Name: wireless electrophysiological recording of neurons by movable tetrodes in freely swimming fish
Uploaded: 2019-11-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish at JoVE.com

Siamo grati a Nachum Ulanovsky e ai membri del laboratorio di Ulanovsky per tutto il loro aiuto. Inoltre, siamo grati a Tal Novoplansky-Tzur per l'assistenza tecnica disponibile. Riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario di THE ISRAEL SCIENCE FOUNDATION - FIRST (grant no. 281/15), e del Helmsley Charitable Trust attraverso l'Iniziativa di Robotica Agricola, Biologica e Cognitiva dell'Università Ben-Gurion del Negev.

Tutte le procedure chirurgiche devono essere approvate dai comitati etici locali sul benessere degli animali (ad esempio, IACUC).
1. Costruzione dell'alloggiamento microdrive
<ol><li>Per costruire l'alloggiamento, tagliare una piastra di ottone larga 1 mm in una piastra da 19 mm x 29 mm x 1 mm utilizzando una sega. Tagliare due fessure da 5,5 mm su ciascuno dei lati lunghi perpendicolarmente al bordo, in modo che ogni fessura si trovi a 6,5 mm di distanza dai lati stretti (<strong class="xfi...

<ol>
	<li>Jacobson, M., Gaze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+of+visual+response+from+single+units+in+the+optic+tectum+and+optic+nerve+of+the+goldfish.">Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish.</a> Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).</li><li>Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pop-out+in+visual+search+of+moving+targets+in+the+archer+fish.">Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish.</a> Nature Communications. 6, 6476 (2015).</li><li>Zottoli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+the+startle+reflex+and+Mauthner+cell+auditory+responses+in+unrestrained+goldfish.">Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish.</a> Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).</li><li>Canfield, J. G., Rose, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Mauthner+neurons+during+prey+capture.">Activation of Mauthner neurons during prey capture.</a> Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).</li><li>Canfield, J. G., Mizumori, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+chronic+neural+recording+in+the+telencephalon+of+freely+behaving+fish.">Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish.</a> Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).</li><li>Orger, M. B., de Polavieja, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+behavior:+opportunities+and+challenges.">Zebrafish behavior: opportunities and challenges.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 125-147 (2017).</li><li>Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+whole-brain+neuroscience+in+larval+zebrafish.">Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).</li><li>Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wireless+electrophysiology+of+the+brain+of+freely+swimming+goldfish.">Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish.</a> Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).</li><li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents.">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568 (2012).</li><li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives.">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li><li>Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+impedance+of+implantable+microwire+multi-electrode+arrays+by+ultrasonic+electroplating+of+durable+platinum+black.">Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black.</a> Frontiers in Neuroengineering. 3, 5 (2010).</li><li>Lewicki, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+methods+for+spike+sorting:+the+detection+and+classification+of+neural+action+potentials.">A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials.</a> Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).</li><li>Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+IEEE+802.11+underwater+networks+operating+at+700+MHz,+2.4+GHz+and+5+GHz.">Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz.</a> Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks &amp; Systems. , (2015).</li><li>Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underwater+wireless+communications+in+freshwater+at+2.4+GHz.">Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz.</a> IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).</li><li>Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Underwater+wireless+sensor+communications+in+the+2.4+GHz+ISM+frequency+band.">Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band.</a> Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).</li><li>Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+microelectrode+array+for+chronic+neural+recording.">A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).</li><li>Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+data+quality+in+neuronal+population+recordings.">Improving data quality in neuronal population recordings.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1165 (2016).</li></ol>

Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi necessarie per impiantare una serie di tetrodi nel telencephalon di pesci rossi che nuotano liberamente. Questa tecnica implementa un logger neurale che amplifica e registra i segnali acquisiti da un massimo di 16 canali insieme a un microdrive che può regolare la posizione tetrode nel cervello. Il microdrive permette di regolare la posizione nel cervello per ottimizzare la registrazione.
Questo protocollo può essere facilmente modificato per l...

