Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Эта работа была профинансирована P20GM10344 и R01AI139248, присужденными З.Д. Далебру.

1. Общие реагенты и медиаподготовка для извлечения мембраны
<ol><li>Бактериальный рост средств массовой информации: Подготовка и стерилизовать 1 л бульона средств массовой информации в тщательно очищены и autoclaved 2 L колбы.</li>
	<li>Общий буфер повторной подвески (1 M Tris Buffer pH 7.5; 50 мл): Растворите 6...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

Этот метод будет продолжать помогать исследователям в понимании роли клеточной оболочки в бактериальной физиологии и патогенеза. После последовательных ультрацентрриффирования шаги очищенной общей, внутренней и ОМ фракции могут быть получены. Эти мембраны могут быть анализированы ?...

Грамотрицательные бактерии производят две мембраны, которые разделены периплазмическим пространством и пептидогликанской клеточной стенкой1. Внутренняя мембрана (IM) заключает цитозол и является симметричным двухслойным фосфолипидами. Пептидогликан защищает от тургорского давления и обеспечивает бактерию клеточной формой, а также крепится к внешней мембране (ОМ) липопротеинами2,,3. ОМ окружает периплазм и преимущественно асимметрично. Внутренняя листовка состоит из фосфолипидов и внешняя листовка состоит из гликолипидов, известных как липулигосахариды (LOS) или липополисахариды (LPS)4,5. Липидная асимметрия и биохимия молекул LOS/LPS во внешней листовке придают барьерные свойства поверхности клетки, которые защищают бактерию от опасностей в ее окружающей среде6,,7.
Молекулы LPS состоят из трех составляющих: липидный дизакчаролип, ядро олигосахарида и О-полисахарид или O-антиген. Липид А является умножить acylated disaccharolipid. Core-oligosaccharides состоят из 10-15 сахаров, известных как грубые LPS или R-LPS. Ядро подразделяется на внутреннюю область, состоящую из 2-кето-3-дезокси-D-манно-восьмилозоновой кислоты (кдо) и одного или нескольких остатков гептоза, а также внешней области, которая состоит, как правило, из гексосов (глюкоза или галактоза) и гептозов, или ацетамамидо сахара5. Область внешнего ядра более изменчива по своим компонентам и структуре, чем внутреннее ядро. В Salmonella spp., только одна основная структура была описана; однако, в Escherichia coli есть пять различных основных структур (обозначенных K-12, R1, R2, R3 и R4)8. E. coli K-12 DH5, который мы используем в этой процедуре несет мутации, что приводит к производству R-LPS9. Молекулы R-LPS не имеют O-антигена moiety и имеют аналогичный молекулярный вес молекул LOS.
Добавление O-антигена к R-LPS превращает эту молекулу в гладкую LPS, или S-LPS. O-антигены построены из коротких 3-4 углеводных субъединиц и состоят из нескольких методов с различной длиной цепи10. Некоторые LPS-производящих бактерий, как Salmonella enterica серовар Typhimurium (S. Typhimurium), дисплей тримодального распределения молекул LPS на их поверхности10,11. Очень длинная цепь O-антигенов может содержать более ста субъединиц и весить более ста килодальтонов. O-антигены обеспечивают поверхностные свойства бактерии, которые необходимы, чтобы противостоять антибиотикам, уклоняться от хипризавания бактериофагами, и вызывать болезни.
Виды Campylobacter, Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria и другие генерируют молекулы ЛОС вместо молекул LPS на их поверхности12. Молекулы LOS состоят из липидов А и ядра олигосахаридов, но не хватает O-антигена. Эти типы грамотрицательных бактерий модифицировать их основные олигосахариды с дополнительными сахарами и комбинациями сахаров, чтобы изменить свойства поверхности12. Как LOS, так и LPS-производящие микробы произвностируют фосфаты на липидных и основных молекулах с катионными муатиами7. Эти дополнения включают фосфоэтаноламин, галактозамин и аминоарабиноззамены, которые функционируют путем нейтрализации анионического поверхностного заряда и тем самым защиты от катионных антимикробных пептидов. Грамотрицательные бактерии также изменить структуру ядра олигосахарида с переменной не-stoichiometric замены сахара, или дополнительные молекулы кдо, и изменить количество ацил цепи на липид-A disaccharolipids7.
