Name: separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii
Uploaded: 2020-04-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Bu çalışma P20GM10344 ve R01AI139248 tarafından Z. D. Dalebroux'a verildi.

1. Membran Ekstraksiyonu için Genel Reaktifler ve Ortam Hazırlığı
<ol><li>Bakteriyel büyüme ortamı: Tamamen temizlenmiş ve otoklavlı 2 L şişede 1 L et suyu ortamıhazırlayın ve sterilize edin.</li>
	<li>Genel resuspension arabelleği (1 M Tris Tampon pH 7.5; 50 mL): 6.05 g Tris tabanını H2O'nun 30 mL'sinde çözün.2</li>
	<li>Divalent katyon şelasyon çözeltisinin ana stoku (0.5 M EDTA pH 8; 100 mL): 18.6 g disodyum etilen tetraasetat·2H2O ila 80 mL H2O. S...

<ol>
	<li>Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+cell+envelope.">The bacterial cell envelope.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 000414 (2010).</li><li>Egan, A. J., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+bacterial+cell+division.">The physiology of bacterial cell division.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1277, 8-28 (2013).</li><li>Pazos, M., Peters, K., Vollmer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+peptidoglycan+growth+by+dynamic+and+variable+multi-protein+complexes.">Robust peptidoglycan growth by dynamic and variable multi-protein complexes.</a> Current Opinion in Microbiology. 36, 55-61 (2017).</li><li>Raetz, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymology,+genetics,+and+regulation+of+membrane+phospholipid+synthesis+in+Escherichia+coli.">Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli.</a> Clinical Microbiology Reviews. 42, 614-659 (1978).</li><li>Whitfield, C., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+export+of+bacterial+lipopolysaccharides.">Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).</li><li>Needham, B. D., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fortifying+the+barrier:+the+impact+of+lipid+A+remodelling+on+bacterial+pathogenesis.">Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 11, 467-481 (2013).</li><li>Simpson, B. W., Trent, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+envelope:+LPS+modifications+and+their+consequences.">Pushing the envelope: LPS modifications and their consequences.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 403-416 (2019).</li><li>Ebbensgaard, A., Mordhorst, H., Aarestrup, F. M., Hansen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Outer+Membrane+Proteins+and+Lipopolysaccharides+for+the+Sensitivity+of+Escherichia+coli+to+Antimicrobial+Peptides.">The Role of Outer Membrane Proteins and Lipopolysaccharides for the Sensitivity of Escherichia coli to Antimicrobial Peptides.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2153 (2018).</li><li>Liu, D., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+K12+regains+its+O+antigen.">Escherichia coli K12 regains its O antigen.</a> Microbiology. 140 (1), 49-57 (1994).</li><li>Kalynych, S., Morona, R., Cygler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+the+assembly+process+of+bacterial+O-antigen.">Progress in understanding the assembly process of bacterial O-antigen.</a> FEMS Clinical Microbiology Reviews. 38, 1048-1065 (2014).</li><li>Osborn, M. J., Gander, J. E., Parisi, E., Carson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+assembly+of+the+outer+membrane+of+Salmonella+typhimurium.+Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+and+outer+membrane.">Mechanism of assembly of the outer membrane of Salmonella typhimurium. Isolation and characterization of cytoplasmic and outer membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 247, 3962-3972 (1972).</li><li>Osborn, M. J., Munson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+the+inner+(cytoplasmic)+and+outer+membranes+of+Gram-negative+bacteria.">Separation of the inner (cytoplasmic) and outer membranes of Gram-negative bacteria.</a> Methods in Enzymology. 31, 642-653 (1974).</li><li>Cian, M. B., Giordano, N. P., Masilamani, R., Minor, K. E., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+use+PbgA/YejM+to+regulate+lipopolysaccharide+assembly+during+bacteremia.">Salmonella enterica serovar Typhimurium use PbgA/YejM to regulate lipopolysaccharide assembly during bacteremia.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li><li>Masilamani, R., Cian, M. B., Dalebroux, Z. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+Tol-Pal+Reduces+Outer+Membrane+Glycerophospholipid+Levels+for+Envelope+Homeostasis+and+Survival+during+Bacteremia.">Salmonella Tol-Pal Reduces Outer Membrane Glycerophospholipid Levels for Envelope Homeostasis and Survival during Bacteremia.</a> Infection and Immunity. 86, (2018).</li><li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+Membrane+of+Salmonella-Typhimurium+Transmembrane+Diffusion+of+Some+Hydrophobic+Substances.">Outer Membrane of Salmonella-Typhimurium Transmembrane Diffusion of Some Hydrophobic Substances.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 433, 118-132 (1976).</li><li>Dalebroux, Z. D., Matamouros, S., Whittington, D., Bishop, R. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhoPQ+regulates+acidic+glycerophospholipid+content+of+the+Salmonella+Typhimurium+outer+membrane.">PhoPQ regulates acidic glycerophospholipid content of the Salmonella Typhimurium outer membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1963-1968 (2014).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Cam, K., Jacq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RcsF+is+an+outer+membrane+lipoprotein+involved+in+the+RcsCDB+phosphorelay+signaling+pathway+in+Escherichia+coli.">RcsF is an outer membrane lipoprotein involved in the RcsCDB phosphorelay signaling pathway in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 188, 4264-4270 (2006).</li><li>Thorne, K. J., Thornley, M. J., Glauert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+analysis+of+the+outer+membrane+and+other+layers+of+the+cell+envelope+of+Acinetobacter+sp.">Chemical analysis of the outer membrane and other layers of the cell envelope of Acinetobacter sp.</a> Journal of Bacteriology. 116, 410-417 (1973).</li><li>Geisinger, E., Huo, W., Hernandez-Bird, J., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii:+Envelope+Determinants+That+Control+Drug+Resistance,+Virulence,+and+Surface+Variability.">Acinetobacter baumannii: Envelope Determinants That Control Drug Resistance, Virulence, and Surface Variability.</a> Annual Review of Microbiology. 73, 481-506 (2019).</li><li>Kamischke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acinetobacter+baumannii+Mla+system+and+glycerophospholipid+transport+to+the+outer+membrane.">The Acinetobacter baumannii Mla system and glycerophospholipid transport to the outer membrane.</a> Elife. 8, (2019).</li></ol>