I pesci sono il più grande e diversificato gruppo di vertebrati, e come altri vertebrati presentano capacità cognitive complesse come la navigazione, socializzare, dormire, caccia, ecc. Tuttavia, i meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per la maggior parte sconosciuti.
Negli ultimi decenni, le registrazioni extracellulari da pesci immobilizzati sono state implementate principalmente per studiare diversi aspetti della base neurale del comportamento1,2. Anche se questa tecnica è appropriata per alcuni sistemi sensoriali, l'indagine dell'intero spettro della base neurale del comportamento è difficile se non impossibile negli animali immobilizzati. I primi progressi hanno riguardato la registrazione dalle cellule Mauthner del pesce da nuoto legato3,4. Tuttavia, le cellule Mauthner sono sproporzionatamente grandi e l'azione registrata potenziale ampiezza, che può andare alto come pochi mV, facilitare la registrazione. Più tardi, Canfield ealtri descrissero una prova di concetto quando si usaun animale legato per registrare dal telecefalo dei pesci5. Un'altra tecnica recente per la registrazione dell'attività neurale dai pesci è l'imaging del calcio (vedi recensioni di Orger e de Polavieja6e Vanwalleghem et al.7). Questa tecnica è stata sviluppata per l'uso con larve di pesce zebra perché la pelle e il cranio sono trasparenti durante lo stadio larvale. Tuttavia, questa tecnica non può essere utilizzata per studiare comportamenti complessi nelle fasi successive dello sviluppo.
Qui, presentiamo una nuova tecnica per la registrazione dell'attività neurale extracellulare dal cervello dei pesci che nuotano liberamente. Questa è una versione modificata del protocollo descritto in Vinepinsky et al.8. L'innovazione principale è l'aggiunta di un microdrive che permette di controllare la posizione degli elettrodi dopo l'intervento chirurgico. La tecnica è progettata per la registrazione dal telencephalon dei pesci rossi utilizzando una serie di tetrodi che sono collegati a un registratore di dati neurali tramite un microdrive. L'intera configurazione è wireless e ancorata al cranio del pesce. Il peso specifico del sistema è equalizzato al peso specifico dell'acqua aggiungendo un piccolo galleggiante che permette al pesce di nuotare liberamente.
La tecnica si basa sull'uso di un data logger neurale che amplifica, digitalizza e memorizza il segnale in un dispositivo di memoria di bordo. Il sistema di telemetria del logger viene utilizzato per avviare e arrestare le registrazioni e per la sincronizzazione con la videocamera. In questo protocollo, viene utilizzato un logger neurale a 16 canali, incorporato in una scatola impermeabile insieme al microdrive.
L'assieme del micromotore è fabbricato da due componenti principali: il micromotore stesso e l'alloggiamento del micromotore (Figura 1A,B). L'alloggiamento contiene il microdrive e i tetrodi, e funge anche da ancora tra il cranio e la scatola del logger (Figura 1C). La scatola del logger di PVC viene fabbricata utilizzando un processo macchina ed è sigillata utilizzando un anello O(Figura 1E-G, vedere anche Figura supplementare 1, Figura supplementare 2e Figura supplementare 3 per un diagramma tridimensionale [3D]). Ad un'estremità, un pezzo di schiuma di polistirolo è attaccato alla scatola del logger per compensare il peso dell'impianto e fornire al pesce un impianto neutro di galleggiamento. La costruzione del microtrasporto descritto nel protocollo segue la procedura presentata da Vandecasteele et al.9 con una modifica per collegare il microtrasporto all'alloggiamento (Figura 1A). Vengono presentati tutti i passaggi principali.
La procedura descritta nel protocollo per preparare il teschio di pesce è simile a quella presentata in Vinepinsky et al.8 ed è descritta brevemente nel protocollo. Un giorno dopo l'intervento chirurgico, i pesci sono normalmente completamente recuperati dagli effetti dell'anestesia e sono pronti per gli esperimenti comportamentali. Si noti che la posizione del tetrode può essere regolata ruotando la vite del microdrive. La vite ha una spaziatura di 300 m per rotazione completa e si raccomanda un avanzamento di 75 m fino a raggiungere la posizione del cervello di destinazione. Un atlante cerebrale appropriato dovrebbe essere consultato per indirizzare la regione cerebrale specifica di interesse. Si consiglia di testare l'impedimento elettrodo ogni volta che il pesce viene anetizzato per la sostituzione della batteria o della scheda di memoria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.7 mm round drill bits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Compatible with the drill.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-blade Scalpel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 channel PCB board</td>
			<td>Neurlynx</td>
			<td>EIB-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X3M phillips flat head screws</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stainless steel. Any type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X3M phillips round head screws</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stainless steel. Any type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 cm X 19 cm X 1 mm brass plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Figure 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X6M phillips flat head screws</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stainless steel. Any type.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3140 RTV coating</td>
			<td>Dow Crowning</td>
			<td>2767996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 &#181;m Silver wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass machine screws #00-90</td>
			<td></td>
			<td>947-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass plates 7.5mm X 2.5mm X 0.6mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A 3D drawing is provided. See supplementary 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coated Tungsten wire 25&#181;m</td>
			<td>California Fine Wire Company</td>
			<td>5000160</td>
			<td>Depending on the appication the tetrodes can be fabricated from any type of wire. Popular wires are nicrome wires that can be found with lower diameters (eg. A-M systems, 762000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coated Tungsten wire 50&#181;m</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>795500</td>
			<td>Can be replaced with any other wire with low impedance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilic glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental Burnisher</td>
			<td>ComDent UK</td>
			<td></td>
			<td>Any small sterille stainless-still tool will do.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement - GCFujiPLUS</td>
			<td>GC</td>
			<td>431011</td>
			<td>Other dental cements would probably will work as well although we have never tried any other.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill or nail polish drill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dental drills are expensive, a nail polish drill can be a cheap replacement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit #65</td>
			<td></td>
			<td>947-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast curing epoxy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any 5 minutes curing epoxy can be used here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Logger box with O-ring sealing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A 3D drawing is provided. See supplementary 1-3. The box should be machine fabricated (do not use 3D printers). Use transperant material, to be able to see the indicator LEDs on the logger.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized turning device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made as described in &#34;open ephys&#34; website. Can also be purchusaed from neurolynx (&#34;Tetrode Spinner 2.0&#34;) or bulit by other means.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouselog-16 Neural logger</td>
			<td>Deuteron Technologies Ltd</td>
			<td></td>
			<td>There are several neural loggers available on the market, including: SpikeGadget (UH32 32channels) and Neurologger 2/2A/2B of Alexei Vyssotski. It should be noted that weight is not a major contraint since it can be counterbalanced with floating Styrofoam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Ethtl 3-aminobenzoate methanesulfonate 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano-Z plating</td>
			<td>White Matter LLC</td>
			<td></td>
			<td>The nano-Z can be bought from several supllieres. Any impedance meter can be used, e.g. IMP-1 / 6662 / 2788, BAK Electronics.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCB pins</td>
			<td>Neurlynx</td>
			<td>Neuralynx EIB Pins</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymide tubing 250&#181;m</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>822000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rechargable battery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3.7 Lipo battery, 370 mAh. Holds about 6 hours of recording. Smaller or larger battries can be used to reduce the weight or extend recording time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing 0.64 mm</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>806100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel 1.5 mm</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>846000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tap #00-90</td>
			<td></td>
			<td>947-1301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any type of soft petroleum skin protectant can be used here.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wireless electrophysiological recording of neurons by movable tetrodes in freely swimming fish