Способность изолировать чат от ОМ Грам-отрицательных бактерий сыграла важную роль для понимания роли клеточной оболочки в устойчивости к противомикробным препаратам и патогенезаболезни 11,12. Выводы этого подхода были использованы для вывода механизмов сборки, обслуживания и реконструкции белка, фосфолипида и гликолипидов для ОМ.
Наша лаборатория регулярно выполняет бактериальные липидомные анализы для изучения белково-опосредованной липидной регуляции и липидной функции в различных грамотрицательных видов. Объемы, используемые в протоколе, отражают рутинное использование этой процедуры для анализа нерадиомаркированных фосфолипидов тонким слоем хроматографии и жидкой хроматографии тандемной масс-спектрометрии13,14.
Протокол начинается с разоблачения охлажденной подвески грамотрицательных бактерий к высокому осмолялярному раствору сахарозы и добавлению лизозима, чтобы отделить ОМ от основного пептидогликанского слоя (Рисунок 1)12. EDTA затем добавляется для облегчения проникновения лизозима, так как распущенный секвестр катионов нарушает боковое электростатическое взаимодействие между соседними молекулами LOS/LPS15. Первоначальный протокол, из которого был адаптирован наш, требовал образования сферопластов, грамотрицательных бактериальных клеток, которые состоят из плазменной мембраны и цитозола, но не имеют пептидогликанского слоя и ОМ. Не исключено, что сферопласты производятся адаптированным методом; однако, техника не полагается или предназначаю на их образовании для успеха. Вместо этого, лизозим-EDTA обработанные бактерии быстро собирают центрифугирование и повторно подвешены в сахарозный раствор меньшей концентрации перед давлением лизиса. OMs, которые могли бы быть освобождены путем формирования сферопластов, теоретически должны быть собраны из супернатантов обработанных клеток, но этот подход не подробно описан в настоящем. В конечном счете, обработанные клетки подвергаются обычной гомогенизации и лизис, что повышает эффективность и воспроизводимость процедуры разделения мембраны16.
После лизиса, общая мембраны собираются ультрацентрифугации и применяется к прерывистой сахарозы градиент плотности для фракции IM и Омс. Классический подход использует более непрерывный градиент, который состоит по крайней мере из пяти различных решений сахарозы11,12. Прерывистый градиент в нашем протоколе состоит из трех сахарозных растворов и разделов двухслойных на две отдельные фракции17. Молекулы LOS и LPS в пределах OMs Грам-отрицательных бактерий диск конверт для раздела в верхней коричневой низкой плотности IM фракции и нижней белой высокой плотности OM фракции(Рисунок 1 и рисунок 2).
Acinetobacter baumannii являются важными мультирезистентными человеческими патогенами, которые производят молекулы LOS в их ОМ и возводят клеточную оболочку, которую трудно отделить18,,19. Последние работы показывают, что производные протокола мы представляем здесь могут быть использованы для раздела двухслойных этих организмов20. Поэтому мы протестировали наш протокол на A. baumannii 17978. Первоначально эта процедура была неадекватной. Тем не менее, мы изменили концентрацию сахарозы раствора средней плотности и значительно улучшили разделение(рисунок 2). Тест NADH дегидрогеназы и LOS / LPS добычи и обнаружения процедура была использована для подтверждения разделения для A. baumannii, дикий тип S. Тифимурий и два O-антигена дефицитных энтеробактериальных генотипов; а именно, galE-мутант S. Тифимурий и лабораторный штамм, E. coli DH5 "(рисунок 3 и рисунок 4).
Цель этой работы заключается в обеспечении рационализированный подход для воспроизводимой изоляции мембран грамотрицательных бактерий. Протокол может быть использован для изучения многих типов мембранных молекул для этих микробов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