Bu yöntem, bakteri fizyolojisi ve patogenezinde hücre zarfının rolünü anlamada araştırmacılara yardımcı olmaya devam edecektir. Sıralı ultracentrifugation adımları aşağıdaki saflaştırılmış toplam, iç ve OM fraksiyonu elde edilebilir. Bu membranlar, membran protein lokalizasyonu ve fonksiyonu, periplazma boyunca taşınması ve ticareti ve çeşitli çevre koşullarında bireysel iki katmanlı bileşimi ile ilgili hipotezleri test etmek için izole olarak test edilebilir. Los/ LPS ve OM proteinleri...

Gram-negatif bakteriler periplazmik alan ve peptidoglikan hücre duvarı1ile ayrılan iki membran üretirler. İç membran (IM) sitosol kapsar ve fosfolipidlerin simetrik bir çift katmanlı olduğunu. Peptidoglycan turgor basıncına karşı korur ve bir hücre şekli ile bakteri sağlar, ve dış membranbağlı (OM) lipoproteinler tarafından2,3. OM periplazmayı çevreler ve ağırlıklı olarak asimetriktir. İç broşür fosfolipidler oluşur ve dış broşür lipooligosaccharides olarak bilinen glikolipidler oluşur (LOS) veya lipopolysaccharides (LPS)4,5. Dış broşürdeki LOS/LPS moleküllerinin lipid asimetrisi ve biyokimyası, bakteriyi kendi ortamındaki tehlikelere karşı koruyan hücre yüzeyine bariyer özellikleri verir6,7.
LPS molekülleri üç bileşenden oluşur: lipid A disakkarolipid, çekirdek oligosakkarit, ve O-polisakkarit veya O-antijen. Lipid A, çoğalan bir asilate disakkarolipidtir. Core-oligosakkaritler kaba LPS veya R-LPS olarak bilinen 10-15 şekerden oluşur. Çekirdek iç bölgeye ayrılmıştır, oluşan 2-keto-3-deoksi-D-manno-octulosonic asit (kdo) ve bir veya daha fazla heptozkoz kalıntısı, ve genellikle heksoslar oluşan bir dış bölge (glikoz veya galaktoz) ve heptozlar, veya asetama şekerler5. Dış çekirdek bölgesi bileşenleri ve yapısında iç çekirdekten daha değişkendir. Salmonella spp., sadece bir çekirdek yapısı açıklanmıştır; ancak, Escherichia coli beş farklı çekirdek yapıları (K-12, R1, R2, R3 ve R4)8belirlenmiştir. Bu işlemde kullandığımız E. coli K-12 DH5α, r-LPS9üretimine neden olan bir mutasyon taşır. R-LPS molekülleri O-antijen moiety eksikliği ve LOS molekülleri benzer bir molekül ağırlığına sahip.
R-LPS'ye O-antijen eklenmesi bu molekülü yumuşak LPS veya S-LPS'ye dönüştürür. O-antijenler kısa 3-4 karbonhidrat alt birimlerinden üretilmiştir ve10zincir uzunlukları değişen birden fazla yöntem oluşur. Bazı LPS üreten bakteriler, Salmonella enterica serovar Typhimurium gibi (S. Typhimurium), kendi yüzeyinde LPS moleküllerinin trimodal dağılımını görüntülemek10,11. Çok uzun zincir O-antijenler yüz alt birim içerebilir ve yüz kilodalton üzerinde ağırlığında. O-antijenler antibiyotiklere direnmek, bakteriyofajlar tarafından predation kaçınmak için gerekli olan bakteri yüzey özellikleri sağlar, ve hastalığa neden.
Campylobactertürleri , Bordetella, Acinetobacter, Haemophilus, Neisseria ve diğerleri kendi yüzeyinde LPS molekülleri yerine LOS molekülleri oluşturmak12. LOS molekülleri lipid A ve çekirdek oligosakkaritler oluşur ama O-antijen eksikliği. Gram-negatif bakterilerin Bu tür yüzey özellikleri12değiştirmek için ek şeker ler ve şeker kombinasyonları ile çekirdek oligosakkaritler değiştirmek. Hem LOS hem de LPS üreten mikroplar lipid A ve katyonik moieties7ile çekirdek molekülleri fosfatlar türemiş . Bu eklemeler fosfoetanolamin içerir, galaktosamin ve aminoarabinose ikameler, anyonik yüzey yükü nötralize ederek işlev ve bu nedenle katyonik antimikrobiyal peptidler karşı koruma. Gram-negatif bakteriler de şekerdeğişken olmayan stoiyometrik ikame ile çekirdek oligosakkarit yapısını değiştirmek, ya da ekstra kdo molekülleri, ve lipid-A disaccharolipidler üzerinde asil zincirlerin sayısını değiştirmek7.
Yeteneği Gram-negatif bakterilerin OM im izole etmek için antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hücre zarfının rolünü anlamak için etkili olmuştur11,12. Bu yaklaşımın türevleri, OM için protein, fosfolipid ve glikolipid bileşenlerinin montaj, bakım ve yeniden biçimlendirilmesi mekanizmalarını saptamak için kullanılmıştır.
