med 5 M HCl. Juster siste volum til 50 ml med ultraren H2O.</li>
	<li>Master lager av divalent kation chelation løsning (0,5 M EDTA pH 8; 100 ml): Tilsett 18,6 g dinatriumetylen tetraaceta...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

Denne metoden vil fortsette å hjelpe forskere i å forstå rollen til cellekonvolutten i bakteriell fysiologi og patogenese. Etter sekvensielle ultracentrifugeringstrinnene kan en renset total, indre og OM-fraksjon oppnås. Disse membranene kan assibles isolert for å teste hypoteser knyttet til membranproteinlokalisering og funksjon, transport og menneskehandel på tvers av periplasmen, og sammensetningen av de enkelte bilagene under ulike miljøforhold. Biologiske studier som utforsker involvering av individuelle OM-k...

Gram-negative bakterier produserer to membraner som er adskilt av et periplasmisk rom og en peptidoglykancellevegg1. Den indre membranen (IM) omslutter cytosolog er et symmetrisk bilayer av fosfolipider. Peptidoglykan beskytter mot turgor trykk og gir bakterien med en celleform, og er festet til den ytre membranen (OM) av lipoproteiner2,3. OM omgir periplasmaog er overveiende asymmetrisk. Det indre pakningsvedlegget består av fosfolipider, og det ytre pakningsvedlegget består av glykolipider kjent som lipooligosakkarider (LOS) eller lipopolysakkarider (LPS)4,5. Lipidasymmetrien og biokjemien til LOS/LPS-molekylene i det ytre pakningsvedlegget gir barriereegenskaper til celleoverflaten som beskytter bakterien mot farer i sitt miljø6,7.
LPS molekyler består av tre bestanddeler: lipid A disaccharolipid, kjernen oligosakkarid, og O-polysakkarid eller O-antigen. Lipid A er en multiplisert dissakolipid. Kjerne-oligosakkarider består av 10–15 sukkerarter kjent som grov LPS eller R-LPS. Kjernen er delt inn i den indre regionen, bestående av 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid (kdo) og en eller flere heptose rester, og en ytre region som består generelt av hexoses (glukose eller galaktose) og heptoser, eller acetamido sukker5. Den ytre kjerneregionen er mer variabel i sine komponenter og struktur enn den indre kjernen. I Salmonella spp., bare en kjernestruktur har blitt beskrevet; Men i Escherichia coli er det fem forskjellige kjernestrukturer (utpekt K-12, R1, R2, R3 og R4)8. E. coli K-12 DH5α, som vi bruker i denne prosedyren bærer en mutasjon som resulterer i produksjon R-LPS9. R-LPS-molekylene mangler O-antigen moiety og har en lignende molekylvekt som LOS-molekyler.
Tillegg av O-antigen til R-LPS gjør dette molekylet til glatt LPS, eller S-LPS. O-antigenene er bygget av korte 3-4 karbohydratunderenheter og består av flere modaliteter med varierende kjedelengder10. Noen LPS-produserende bakterier, som Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), vise en trimodal fordeling av LPS molekyler på overflaten10,11. Svært lange kjede O-antigens kan inneholde over hundre underenheter og veie over hundre kilodaltons. O-antigenene gir overflateegenskaper til bakterien som er nødvendige for å motstå antibiotika, unngå predasjon av bakteriofager og forårsake sykdom.
Arter av Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria og andre genererer LOS molekyler i stedet for LPS molekyler på overflaten12. LOS molekyler består av lipid A og kjerne oligosakkarider, men mangler O-antigenet. Disse typer Gram-negative bakterier modifiserer sine kjerneoligosakkarider med ekstra sukker og kombinasjoner av sukker for å endre overflateegenskaper12. Både LOS og LPS-produserende mikrober avledninger fosfatene på lipid A og kjernemolekyler med kationiske moieties7. Disse tilleggene inkluderer fosforetanolamin, galaktosamin og aminoarabinose substitusjoner, som fungerer ved å nøytralisere anioniske overflateladning og dermed beskytte mot kationiske antimikrobielle peptider. Gram-negative bakterier endrer også kjerneoligosakkaridstrukturen med variable ikke-stoichiometriske substitusjoner av sukker, eller ekstra kdomolekyler, og endre antall acylkjeder på lipid-A dissakkarilipider7.