Этот метод работает путем раздела оболочки грамотрицательных бактерий на общую, внутреннюю и внешнюю мембрану (ОМ) фракции и завершается анализами для оценки чистоты двуслойных. ОМ имеет повышенную общую плотность по сравнению с внутренней мембраной, в основном из-за присутствия липулигосахаридов (LOS) и липополисахаридов (LPS) в пределах внешней листовки. Молекулы LOS и LPS являются амфипатические гликолипииды, которые имеют аналогичную структуру, которая состоит из липидов-а disaccharolipid и ядра-олигосахарида заменить. Однако, только молекулы LPS украшены третьим субединицей, известной как O-полисахарид, или O-антиген. Тип и количество гликолипидов, присутствующих будет влиять на плотность ОМ организма. Поэтому мы проверили, могут ли мембраны бактерий с разнообразным содержанием гликолипидов быть также изолированы с помощью нашей техники. Для LPS-производящих организмов, Salmonella enterica serovar Typhimurium и Escherichia coli, мембраны были легко изолированы и LPS O-антигена moiety не повлияло на расставание двухслойных. Acinetobacter baumannii производит молекулы LOS, которые имеют аналогичную массу O-антигена, недостаточное молекулы LPS; однако, мембраны этих микробов не могли первоначально быть разделены. Мы рассудили, что ОМ A. baumannii был менее плотным, чем у Enterobacteriaceae, поэтому градиент сахарозы был скорректирован и мембраны были изолированы. Таким образом, метод может быть адаптирован и модифицирован для использования с другими организмами.

Этот метод обеспечивает эффективное средство для изоляции ИМ и ОМ для грамотрицательных бактерий. Иллюстрирован контур всей процедуры(рисунок 1). В целом, нормализация культур до OD600 0,6-0,8 в 1 l носителей, или уборка между 6,0 и 8,0 х 1011 бактериальных клеток будет г?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Грамотрицательные бактерии производят две пространственно сегрегированные мембраны. Внешняя мембрана разделена из внутренней мембраны периплазмой и пептидогликанским слоем. Способность изолировать двойные двуслойные эти микробы имеет решающее значение для понимания их физиологии и патогенеза.

Разделение конверта клетки для Грам-отрицательных бактерий в Внутренние и Внешние фракции Membrane с Технически регулировками для Acinetobacter baumannii

