Name: visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore
Uploaded: 2019-12-12T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore at JoVE.com

Vi anerkender midler fra Europa-Kommissionen til en MSCA-pris for Horisont 2020 under forslag nummer 675743 (ISPIC). Vi takker Tetje van der Sluis og iris Pardieck for at afprøve protokollen.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Animal eksperimenter Udvalget af LUMSK og blev udført i henhold til dyreforsøg retningslinjer for LUMC i overensstemmelse med retningslinjerne i hollandske og europæiske komitéer.
Bemærk: til eksperimentel opsætning blev C57BL/6-mus subkutant inokuleret på højre flanke med murine tyktarms tumor MC38 i en koncentration på 0,3 x 106 celler/200 μl fosfat-bufferet saltvand (PBS). Efter 10 dage, da tumorer var håndgribelige, blev musene behandlet med PD-L1 blokerende antistoffer (klon MIH-5, 200 μg/mus, intra-peritoneal injektion) eller blev mock-behandlet. Tumorer blev gensendt 3 dage senere efter PD-L1 injektion, forarbejdet ex vivo, og analyseret af cytof Mass flowcytometri ved hjælp af 38 markører13.
1. udstyr og software til data analyse
Bemærk: Brug en computer (Windows 7 eller nyere) og processor I5 på 2,4 GHz eller tilsvarende, installeret hukommelse RAM 6 GB, og 10 GB ledig harddiskplads. R-pakken Cytofast bruger eksisterende funktioner: primært flowcore, pheatmapog ggplot. De kommandolinjer, der skal udføres i R, er inkluderet i protokollen. Ressourcen for R-instruktioner kan findes på <a href="https://education.rstudio.com/" target="_blank">https://Education.rstudio.com/</a>.
<ol><li>Hvis du vil installere Cytofast -pakken, skal du starte R (version "3,6") og installere bioconductor version 3,9 ved at indtaste følgende kode: Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE)) Installer. pakker ("BiocManager") BiocManager:: Installer ("cytofast")</li>
	<li>Sørg for, at pakken er indlæst i det ønskede miljø ved at køre følgende: bibliotek (cytofast)</li>
</ol>2. oprettelse af klynger
Bemærk: for at fremvise de to klynge metoder cytosplore og Flowsom med CYTOFAST, NK celler (CD161+) i tumor mikro-miljø 3 dage efter PD-L1 behandling analyseres.
<ol><li>Klyngedannelse udført afCytosplore
	<ol><li>Efter download og installation af Cytosplore, hostet på < www. Cytosplore. org >, uploade. FCS filer (supplerende filer 1.1 – 1.8 [cytosplore input files]) ved at klikke på fil | Åbn FCS-fil (er) i Cytosplore. Tilføj et entydigt eksempeltag som kanal ved at klikke på Tilføj entydigt eksempeltag som kanal, når du bliver bedt om det, og vælg en cofaktor for hyperbolske ARCSINH-transformation (standard er 5).</li>
		<li>Vælg Kør H-sne, Kør et hsne-niveau på 3, og vent på, at kortet genereres. Bemærk: dette trin kan kræve et stykke tid, afhængigt af antallet af analyserede celler og niveauet af hsne valgt.</li>
		<li>På det første HSNE-niveau kontrolleres de celler, der er positive for CD161. Vælg CD161+ cellerne, og højreklik på Zoom ind i Markeringen. På andet niveau skal du gentage proceduren for at nå det tredje niveau med kun CD161+ hændelser.</li>