Laboratuvarımız, çeşitli Gram-negatif türlerde protein aracılı lipid regülasyonu ve lipid fonksiyonunu incelemek için rutin olarak bakteriyel lipidomik analizler yapar. Protokolde kullanılan hacimler ince tabaka kromatografisi ve sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi13,14ile radyoetiketli olmayan fosfolipidleri analiz etmek için bu işlemin rutin kullanımını yansıtır.
Protokol, Gram-negatif bakterilerin soğutulmuş süspansiyonunun yüksek ozroz çözeltisine maruz kalmaları ve OM'yi altta yatan peptidoglikan tabakasından ayrıştırmak için lisozyme ekleyerek başlar (Şekil 1)12. EDTA daha sonra lizozim penetrasyon kolaylaştırmak için eklenir, divalent katyon sekestrasyon komşu LOS / LPS molekülleri arasındaki lateral elektrostatik köprü etkileşimleri bozar beri15. Bizimkinin uyarlandığı orijinal protokol, plazma zarı ve sitosoldan oluşan gram-negatif bakteri hücresi formu olan sferoplastların oluşumunu gerektiriyordu, ancak peptidoglikan tabakası ve OM'den yoksun. Spheroplastların uyarlanmış yöntemle üretilmeleri mümkündür; ancak, teknik, başarı için kendi oluşumuna güvenmez veya niyet etmez. Bunun yerine, lysozyme-EDTA tedavi edilen bakteriler santrifüj ile hızla hasat edilir ve basınçlı lysis önce daha az konsantrasyon bir sakaroz çözeltisi yeniden askıya alınır. Spheroplastlar oluşturarak serbest bırakılmış olabilecek OM'ler teorik olarak tedavi edilen hücrelerin süpernatants hasat edilmelidir, ancak bu yaklaşım burada ayrıntılı değildir. Sonuçta, tedavi hücreleri membran ayırma prosedürü16verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırır konvansiyonel homojenizasyon ve lysis, tabi tutulur.
Lysis'ten sonra, toplam membranlar ultrasantrifüj ile toplanır ve IM'ler ve OM'leri fraksiyonetmek için sürekli sakaroz yoğunluğu gradyan uygulamasına uygulanır. Klasik yaklaşım en az beş farklı sakaroz çözeltisi11,,12oluşur daha sürekli bir degrade kullanır. Protokolümüzdeki kesintili degrade üç sakaroz çözeltisi oluşur ve iki kat iki farklı kesirler17bölümlür. Gram-negatif bakterilerin OM'leri içindeki LOS ve LPS molekülleri zarfı üst kahverengi düşük yoğunluklu BIR IM fraksiyonuna ve daha düşük beyaz yüksek yoğunluklu OM fraksiyonuna bölmeye iter(Şekil 1 ve Şekil 2).
Acinetobacter baumannii kendi OM LOS molekülleri üretmek ve ayırmak zor bir hücre zarfı dik önemli multidrug dirençli insan patojenler vardır18,19. Son çalışmalar, burada sunduğumuz protokolün bir türemiş bu organizmaların iki katmanlı20bölünmesi için kullanılabilir düşündürmektedir. Bu nedenle protokolümüzü A. baumannii 17978'de test ettik. Başlangıçta, prosedür yetersizdi. Ancak orta yoğunluk çözeltisinin sakaroz konsantrasyonu ve büyük ölçüde geliştirilmiş ayırma(Şekil 2)olarak değiştirildi. A. baumannii,yabani tip S. için ayrışmayı doğrulamak için NADH dehidrogenaz tayini ve LOS/LPS ekstraksiyon ve algılama prosedürü kullanılmıştır. Tiphimurium ve iki O-antijen eksikliği enterobakteriyel genotip; yani, galE-mutant S. Tiphimurium ve laboratuvar suşu, E. coli DH5α (Şekil 3 ve Şekil 4).
Bu çalışmanın amacı, Gram-negatif bakterilerin zarlarını tekrarlı bir şekilde izole etmek için düzenli bir yaklaşım sağlamaktır. Protokol bu mikroplar için membran ilişkili moleküllerin birçok türde çalışma için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L Centrifuge bottles, PC/PPCO, super speed, with sealing cap, Nalgene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0466</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L Pyrex Media Storage Bottle with High Temperature Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10416-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2000 mL Erlenmeyer Flask, Narrow Mouth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10545-844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% mini PROTEAN Precast Protein Gels, 12 well</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>4561095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli Sample Buffer 10 mL</td>