I meccanismi neurali che regolano il comportamento dei pesci rimangono per lo più sconosciuti, anche se i pesci costituiscono la maggior parte di tutti i vertebrati. La capacità di registrare l'attività cerebrale dei pesci liberamente in movimento farebbe progredire notevolmente la ricerca sulla base neurale del comportamento dei pesci. Inoltre, un controllo preciso della posizione di registrazione nel cervello è fondamentale per studiare l'attività neurale coordinata tra le regioni del cervello dei pesci. Qui, presentiamo una tecnica che registra in modalità wireless dal cervello di pesci che nuotano liberamente mentre controlla per la profondità della posizione di registrazione. Il sistema si basa su un registratore neurale associato a un nuovo impianto compatibile con l'acqua in grado di regolare la posizione di registrazione mediante tetrodi controllati da microdrive. Le capacità del sistema sono illustrate attraverso registrazioni dal telencephalon del pesce rosso.

Durante una sessione di registrazione il pesce rosso nuotava liberamente in un serbatoio d'acqua quadrato mentre l'attività neurale nel suo telencephalon è stata registrata. L'obiettivo di questi esperimenti era quello di studiare come l'attività neurale di singole cellule determina il comportamento del pesce. A tale scopo, l'attività di bloccamento doveva essere identificata nei dati registrati. L'attività cerebrale, durante la registrazione, è stata digitalizzata a 31.250 Hz e il ...

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Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

Viene presentata una nuova tecnica wireless per la registrazione di segnali neurali extracellulari dal cervello di pesci rossi che nuotano liberamente. Il dispositivo di registrazione è composto da due tetrodi, un microdrive, un registratore di dati neurali e una custodia impermeabile. Tutte le parti sono personalizzate, ad eccezione del data logger e del relativo connettore.