		<li>Når det sidste tSNE-kort er genereret, Gem de klynger, der er defineret af Cytosplore , ved at højreklikke på tsne-kortet og vælge Gem klynger. Vælg den mappe af output-filer, som anmodet af Cytosplore og Bemærk denne placering, fordi denne mappe vil derefter blive brugt til at indlæse. FCS filer i R. Bemærk: antallet af undergrupper kan ændres manuelt ved at ændre Sigma-værdien. Sigma-værdien indstilles som standard til 30. det faktiske antal undersæt afhænger dog af input. Her, Cytosplore opdaget 10 forskellige delsæt, med hver fil, der repræsenterer en delmængde.</li>
		<li>Brug et simpelt navn (kun tegn), når du omdøber output-filer, som vil gøre identifikation og yderligere håndtering lettere. Gem output filerne ved at vælge Gem. Bemærk: efter at have gemt, en mappe er ved at blive skabt af cytosplore med. FCS filer, med hver fil, der svarer til de identificerede klynger i cytosplore. Det næste skridt vil være at indlæse filerne i R ved hjælp af Cytofast. Her leveres de genererede output filer i supplerende filer 2.1 – 2.10 (cytosplore output files).</li>
		<li>Indlæs output filer genereret af Cytosplore i R med den udpegede funktion: readCytosploreFCS. dirFCS <-"C:\brugere\\username\\desktop\\tostudy" cfData <-readCytosploreFCS (dir = dirFCS, colNames = "beskrivelse")</li>
		<li>Rengør dataene ved at fjerne nogle parametre som "tid" og "baggrund". Kontroller placeringen af kolonnen, der er relateret til dens unødvendige parametre, og fjern den fra matrixen. kolnames (cfData@expr) cfData@expr <-cfData@expr [,-c (3, 4, 6, 8:10, 46:49, 51:54)] Bemærk: de unødvendige kolonner kan ses ved at læse kolonnenavnene på den genererede matrix. Ved at køre colnames (cfData@expr) endnu en gang, Sørg for, at kun de ønskede parametre er opnået.</li>
		<li>Re-order markører, så Lineage markører vises først, efterfulgt af funktionelle markører. cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 3, 35, 36, 31, 9, 10, 18, 8, 37, 20, 29, 40, 5, 30, 33, 11, 34, 14, 19, 32, 28, 6, 7, 4, 12, 13, 17, 16, 15, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 38, 39)] Bemærk: trin 2.1.8 er valgfrit.</li>
		<li>Link meta datafilen til de genererede data fra Cytosplore ved at uploade regnearkmetfilen indeholdende kliniske oplysninger (supplerende fil 3). Library (readxl) meta <-read_excel ("C:\brugere\brugernavn\\skriveprogrammer\\ sample_id. xlsx") cfData@samples <-data. frame (meta) Bemærk: den klyngedannelse, der udføres af cytosplore , er nu færdig. En alternativ klynge indstilling til Cytosplore er flowsom og er beskrevet i afsnit 2,2. Når en af de to klynge trin udføres, skal du fortsætte med visualiserings trinnet (afsnit 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Klyngedannelse udført afFlowSOM
	<ol><li>Først installere flowsom i R ved at køre følgende kommando: Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE)) Installer. pakker ("BiocManager") BiocManager:: install ("FlowSOM") bibliotek (FlowSOM)</li>
		<li>Installer flowCore-pakken ved hjælp af en lignende metode, og Indlæs den i miljøet ved at køre følgende: Hvis (! requireNamespace ("BiocManager", stille = TRUE)) Installer. pakker ("BiocManager") BiocManager:: Installer ("flowCore") bibliotek (FlowSOM)</li>
		<li>Indlæs de rå data, der findes i supplerende filer 4.1 – 4.8 (FCS flowsom input), som tidligere blev GATED på CD161 + events, i R med Read. flowset-funktionen. fcs_raw <-Læs. flowSet (Path = "C:\brugere\brugernavn\\desktop\\tocluster", mønster = ". FCS", transformation = falsk, truncate_max_range = falsk, Seed = 123)</li>