			<td>BIORAD</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile polypropylene centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL Dounce Tissue Homogenizer with Two Glass Pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>71000-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mL polycarbonate bottle assembly</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>355622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Powder</td>
			<td>VWR</td>
			<td>A10752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B10P Benchtop pH Meter with pH Probe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89231-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus UV/UF - TOC (bench version)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50136146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>70746-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium salt dihydrate 99.0-101.0%, crystals, ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Avestin, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiberlite F13-14 x 50cy Fixed Angle Rotor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75006526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 6.0 N</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBI Scientific Orbital Platform Shaker</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15-453-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth Miller</td>
			<td>VWR</td>
			<td>214906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme, Egg White, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRV0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10107735001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima XPN-80 - IVD</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>A99839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmco Products&#160;PURE ALCOHOL 200 PROOF GL 4/CS&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC1624582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Solution, Equilibrated with 10 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, BioReagent, for molecular biology</td>
			<td>Sigma - Millipore</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>23238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro-Q emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>P20495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteacease -50, EDTA free</td>
			<td>G Biosciences</td>
			<td>786-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P8107S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide &#8805;99.99%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AA45780-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorval RC 6 Plus Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>36-101-0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>SX1075-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS, Trometamol) &#8805;99.9% (dried basis), ultrapure Bioreagent Molecular biology grade, J.T. Baker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT4109-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 45 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>339160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Clear Tube ,14 x 89mm</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-234</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of the cell envelope for gram-negative bacteria into inner and outer membrane fractions with technical adjustments for acinetobacter baumannii