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Изучение того, как микробы регулируют химический состав отдельных билейеров, позволит нам узнать о механизмах убийства антибиотиками, устойчивости к противомикробным препаратам и патогенеза болезней. Этот метод разделы клеточной оболочки грамотрицательных бактерий на две определенные фракции без использования моющего средства. Таким образом, липиды, белки и сахара могут быть оценены в среде, которая является полу-родной.Некоторые из этих шагов зависят от времени и требуют сосредоточения внимания и координации. Первоначально используйте один или два образца. Когда уровень комфорта повышается, можно добавить больше образцов.Не более шести образцов должны быть обработаны одновременно. Это многодневная процедура и визуальные контрольно-пропускные пункты полезны для оценки эффективности и ошибок. До выполнения этого иногда заключительные шаги.Перенесите бактерии из замороженных запасов глицерола на свежие агарные пластины. Как только колонии развиваются, хранить пластины при четырех градусах по Цельсию. Используйте одну колонию, чтобы привить пятими миллилитровую трубку, наполненную бульонными средствами массовой информации и культурой бактерий по желанию в одночасье.Назад разбавить ночь бактериальной культуры в один литр предпочтительного бульона средств массовой информации и инкубировать колбы. Когда желаемая оптическая плотность будет достигнута, удалите колбы из инкубатора и поместите их на лед. Измерьте оптическую плотность культуры на уровне 600 нанометров и рассчитайте объем культуры, эквивалентный от шести до восьми раз от 10 до одиннадцатой бактериальной колонии, образующей единицы.Добавьте этот объем культуры в трубку центрифуги и убедитесь, что остальные культуры остаются на льду до тех пор, пока они не будут использоваться. Пеллет бактерий центрифугации в течение 10 минут ina фиксированный угол, высокая скорость центрифуги на 7000 до 10000 раз G и четыре градуса по Цельсию. Тщательно декант супернатант и отбросить его.Resuspend каждой ячейки гранулы в 12,5 миллилитров буфера A.Add магнитного перемешивания бар для подвески клетки. Добавьте 180 микролитров по 10 миллиграммов на миллилитр лизозим для повторного незаменимия каждой клетки. После сбора лизозима ЭДТА обработанных бактерий центрифугации, быстро добавить ингибитор протеазы, хлорид магния и нуклеазы к бактериям и быстро повторного перерасхода клеток в буфере B.Stir в течение двух минут, сохраняя суспензии на льду.Затем добавьте 12,5 миллилитров раствора EDTA 1,5 миллимолярной EDTA к каждой клетке и продолжайте перемешивание на льду в течение еще семи минут. Декант суспензий в 15 миллилитров конических труб. Центрифуга суспензий при 9000-11 000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.Выбросьте супернатанты в контейнер для биологических отходов и сохраните гранулы на льду. Добавьте 25 миллилитров буфера B к каждой клеточной грануле. Затем добавьте 55 микролитров одного хлорида молярного магния, один микролитер рнкзы/ДНК/нуклеазного реагента и один микролитер ингибитора протеазы.Повторное производство гранул в смеси. Энергично пипетки и вихри до тех пор, пока растворы не появятся однородными. Храните подвески на льду.Налейте образец в цилиндр образца гомогенизатора и доввейте ячейку до 20 000 PSI. Чтобы избежать аэрозолизации патогенных микроорганизмов, состояние под давлением аппарата в буфере B и регулировать уровень давления, прежде чем добавлять бактериальной суспензии. Привлекайте ячейку давления и уполяйте 10 миллилитров буфера B в качестве меры предосторожности.Соберите лисат клетки в 50 миллилитровых конических трубках на льду, сохраняя при этом образцы на льду. Для достижения полного лиза повторите этот процесс три-пять раз. Чтобы гранулировать оставшийся, нетронутый, клеточный материал, центрифугу лисированные бактериальные образцы в 6, 169 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.Распределите супернатанты, которые в настоящее время содержат гомогенизированные мембраны, в поликарбонатные бутылки для ультрацентрифугации. Ультрацентрифуг клетки лисирует при 184, 500 раз G и четыре градуса по Цельсию, по крайней мере один час. Откажитесь от супернатантов и сохраните мембранные гранулы на льду.Используя стекло, Dounce гомогенизатор, повторно гранулы мембраны в один миллилитр низкой плотности изопицинового градиентного раствора сахарозы. Затем используйте стекло, Пастер пипетки для передачи образца гомогената в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки и место трубки на льду. Чтобы подготовить градиент сахарозы, удерживайте полипропилен или ультра-чистую трубку Open-Top в слегка наклоненом положении.Медленно добавьте два миллилитров раствора сахарозы более высокой плотности. Затем добавьте четыре миллилитров раствора сахарозы более низкой плотности. При подготовке градиента плотности, добавить раствор сахарозы медленно, чтобы избежать смешивания слоев.