		<li>Vælg de relevante biologiske markører (Fjern "baggrund" eller "tid") ved at vælge de rigtige kolonner og omdanne dataene på en arcsinh5 måde som vist i koden nedenfor (her fjernes kolonne 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, som ikke svarer til nogen biologisk markør). Anvend en cofaktor på 5 som tidligere anvendt med cytosploreved at vælge cofaktor = 5 i funktionen nedenfor. fcs_raw <-fsApply (fcs_raw, funktion (x, cofactor = 5) { colnames (x) <-fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC udtryk <-exprs (x) udtryk <-asinh (udtryk [,-c (1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51)]/cofactor) exprs (x) <-udtryk Return (x)})</li>
		<li>Klynge dataene ved hjælp af funktionen Flowsom . Hvis du vil sammenligne flowsom og cytosplore, skal du vælge at klynge dataene i ti delsæt som det output, som tidligere blev givet ved cytosplore. fsom <-FlowSOM (fcs_raw, Transformer funktion = falsk, skala = falsk, skaleret. Center = falsk, skaleret. Scale = FALSE, Silent = FALSE, colsToUse = c (1:37), nClus = 10, maxMeta = 10, vigtighed = NULL, Seed = 123) Bemærk: Dette kan ændres manuelt af brugeren.</li>
		<li>Tildel hver celle til den identificerede delmængde og eksempel-ID. subset_id <-as. Factor (fsom $ FlowSOM $ kort $ tilknytning [, 1]) niveauer (subset_id) <-fsom $ metaclustering hoved (subset_id)</li>
		<li>Indlæs metadatafilen i R (findes i den supplerende fil 5), der indeholder gruppe tildelingen, og Sammenkæd den med. FCS-filerne. sampleid <-read_excel ("C:\brugere\brugernavn\\skriveprogrammer\\ sample_id. xlsx") sampleid <-na. udelade (sampleid) sampleid $ sampleID <-as. Factor (sampleid $ sampleID) sampleid $ gruppe <-as. Factor (sampleid $ gruppe) sampleid $ CSPLR_ST <-as. Factor (sampleid $ CSPLR_ST) sampleid <-as. data. frame (sampleid) navne (sampleid) [3] <-"sampleID" sampleID <-lapply (fsom $ FlowSOM $ metaData, funktion (x) {rep (x [1], hver = længde (x [1]: x [2]))}) attr (sampleID, ' Names ') <-NULL sampleID <-as. Factor (unlist (sampleID)) sampleid <-data. frame (sampleid) niveauer (sampleID) <-paste ("ID", 1: Dim (sampleid) [1], sep = "_") DF <-data. frame (subset_id, sampleID, fsom $ FlowSOM $ data [, c (1:37)]) Omdøb <-data. frame (colpar = fcs_raw [[1]] @parameters @data $ DESC) colnames (DF) <-c ("clusterID", "sampleID", Omdøb $ colpar [c (1:37)]) DF $ clusterID <-as. Factor (DF $ clusterID) DF $ sampleID <-as. Factor (DF $ sampleID)</li>
		<li>Opret en cfList baseret på dataframe opnået fra flowsom ved at køre følgende script: cfData <-cfList (samples = sampleid, udtryk = DF)</li>
		<li>Re-order markører til at fremstå på samme måde som output fra Cytosplore analyse. cfData@expr <-cfData@expr [, c (1, 2, 34, 36, 37, 10, 23, 24, 31, 22, 38, 15, 8, 3, 27, 9, 11, 28, 35, 26, 14, 33, 17, 20, 21, 18, 25, 29, 13, 30, 12, 16, 32, 4, 5, 6, 7, 19, 39)] Bemærk: klyngedannelse af flowsom er nu færdig. Dernæst udføre visualisering af klyngedannelse output.</li>
	</ol></li>
</ol>3. visualisering: analyse af klyngedannelse efter behandling
Bemærk: dette trin er en metode, der er fælles for begge klynge metoder. Derfor kan det udføres efter klyngedannelse enten med Flowsom eller cytosplore.