Bu yöntem, Gram-negatif bakterilerin zarfını total, iç ve dış membran (OM) fraksiyonlarına bölme ile çalışır ve iki katmanlı saflığı değerlendirmek için tahlillerle sonuçlandırır. OM iç membran ile karşılaştırıldığında artan bir genel yoğunluğu vardır, büyük ölçüde lipooligosaccharides varlığı nedeniyle (LOS) ve lipopolisakkaritler (LPS) dış broşür içinde. LOS ve LPS molekülleri benzer bir yapıya sahip amphipatif glikolipidler, bir lipid-A disakkarolipid ve çekirdek-oligosakkarit ikame oluşur. Ancak, sadece LPS molekülleri O-polisakkarit veya O-antijen olarak bilinen üçüncü bir alt birim ile dekore edilmiştir. Mevcut glikolipidlerin türü ve miktarı bir organizmanın OM yoğunluğunu etkileyecektir. Bu nedenle, çeşitli glikolipid içeriğine sahip bakterilerin zarlarının da tekniğimizle benzer şekilde izole edilip edilmeyeceğini test ettik. LPS üreten organizmalar için, Salmonella enterica serovar Typhimurium ve Escherichia coli, membranlar kolayca izole edildi ve LPS O-antijen moiety iki katmanlı bölümleme etkilemedi. Acinetobacter baumannii, O-antijen eksikliği LPS moleküllerine benzer kütleye sahip LOS molekülleri üretir; ancak, bu mikropların membranlar başlangıçta ayrılmış olamazdı. A. baumannii om'unun Enterobacteriaceae'den daha az yoğun olduğunu, bu nedenle sakaroz gradyanının ayarlandığını ve membranların izole edildiğini gerekçe gösterdik. Bu nedenle teknik uyarlanabilir ve diğer organizmalarile kullanılmak üzere değiştirilebilir.