Слои сахарозы должны быть слегка видимыми и выглядеть в целом определенными. Далее добавьте общую мембранную фракцию, которая ранее была повторно использована в одном миллилитре низкой плотности, растворе изопихной сахарозы. Наконец, заполните оставшуюся часть трубки, добавив около шести миллилитров низкой плотности, изопицинового градиентного раствора сахарозы.Ultracentrifuge образцов с помощью размахивая ротор ведро на 288000 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение 16 до 23 часов. Отрежьте конец от наконечника пипетки P1000 около пяти миллилитров от точки. После того, как центрифуга завершена, используйте пипетку, чтобы удалить верхний, коричневый слой из трубки.Перенесите этот слой, содержащий внутреннюю мембранную фракцию, в поликарбонатную бутылку для ультрацентрифугации. Оставьте около двух миллилитров раствора сахарозы над интерфейсом между 53% сахарозой и 73%сахарозой, чтобы нижняя, белая, внешняя мембранная фракция не пересекала загрязнять внутреннюю мембранную фракцию. Опять же с помощью P1000 пипетки кончик с конца удалены, удалить внешний слой мембраны и передать его в поликарбонат бутылку.Заполните оставшуюся пустоту поликарбонатной бутылки с изолированным буфером хранения мембраны и смешайте путем инверсии или pippetting. Сохранить образцы на льду. Для сбора мембран, ультрацентрифуг поликарбонат бутылки на 184, 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.Наконец, отбросьте супернатанты и добавьте от 500 до 1000 микролитров буфера хранения. Resuspend мембраны по гомогенизации Dounce. Соберите образцы в двух миллилитровых микроцентрифугных трубках.Всего мембранных гранул были Царапины, Dounce гомогенизации и ультрацентрифугированных над градиентами плотности сахарозы, чтобы отделить внутренние и внешние мембраны. Градиент плотности сахарозы 20%53%73% был достаточен для разделения некоторых бактериальных штаммов. Но не для раздела A.baumannii, который был успешно разделен с использованием 20%45%73%градиента.Для оценки эффективности разделения были протестированы образцы мембраны для дегидрогеназы NADH, фермента, расположенного в бактериальной внутренней мембране. Снижение оптической плотности на 340 нанометров указывает на наличие фермента. Оптическая плотность была измерена для 50 образцов микрограммов внутренних и внешних мембранных фракций дикого типа S.typhimurium, E.coli K12 DH5a и galE мутанта S.typhimurium.Более высокая концентрация белка была добавлена при анализе чистоты мембранных фракций A.baumannii, потому что первоначальный анализ с использованием 50 микрограммов показал, что относительные уровни дегидрогеназы NADH были ниже для A.baumannii, чем для других бактериальных штаммов. Для оценки перекрестного загрязнения фракций внутренней мембраны с внешними мембранами были извлечены и визуализированы LPS и LOS. Экстракты были загружены на полиакриламинидный гель и окрашены Про-З Изумруд 300.Acinetobacter baumannii является главным приоритетом, мульти лекарственно устойчивый, человеческий патоген. Этот протокол должен помочь исследователям в понимании роли липулигосахаридов, фосфолипидов и липопротеинов в механизмах резистентности и вирулентности этого уникального и важного патогена. Этот метод идеально подходит для вниз по течению анализа фосфолипидов, гликолипидов углеводов, белков и малых молекул, которые обычно существуют в двойных мембранах грамотрицательных бактерий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Очистка и визуализация липополисахарида из грамотрицательных бактерий горячих водно-фенольной экстракции

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Послушный млекопитающих инфекции сотовый с Протозойные грунтовка бактерии

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Флуоресцентной микроскопии Методы определения жизнеспособности бактерий в ассоциации с клетках млекопитающих

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Легионелл везикул наружной мембраны: Выделение и анализ их провоспалительного потенциала на макрофагах

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Применение последовательных массаж-как Пертурбации на мышителях и мониторинг результирующих внутримышечных изменений давления

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Разделение эпидермиса и дермы крыс термолизином для обнаружения сайт-специфической воспалительной мРНК и белка

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Неонатальная модель визуализации грамотрицательных бактериальных сепсисов

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Некодирующая малая РНК MicC способствует вирулентности белков наружной мембраны Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...