Registrazione elettrofisiologica wireless dei neuroni da tetrodi mobili in pesci che nuotano liberamente

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per registrare il segnale neurale extracellulare dal cervello dei pesci che nuotano liberamente. Questo apre la porta allo studio dei meccanismi neuronali al comportamento dei pesci di fine giornata. Questo metodo è valido e impermeabile e quindi consente la registrazione mentre i pesci nuotano liberamente nel serbatoio dell'acqua.Inoltre, la posizione di registrazione può essere controllata dalla micro unità integrata. Tal Zoor-Novoplansky, il nostro tecnico di laboratorio, mi aiuterà a dimostrare questa procedura. Per costruire l'alloggiamento, utilizzare una piastra di ottone con dimensioni di 19 millimetri per 29 millimetri per un millimetro.Con due fessure da 5,5 millimetri sui lati lunghi, perpendicolari al bordo. Le fessure dovrebbero essere a 6,5 millimetri di distanza dal lato stretto. Usando le pinze, piegare l'area tra le fessure sui lati lunghi verso l'interno.Quindi piegare la parte inferiore verso l'interno e il lato superiore verso l'esterno per ottenere l'alloggiamento. Successivamente, utilizzare un bit di aneto di tre millimetri per fare fori nell'alloggiamento del micro azionamento per le viti e saldare i lati dell'alloggiamento. Utilizzare un file circolare fine per creare una piccola fessura semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento con un raggio di 1,5 millimetri.Utilizzando una punta di perforazione di un millimetro fare un foro nella parte posteriore dell'alloggiamento per i tetrodi. Per prima cosa, utilizzare una fresa per interrompere un pezzo a tre pin da una singola striscia di intestazione del perno maschio. Usando le pinze estrarre il perno centrale.Quindi, utilizzare una fresa per tagliare i perni rimanenti a 10 millimetri di lunghezza. Utilizzate una punta di perforazione numero 65 per praticare un foro attraverso il foro del perno centrale e utilizzate un doppio rubinetto zero 99 per praticare un filo. Assemblare il micro azionamento e le piastre in ottone.Inserire una vite attraverso la prima piastra in ottone, attraverso il filo di testata del perno e quindi attraverso la seconda piastra in ottone. Infine, posizionare un dado sulla vite e stringere delicatamente il micro azionamento assemblato. Saldare i perni insieme alle piastre in ottone e saldare il dado insieme alla punta della vite.Successivamente, saldare il micro azionamento nell'alloggiamento del micro azionamento in quattro punti sui lati delle piastre in ottone a micro azionamento. Utilizzando colla epossidica un tubo di acciaio inossidabile lungo sei millimetri alla piccola fessura semicircolare nella parte inferiore dell'alloggiamento del micro azionamento. Incollare un tubo di acciaio inossidabile lungo tre millimetri alla testa del perno in modo che sia allineato con il tubo lungo sei millimetri sull'alloggiamento.Inserire i tubi preparati in silicone e poliimmide nei due tubi in acciaio inossidabile e utilizzare la colla cianoacrilato per incollarli al tubo di furto inossidabile attaccato alla testata del perno. Quindi, avvitare il micro azionamento fino in alto e tagliare i tubi in eccesso dalla parte superiore e inferiore dei due tubi d'acciaio. Successivamente, tagliare due fili d'argento nudi con un diametro di 75 micrometri a una lunghezza di 12 centimetri e saldarli sia alla connessione a terra nella scheda di interfaccia dell'elettrodo che a tutti i canali inutilizzati.Spingere uno dei fili di tungsteno preparati in uno dei fori di una scheda di interfaccia per elettrodi a 16 canali. Posizionare un perno nel foro e premerlo con un paio di pinze. Misurare la resistenza tra il perno e il lato non codificato del filo per verificare la connettività.Ripetere questo processo per tutti i fili preparati, incluso un filo da 50 micrometri per l'elettrodo di riferimento. Quindi raggruppare i fili degli elettrodi in due gruppi di quattro fili ciascuno e rastrerli insieme usando il nastro adesivo all'estremità di ogni filo lasciando il solo filo di riferimento. Tenere la scheda di interfaccia dell'elettrodo sopra un dispositivo di tornitura motorizzato e posizionare l'estremità del nastro del condotto da un gruppo di quattro fili sul dispositivo.Applicare 130 giri in senso orario seguiti da 20 rotazioni in senso antiorario. Quindi, applicare la colla cianoacrilato per coprire il tetrodo. Dopo che la colla si è polimerizzo, tagliare il tetrodo vicino al nastro adesivo.Ripetere questo processo di rotazione, incollaggio e taglio all'altro tetrodo. In primo luogo, collegare l'alloggiamento del micro azionamento alla scatola del logger con due viti millimetri. Infilare i tetrodi e l'elettrodo di riferimento attraverso il foro sul retro dell'alloggiamento