Bu teknik, Gram-negatif bakteriler için IM'leri ve OM'leri izole etmek için etkili bir araç sağlar. Tüm yordamın anahat gösterilmiştir (Şekil 1). Genel olarak, 1 L'de 0.6-0.8'lik bir OD600'e kültürlerin normalleştirilmesi veya 6.0 ile 8.0 x 1011 bakteri hücresi arasında hasat edilmesi, sonraki ayırma için uygun miktarda membran materyalinin toplanmasını sağlayacaktır.
Bakterilerin lysing ve lysate ultracentrifuging üzerin...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii at J

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Gram-negatif bakteriler iki mekansal olarak ayrılmış membran üretirler. Dış zar bir periplazm ve peptidoglikan tabakası ile iç zardan bölümlenir. Bu mikropların çift iki katmanlı izole yeteneği fizyolojisi ve patogenezini anlamak için kritik olmuştur.

Gram-negatif Bakteriler için Hücre Zarfının İç ve Dış Membran Fraksiyonlarına Ayrılması Acinetobacter baumannii için Teknik Ayarlamalar

This method works by partitioning the envelope of Gram-negative bacteria into total, inner, and outer membrane (OM) fractions and concludes with assays to ...

Mikropların bireysel iki katmanlı kimyasal bileşiminasıl düzenlediğini incelemek antibiyotik öldürme mekanizmaları, antimikrobiyal direnç ve hastalık patogenezi hakkındaki bilgimizi bilgilendirecektir. Bu teknik, gram-negatif bakterilerin hücre zarfını deterjan kullanmadan iki tanımlanmış fraksiyona ayırır. Bu nedenle, lipidler, proteinler ve şekerler yarı yerli bir ortamda değerlendirilebilir.Bazı adımlar zamana bağlıdır ve odaklanma ve koordinasyon gerektirir. Başlangıçta, bir veya iki örnek kullanın. Kişinin konfor seviyesi arttığında, daha fazla örnek eklenebilir.Aynı anda en fazla altı örnek ele alınmalıdır. Bu çok günlük bir yordamdır ve görsel kontrol noktaları etkinliğini ve hatayı değerlendirmek için yararlıdır. Bu bazen son adımları gerçekleştirmeden önce.Taze agar plakaları üzerine dondurulmuş gliserol stokları gelen bakterileri streak. Koloniler geliştikten sonra plakaları dört santigrat derecede saklarlar. Bir gecede istenildiği gibi et suyu medya ve kültür bakteri dolu beş mililitrelik tüp aşılamak için tek bir koloni kullanın.Geri tercih edilen et suyu medya bir litre içine bir gecede bakteri kültürü seyreltmek ve şişeleri inkübün. İstenilen optik yoğunluk elde edildiğinde, şişeleri kuvözden çıkarın ve buza yerleştirin. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nanometre olarak ölçün ve 10 bakteri kolonisi oluşturan ünitelere altı ila sekiz kat 10'a eşdeğer kültür hacmini hesaplayın.Bir santrifüj tüpüne bu kültür hacmini ekleyin ve kalan kültürlerin kullanılacak olana kadar buzda kalmasını sağlayın. Pelet sabit bir açı, 7, 000-10, 000 kez G ve dört derece santigrat yüksek hızlı santrifüj 10 dakika santrifüj için santrifüj ile bakteri. Dikkatle supernatant decant ve atın.Tampon A.A.12.5 mililitre her hücre pelet resuspend hücre süspansiyon için bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin. Her hücre resuspension için mililitre lysozyme başına 10 miligram 180 mikrolitre ekleyin. Santrifüj ile tedavi edilen lysozyme EDTA bakterisini topladıktan sonra, bakterilere proteaz inhibitörü, magnezyum klorür ve nükleazı hızla ekleyin ve tampon B.Stir'deki hücreleri iki dakika boyunca hızla yeniden askıya alın ve süspansiyonları buzda tutarak tekrar layın.Daha sonra, her hücrenin yeniden süspansiyon 12,5 mililitre 1.5 mililitre EDTA çözeltisi ekleyin