Evnen til å isolere IM fra OM av Gram-negative bakterier har vært medvirkende for å forstå cellekonvoluttens rolle i antimikrobiell resistens og sykdomspatogenese11,12. Avledninger av denne tilnærmingen har blitt brukt til å utlede mekanismer for montering, vedlikehold og ombygging av protein, fosfolipid og glykolipid bestanddeler for OM.
Laboratoriet vårt utfører rutinemessig bakterielle lipidanalyse for å studere proteinmediert lipidregulering og lipidfunksjon i en rekke Gram-negative arter. Volumene som brukes i protokollen gjenspeiler rutinemessig bruk av denne prosedyren for å analysere ikke-radiomerkede fosfolipider ved tynt lag kromatografi og flytende kromatografi tandem massespektrometri13,14.
Protokollen begynner med å utsette en kjølt suspensjon av Gram-negative bakterier til en høy osmolar løsning av sukrose og legge lysozyme å dissosiere OM fra det underliggende peptidoglykanlaget (Figur 1)12. EDTA blir deretter lagt til for å lette penetrasjon av lysozym, siden divalent kation sekvestrasjon forstyrrer lateral elektrostatisk bro interaksjoner mellom tilstøtende LOS / LPS molekyler15. Den opprinnelige protokollen som vår har blitt tilpasset krevde dannelsen av spheroplasts, en Gram-negativ bakteriell celleform som består av en plasmamembran og cytosol, men mangler peptidoglykanlaget og en OM. Det er mulig at spheroplast produseres ved den tilpassede metoden; Teknikken er imidlertid ikke avhengig eller har til hensikt å bli dannet for å lykkes. I stedet høstes de lysozyme-EDTA-behandlede bakteriene raskt av sentrifugering og re-suspendert i en sukroseløsning av mindre konsentrasjon før trykklysis. OMene som kan ha blitt utgitt ved å danne spheroplast, bør i teorien høstes fra supernatants av de behandlede cellene, men denne tilnærmingen er ikke detaljert heri. Til syvende og sist blir de behandlede cellene utsatt for konvensjonell homogenisering og lyse, noe som forbedrer effektiviteten og reproduserbarheten til membranseparasjonsprosedyren16.
Etter lysis samles de totale membranene ved ultracentrifugering og brukes på en diskontinuitet sukrosetetthetsgradient for å fraksjonere IMs og OEM-er. Den klassiske tilnærmingen bruker en mer kontinuerlig gradient som består av minst fem forskjellige sukroseløsninger11,,12. Den diskontinuerlige gradienten i vår protokoll består av tre sukroseløsninger og partisjonerer bilagene i to forskjellige fraksjoner17. LOS- og LPS-molekylene i OEM-ene til Gram-negative bakterier driver konvolutten til å partisjonere seg i en øvre brun im-brøk med lav tetthet og en lavere hvit LAVtetthetom-fraksjon (figur 1 og figur 2).
Acinetobacter baumannii er viktige multidrug resistente menneskelige patogener som produserer LOS molekyler i deres OM og oppreist en celle konvolutt som er vanskelig å skille18,19. Nyere arbeid tyder på at en avledning av protokollen vi presenterer her kan brukes til å partisjonere bilayers av disse organismene20. Derfor testet vi vår protokoll på A. baumannii 17978. I utgangspunktet var prosedyren utilstrekkelig. Vi endret imidlertid sukrosekonsentrasjonen av mellomtetthetsløsningen og sterkt forbedret separasjon (figur 2). En NADH dehydrogenase analyse og en LOS / LPS ekstraksjon og deteksjon prosedyre ble brukt til å bekrefte separasjon for A. baumannii, wild-type S. Typhimurium og to O-antigen mangelfulle enterobakterielle genotyper; nemlig galE-mutant S. Typhimurium og en laboratoriestamme, E. coli DH5α (Figur 3 og figur 4).
Hensikten med dette arbeidet er å levere en strømlinjeformet tilnærming for reproduserbart isolere membranene til Gram-negative bakterier. Protokollen kan brukes til å studere mange typer membranassosierte molekyler for disse mikrobene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