del micro azionamento.Infilare i tetrodi attraverso i due tubi in silicone e infilare il filo di tungsteno da 50 micrometri attraverso il tubo di poliimmide. Avvitare la micro immersione fino in fondo e applicare la colla cianoacrilato sulla parte superiore dei tubi per incollare i tetrodi e i fili ai loro tubi e garantire che il movimento sia coerente con il micro azionamento. Avvitare il micro azionamento fino in cima.Applicare petrolio morbido sul tetrodo esposto e sui fili all'interno dell'alloggiamento del micro azionamento per evitare il movimento. Attaccare una finestra inferiore della piastra di petri pretagliata alla parte anteriore dell'alloggiamento del micro azionamento con epossidica, assicurandosi di tenere i fili di terra fuori dalla finestra. Successivamente, applicare il rivestimento vulcanizzante a temperatura ambiente ai tetrodi e ai fili esposti tra il coperchio della scatola del taglialegna e l'alloggiamento del microdrive.Utilizzare forbici affilate per tagliare i tetrodi e il filo di riferimento alla lunghezza desiderata. Dopo questo attaccare la schiuma di polistirolo marcata e trasuda alla scatola. Regola le sue dimensioni in modo che la sua galleggiabilità sia bilanciata quando è sommersa nel bagno d'acqua.Dopo aver anestetizzato il pesce, togliere il pesce dall'acqua e posizionare nel supporto. Utilizzare una spatola sterile per applicare la pasta di lidocaina al cinque per cento sulla pelle sopra il sito di intervento chirurgico designato per 10 minuti. Quindi rimuovere la lidocaina.Utilizzare un bisturi sterile numero 15 per rimuovere la pelle sopra il cranio nella regione designata per l'impianto. Quindi utilizzare un trapano dentale con punte da 0,7 millimetri per praticare quattro fori nel cranio. Applicare la colla cianoacrilato su uno dei fori e inserire immediatamente una vite di un millimetro.Ripetete questo processo per i fori di perforazione rimanenti. Successivamente, utilizzare un brunitore dentale per applicare cemento dentale sulle viti e alla periferia del cranio esposto. Usando il trapano dentale fare un foro che ha un diametro di cinque millimetri sopra la regione cerebrale di interesse.Usa pinzette fini e carta dei tessuti molli per rimuovere il tessuto adiposo tra il cranio e il cervello ed esporre il bersaglio della regione cerebrale facendo attenzione a non danneggiare i grandi vasi sanguigni sotto il cranio. In primo luogo, abbassare l'impianto in modo che gli elettrodi siano inseriti nel cervello mentre la parte inferiore dell'alloggiamento del micro azionamento è vicino al cranio. Inizia ad attaccare l'impianto al cranio applicando una piccola quantità di cemento dentale tra l'alloggiamento e la vite cranica più vicina.Dopo che la prima parte del cemento dentale è stata polimeri, applicare il cemento dentale additiva e chiudere il foro sopra il cranio e l'intero cranio esposto. Dopo aver lavato le branchie del pesce con acqua dolce per svegliarlo, rimuovere il pesce dal supporto e riposizionare di nuovo nel serbatoio di casa. Assicurati che il pesce sia in grado di nuotare liberamente con l'impianto.L'obiettivo di questi esperimenti è studiare come l'attività neurale delle singole cellule codifica il comportamento del pesce. Per raggiungere questo obiettivo un array di tetrodi viene impiantato nel telencefalo del pesce rosso che nuota liberamente che consente di registrare l'attività neurale. L'attività cerebrale durante la registrazione viene digitalizzata a 31.250 Hertz e il passaggio alto filtrato a 300 Hertz dal data logger.Quindi offline viene applicato un filtro pass ban ai segnali e i dati grezzi presorted vengono separati nel canale di ogni tetrodo e nel canale di riferimento. I successivi algoritmi comuni di ordinamento dei picchi vengono utilizzati per caratterizzare l'attività a cella singola. Innanzitutto ogni canale viene filtrato manualmente in base alla soglia minima di ampiezza del picco.Vengono filtrati anche i picchi che sono apparsi in più di un tetrodo o nel canale di riferimento. I picchi rilevati vengono quindi raggruppati manualmente e filtrati in base alla forma, alla lunghezza, all'intervallo inter-spike e all'analisi dei componenti principali. È importante controllare l'integrità dell'impianto prima dell'intervento chirurgico.Il tetrodo può essere controllato utilizzando un misuratore di impedenza standard e la scatola deve essere controllata per verificare la presenza di perdite sott'acqua. Questo metodo può essere modificato per funzionare con molti animali acquatici purché siano abbastanza grandi da contenere il sistema. Ciò consente di studiare il meccanismo neurale che è alla base del loro comportamento.

Research

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Neuroscience

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