ve ek bir yedi dakika boyunca buz üzerinde karıştırmaya devam edin. Süspansiyonları 15 mililitrelik konik tüplere ayırın. Süspansiyonları 9, 000 ila 11, 000 kez G'yi 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin.Supernatants bir biyolojik atık konteyner içine atın ve buz üzerinde pelet tutun. Her hücre peletine 25 mililitre arabellek B ekleyin. Daha sonra, bir molar magnezyum klorür 55 mikrolitre, rnase / dnase / nükleaz reaktif bir mikrolitre ve proteaz inhibitörü kokteyl bir mikrolitre ekleyin.Karışımdaki peletleri yeniden askıya alın. Çözeltiler homojen görünene kadar güçlü bir şekilde pipet ve girdap. Süspansiyonları buzda saklayın.Örneği homogenizer örnek silindirine dökün ve hücreyi 20,000 PSI'ya getirin. Patojenlerin aerosolizasyonunu önlemek için, basınçlı cihazı tampon B'de koşullandırmak ve bakteriyel süspansiyon eklemeden önce basınç seviyelerini ayarlayın. Önlem olarak basınç hücresini devreye alın ve 10 mililitre tampon B'yi ima edin.Ayrıca buz üzerinde 50 mililitrekonik tüpler hücre lysate toplamak. Tam bir lisis elde etmek için, bu işlemi 3-5 kez tekrarlayın. Kalan, bozulmamış hücre materyalini, 6, 169 kez G ve 4 santigrat derece 10 dakika lized bakteri örneklerini santrifüj etmek için.Şimdi homojenize membranlar içeren supernatants dağıtın, ultracentrifugation için polikarbonat şişeler halinde. Ultracentrifuge hücre lysates 184, 500 kez G ve dört derece santigrat en az bir saat için. Supernatants atın ve buz üzerinde membran pelet tutun.Bir cam kullanarak, Homogenizer Dounce, düşük yoğunluklu izopiknik sakaroz gradyan çözeltisi bir mililitre membran pelet resuspend. Daha sonra, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne örnek homojen aktarmak ve buz üzerinde tüp yerleştirmek için bir cam, Pasteur pipet kullanın. Sakaroz gradyanı hazırlamak için polipropilen veya Ultra açık açık bir tüpü hafif çetrene bir pozisyonda tutun.Yavaşça yüksek yoğunluklu sakaroz çözeltisi iki mililitre ekleyin. Sonra düşük yoğunluklu sakaroz çözeltisi dört mililitre ekleyin. Yoğunluk gradyanı hazırlanırken, katmanları karıştırmamak için sakaroz çözeltisini yavaşça ekleyin.Sakaroz tabakaları hafifçe görünür olmalı ve genel olarak tanımlanmış görünmelidir. Daha sonra, daha önce düşük yoğunluklu bir mililitre resuspended oldu toplam membran fraksiyonu ekleyin, izopyknik sakaroz çözeltisi. Son olarak, düşük yoğunluklu yaklaşık altı mililitre ekleyerek tüpün geri kalanını doldurun, isopycnic sucrose gradyan çözeltisi.Ultracentrifuge örnekleri 288, 000 kez G ve dört derece santigrat 16 ila 23 saat için bir sallanan kova rotor kullanarak. Bir P1000 pipet ucu noktadan yaklaşık beş mililitre uç kesti. Santrifüj tamamlandıktan sonra, tüpüst, kahverengi tabaka kaldırmak için pipet kullanın.İç zar fraksiyonu içeren bu katmanı ultra santrifüj için polikarbonat şişeye aktarın. Alt, beyaz, dış membran fraksiyonunun iç zar fraksiyonuna geçmemesini sağlamak için %53 sakaroz ve %73 sakaroz arasındaki arayüz üzerinde yaklaşık iki mililitre sakaroz çözeltisi bırakın. Yine uç kaldırıldı ile bir P1000 pipet ucu kullanarak, dış membran tabakası kaldırmak ve bir polikarbonat şişe aktarın.Polikarbonat şişenin kalan boşluğunu izole membran depolama tamponuyla doldurun ve ters çevirme veya pipepetting ile karıştırın. Örnekleri buzda sakla. Membranları toplamak için, 184, 500 kez G ve dört santigrat derece bir saat için polikarbonat şişeultracentrifuge.Son