Denne metoden fungerer ved å partisjonere konvolutten av Gram-negative bakterier i totalt, indre og ytre membran (OM) fraksjoner og konkluderer med analyser for å vurdere renheten til bilagene. OM har en økt total tetthet sammenlignet med den indre membranen, hovedsakelig på grunn av tilstedeværelsen av lipooligosakkarider (LOS) og lipopolysakkarider (LPS) i det ytre pakningsvedlegget. LOS og LPS molekyler er amhipatiske glykolipider som har en lignende struktur, som består av en lipid-A disaccharolipid og kjerne-oligosakkarid substituent. Imidlertid er bare LPS molekyler dekorert med en tredje underenhet kjent som O-polysakkarid, eller O-antigen. Typen og mengden glykolipider til stede vil påvirke organismens OM-tetthet. Derfor testet vi om membranene av bakterier med variert glykolipidinnhold kunne isoleres på samme måte ved hjelp av vår teknikk. For de LPS-produserende organismene, Salmonella enterica serovar Typhimurium og Escherichia coli, ble membranene lett isolert og LPS O-antigen moiety påvirket ikke bilayer partisjonering. Acinetobacter baumannii produserer LOS molekyler, som har en lignende masse til O-antigen mangelfullLPS molekyler; Imidlertid kunne membranene til disse mikrobene i utgangspunktet ikke skilles. Vi begrunnet at OM av A. baumannii var mindre tett enn enterobacteriaceae, så sukrosegradienten ble justert og membranene ble isolert. Teknikken kan derfor tilpasses og endres for bruk med andre organismer.

Denne teknikken gir et effektivt middel for å isolere im-er og OEM-er for Gram-negative bakterier. En omriss av hele prosedyren er illustrert (Figur 1). Generelt vil normalisering av kulturer til en OD600 på 0,6-0,8 i 1 L medier, eller høsting mellom 6,0 og 8,0 x 1011 bakterieceller sikre at riktig mengde membranmateriale samles inn for etterfølgende separasjon.
Ved å lysing bakterier og ultracentrifuging lysate, en klebrig brun total me...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negative bakterier produserer to romlig segregerte membraner. Den ytre membranen er partisjonert fra den indre membranen av en periplasme og et peptidoglykansk lag. Evnen til å isolere de to bilagene av disse mikrobene har vært avgjørende for å forstå deres fysiologi og patogenese.