olarak, supernatants atın ve depolama arabellek 500 ila 1.000 mikrolitre ekleyin. Dounce homojenizasyon ile membranları yeniden askıya alın. Örnekleri iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın.Toplam membran peletleri kazınmış, dounce homojenize edilmiş ve iç ve dış membranları ayırmak için sakaroz yoğunluk gradyanları üzerinde ultracentrifuged. Sakaroz yoğunluğu gradyanı %20 %53%73 bazı bakteri suşlarının bölümlendirilmesi için yeterliydi. Ama başarıyla% 20% 45% 73 gradyan kullanılarak bölümlenmiş A.baumannii bölümleme için değil.Ayırmanın etkinliğini değerlendirmek için membran örnekleri bakteriyel iç zarda bulunan bir enzim olan NADH dehidrogenaz için test edildi. 340 nanometredeki optik yoğunluktaki azalma enzimin varlığını gösteriyordu. Optik yoğunluk, yabani tip S.typhimurium, E.coli K12 DH5a ve galE mutant S.typhimurium'dan alınan iç ve dış membran fraksiyonlarının 50 mikrogramlık örnekleri için ölçüldü.A.baumannii membran fraksiyonlarının saflığını söylerken daha yüksek bir protein konsantrasyonu eklendi, çünkü 50 mikrogram lık bir ilk tetkik, NADH dehidrogenazın göreceli düzeylerinin A.baumannii için diğer bakteri suşlarına göre daha düşük olduğunu gösterdi. Dış membran fraksiyonları ile iç membran fraksiyonlarının çapraz kontaminasyonunu değerlendirmek için LPS ve LOS ayıklandı ve görselleştirildi. Özler bir poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve Pro-Q Zümrüt 300 ile lekeli.Acinetobacter baumannii bir öncelik, çok ilaca dirençli, insan patojen. Bu protokol, bu eşsiz ve önemli patojenin direnç ve virülans mekanizmalarında lipooligosakkaritler, fosfolipidler ve lipoproteinlerin rollerini anlamada araştırmacılara yardımcı olmalıdır. Bu yöntem, genellikle gram-negatif bakterilerin çift membraniçinde mevcut fosfolipidler, glikolipidler karbonhidratlar, proteinler ve küçük moleküllerin downstream analizi için idealdir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Separation of the Cell Envelope for Gram-negative Bacteria into Inner and Outer Membrane Fractions with Technical Adjustments for Acinetobacter baumannii

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Sıcak Sulu-fenol Ekstraksiyon tarafından Gram-negatif bakteriler arınma ve Lipopolisakkaritlerinin Görselleştirmesi

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Memeli Hücreleri ile Derneği&#39;nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

In Vivo Investigation of Antimicrobial Blue Light Therapy for Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii Burn Infections Using Bioluminescence Imaging

Çok ilaca dirençli için Antimikrobiyal Mavi Işık Tedavisinin Vivo İncelenmesinin Acinetobacter baumannii Biyoparlaklık ımaging&#39;i kullanarak Enfeksiyonlar Yanık

Burn infections continue to be an important cause of morbidity and mortality. The increasing emergence of multidrug-resistant (MDR) bacteria has led to ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Fare Buzağılarına Tutarlı Masaj Benzeri Pertürbasyonların Uygulanması ve Bunun Sonucu Kas içi Basınç Değişikliklerinin İzlenmesi

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

Bölgeye Özgü İnflamatuar mRNA ve Proteini Tespit Etmek İçin Sıçan Epidermis ve Dermis'in Termolysin ile Ayrılması

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Gram-Negatif Bakteriyel Sepsisin Yenidoğan Görüntüleme Modeli

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...