Separasjon av cellekonvolutten for gram-negative bakterier i indre og ytre membranfraksjoner med tekniske justeringer for acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Studere hvordan mikrober regulerer den kjemiske sammensetningen av de enkelte bilayers vil informere vår kunnskap om mekanismer for antibiotikadrap, antimikrobiell resistens og sykdomspatogenese. Denne teknikken partisjonerer cellekonvolutten av gram-negative bakterier i to definerte fraksjoner uten å bruke vaskemiddel. Derfor kan lipider, proteiner og sukker vurderes i et miljø som er semi-innfødt.Noen av trinnene er tidsavhengige og krever fokus og koordinering. Bruk i utgangspunktet ett eller to prøver. Når komfortnivået øker, kan flere prøver legges til.Ikke mer enn seks prøver skal håndteres samtidig. Dette er en flerdagsprosedyre, og visuelle kontrollpunkter er nyttige for å vurdere effekt og feil. Før du utfører dette noen ganger siste trinn.Strek bakteriene fra frosne glyserollagre på friske agarplater. Når koloniene utvikler seg, lagre platene på fire grader Celsius. Bruk en enkelt koloni til å inokulere et fem milliliter rør fylt med kjøttkraftmedia og kultur bakteriene etter ønske over natten.Tilbake fortynne natten bakteriell kultur i en liter av de foretrukne kjøttkraft media og inkubere flasker. Når ønsket optisk tetthet er oppnådd, fjern kolben fra inkubatoren og legg dem på is. Mål den optiske tettheten av kulturen på 600 nanometer og beregn volumet av kultur som tilsvarer mellom seks og åtte ganger 10 til ellevte bakterielle kolonidanneenheter.Legg dette volumet av kultur til et sentrifugerør og sørg for at de gjenværende kulturene forblir på is til de skal brukes. Pellet bakteriene ved sentrifugering i 10 minutter i en fast vinkel, høyhastighets sentrifuge på 7, 000 til 10, 000 ganger G og fire grader Celsius. Dekanter forsiktig overnatanten og kast den.Resuspend hver celle pellet i 12,5 milliliter buffer A.Legg til en magnetisk rørestang til cellefjæringen. Tilsett 180 mikroliter på 10 milligram per milliliter lysozym til hver celleuspensjon. Etter å ha samlet lysozymet EDTA behandlet bakterier ved sentrifugering, legg raskt proteasehemmeren, magnesiumklorid og kjerner til bakteriene og raskt gjenbruke cellene i buffer B.Rør i to minutter, holde suspensjonene på is.Deretter legger du til 12,5 milliliter edta-oppløsning på 1,5 millimolar til hver celleretur og fortsetter å røre på isen i ytterligere syv minutter. Dekanter suspensjonene i 15 milliliter koniske rør. Sentrifuger suspensjonene ved 9.000 til 11.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius.Kast supernativa i en biohazard avfallsbeholder og behold pellets på is. Legg til 25 milliliter buffer B i hver cellepellet. Deretter legger du til 55 mikroliter av en molar magnesiumklorid, en mikroliter rnase / dnase / nuklease reagens og en mikroliter proteasehemmercocktail.Resuspend pellets i blandingen. Kraftig pipette og virvel til løsningene vises homogene. Oppbevar suspensjonene på isen.Hell prøven i homogenisatorprøvesylinderen og bring cellen til 20.000 PSI. For å unngå aerosolisering av patogener, tilstand det trykksatt apparatet i buffer B og justere trykknivåene før du legger bakteriell suspensjon. Engasjer trykkcellen og hent 10 milliliter buffer B som en forholdsregel.Samle cellen lysate i 50 milliliter koniske rør på is samtidig som prøvene på is. For å oppnå fullstendig lysis, gjenta denne prosessen tre til fem ganger. For å pellet de resterende, intakte, cellemateriale, sentrifugere lysed bakterielle prøver på 6, 169 ganger G og fire grader Celsius i 10 minutter.Fordel supernativa som nå inneholder homogeniserte membraner, i polykarbonatflasker for ultracentrifugation. Ultracentrifuge cellen lysates på 184, 500 ganger G og fire grader Celsius i minst en time. Kast supernativa og behold membranpellets på is.Ved hjelp av et glass, Dounce homogenizer, resuspend membranen pellets i en milliliter av lav tetthet isopyklin sukrose gradient løsning. Deretter bruker du et glass, Pasteur pipette for å overføre prøven homogenat til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og plassere røret på is. For å forberede sukrosegradienten, hold et polypropylen eller Ultra-klart Open-Top-rør i en litt vippet posisjon.Tilsett sakte to milliliter av den høyere tetthetssukroseløsningen. Deretter legger du til fire milliliter av den lavere tetthetssukroseløsningen. Når du forbereder tetthetsgradienten, legg til sukroseløsningen sakte for å unngå å blande lagene.Sukroselagene skal være litt synlige og vises generelt definert. Deretter legger du til den totale membranfraksjonen som tidligere ble brukt på en milliliter lav tetthet, isopyklinisk sukroseløsning. Til slutt fyller du resten av røret ved å legge til omtrent seks milliliter av lav tetthet, isopyklinisk sukrosegradientløsning.Ultracentrifuge prøvene ved hjelp av en svingende bøtte rotor på 288, 000 ganger G og fire grader Celsius i 16 til 23 timer. Klipp enden av en P1000 pipettespiss omtrent fem milliliter fra punktet. Etter at sentrifugeringen er fullført, bruk pipetten til å fjerne det øvre, brune laget fra røret.Overfør dette laget, som inneholder den indre membranfraksjonen, til en polykarbonatflaske for ultracentrifugation. La omtrent to milliliter av sukroseløsningen over grensesnittet mellom 53% sukrose og 73% sukrose for å sikre at den nedre, hvite, ytre membranfraksjonen ikke krysser forurenser den indre membranfraksjonen. Igjen ved hjelp av en P1000 pipettespiss med enden fjernet, fjern det ytre membranlaget og overfør det til en polykarbonatflaske.Fyll det gjenværende tomrommet av polykarbonatflaske med isolert membranlagringsbuffer og bland ved inversjon eller pippetting. Behold prøvene på is. For å samle membranene, ultracentrifuge polykarbonatflaskene ved 184, 500 ganger G og fire grader Celsius i en time.Til slutt kast supernativa og tilsett 500 til 1000 mikroliter lagringsbuffer. Resuspend membranene ved Dounce homogenisering. Samle prøvene i to milliliter mikrocentrifuge rør.Totale membranpellets ble skrapt, Dounce homogenisert og ultracentrifuged over sukrose tetthet gradienter for å skille de indre og ytre membraner. En sukrose tetthet gradient på 20%53%73%var tilstrekkelig for partisjonering noen bakterielle stammer. Men ikke for partisjonering A.baumannii som ble partisjonert ved hjelp av en 20%45%73%gradient.For å vurdere effektiviteten av separasjonen ble membranprøver testet for NADH dehydrogenase, et enzym som ligger i bakteriens indre membran. En reduksjon i optisk tetthet ved 340 nanometer indikerte tilstedeværelsen av enzymet. Optisk tetthet ble målt for 50 mikrogramprøver av indre og ytre membranfraksjoner fra vill type S.typhimurium, E.coli K12 DH5a og galE mutant S.typhimurium.En høyere konsentrasjon av protein ble tilsatt ved analyse av renheten av A.baumannii membranfraksjoner fordi en innledende analyse ved hjelp av 50 mikrogram antydet at de relative nivåene av NADH dehydrogenase var lavere for A.baumannii enn for de andre bakteriestammene. For å vurdere krysskontaminering av de indre membranfraksjonene med ytre membranfraksjoner ble LPS og LOS ekstrahert og visualisert. Ekstraktene ble lastet på en polyakrylamidgel og farget med Pro-Q Emerald 300.Acinetobacter baumannii er en topp prioritet, multi resistent, menneskelig patogen. Denne protokollen bør hjelpe forskere i å forstå rollene til lipooligosakkarider, fosfolipider og lipoproteiner i motstands- og virulensmekanismene til dette unike og viktige patogenet. Denne metoden er ideell for nedstrøms analyse av fosfolipider, glykolipder karbohydrater, proteiner og små molekyler som vanligvis eksisterer i de doble membranene av gram-negative bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Rensing og Visualisering av lipopolysakkarid fra Gram-negative bakterier ved Hot Vandig-fenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Medgjørlig pattedyrcelle Infeksjoner med protozoan-primet Bakterier

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Fluorescensmikroskopi metoder for å bestemme levedyktigheten til bakterier i foreningen med pattedyrceller

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In vivo undersøkelse av antimikrobiell blå lysterapi for multidrug-resistent Acinetobacter baumannii Brenninfeksjoner ved bruk av bioluminescens-bildebehandling

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila ytre membran Blemmer: Isolering og analyse av deres Pro-inflammatorisk potensialet på Makrofager

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Anvendelse av konsekvent massasje-lignende forstyrrelser på mus kalver og overvåking av resulterende intramuskulær trykk endringer

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Separasjon av rotte epidermis og dermis med termolysin for å oppdage stedsspesifikk inflammatorisk mRNA og protein

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

En neonatal bildemodell av gram-negativ bakteriell sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

En ikke-kodende liten RNA-micC bidrar til virulens i ytre membranproteiner i Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...