<ol><li>Før du opretter Heatmaps, generere tælle tabellen pr prøve ved hjælp af funktionen Cellcount som vist i koden nedenfor. Da nogle klynger indeholder færre celler end andre, skalerer dataene pr. klynge ved at angive "Scale = TRUE" inde i funktionens celletal, så spredningen blandt prøverne let kan ses. cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skalering = TRUE) Bemærk: dataene kan nu visualiseres.</li>
	<li>Visualiser med heatmap. Bemærk: en af de vigtigste funktioner i denne pakke er cytoHeatmaps, som bruges til at visualisere Fænotypen af de oprettede klynger samt deres heterogenitet med hensyn til prøverne. cytoHeatmaps (cfData, Group = "gruppe", Legend = TRUE)</li>
	<li>Visualisering med Boxplots Bemærk: data kan repræsenteres på en kvantitativ måde ved at kalde funktionen cytoBoxplots. Outputtet af denne funktion repræsenterer andelen af hver prøve for hver klynge.<ol>
<li>Generer celletal som udført i trin 3,1, men skalerer ikke dataene for at opnå hyppigheden af hver klynge. cfData <-cellCounts (cfData, frekvens = TRUE, skalering = falsk) cytoBoxplots (cfData, gruppe = "gruppe")</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualisering med signal histogram for median intensitet Bemærk: dataene kan også visualiseres ved at repræsentere median intensitet signal histogrammet.<ol>
<li>Visualiser udtryks intensiteten for tre markører: CD45, CD11c og CD54.</li>
		<li>Kontroller navnene på de ønskede markører ved at kalde følgende linje. Noter mærkenavnene, og Medtag det i funktionen msiPlot. navne (cfData@expr) Bemærk: her FOKUSERES på CD45, CD11C og CD54. Kontroller den nøjagtige stavning af mærkerne, og Juster om nødvendigt: msiPlot (cfData, markører = c ("89Y_CD45", "167Er_CD11c", "164Dy_CD54"), byGroup = ' gruppe ')</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Anchang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+cellular+hierarchy+inference+of+single-cell+data+using+SPADE.">Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).</li><li>Van Gassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlowSOM:+Using+self-organizing+maps+for+visualization+and+interpretation+of+cytometry+data.">FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data.</a> Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).</li><li>Levine, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Hotelling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+complex+of+statistical+variables+into+principal+components.">Analysis of a complex of statistical variables into principal components.</a> Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. , (2008).</li><li>Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Stochastic+Neighbor+Embedding.">Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding.</a> Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensionality+reduction+for+visualizing+single-cell+data+using+UMAP.">Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP.</a> Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).</li><li>Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+maps+for+high-dimensional+single-cell+analysis+of+differentiation+data.">Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data.</a> Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).</li><li>Beyrend, G., Stam, K., H&#246;llt, T., Ossendorp, F., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofast:+A+workflow+for+visual+and+quantitative+analysis+of+flow+and+mass+cytometry+data+to+discover+immune+signatures+and+correlations.">Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).</li><li>Beyrend, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+blockade+engages+tumor-infiltrating+lymphocytes+to+co-express+targetable+activating+and+inhibitory+receptors.">PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).</li><li>Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+test+for+groups+of+genes:+testing+association+with+a+clinical+outcome.">A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome.</a> Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Cytofast er et hurtigt beregningsmæssige værktøj, der giver en hurtig og global udforskning af cytometriske data ved at fremhæve og kvantificere behandlings specifikke celle undersæt. Den beskrevne protokol har til formål at viderebehandle klynge analyser med Cytosplore eller flowsom. Andre analyseværktøjer til klyngedannelse er velegnede til cytofast, men dette kræver brug af cytofast for at tildele hver celle til en delmængde. Cytofaster imidlertid ikke en klynge metode, og kræver derfor klynge procedurer før brug.
Den analyse, der blev udført her, viste, at visse CD161+ NK-celle undersæt i Tumorens mikromiljø var følsomme over for en PD-L1-blokade. Dette fremgik af ændringer i deres fænotype og overflod, som blev observeret ved hjælp af både Cytosplore og flowsom som klyngedannelse metoder. Begge metoder udmærker de vigtigste NK celle klynge (CD11b+ NKG2A+) med lidt forskellige frekvenser (15% – 20% for cytosplore, 30% – 40% for flowsom). Forskellene i overflod og denne tilnærmelse påvirkede ikke det globale mønster, fordi begge dendrogrammer vises i de rigtige paneler i figur 2 og figur 3 viste lignende resultater. Ved at bruge Cytofaster det således muligt (uafhængigt af den valgte klynge metode) at UDSKILLER PD-L1-behandlede og ubehandlede mus baseret på analyser af NK-celle klynge fænotype og overflod.
Afhængigt af de registrerede parametre er der behov for ændringer af protokollen. Specifikt, visse parametre såsom tid og baggrund skal fjernes, mens du udfører klyngedannelse analyse. Desuden er det vigtigt, at hver celle er tildelt til en delmængde. Funktionen cfData vil blot tilføje RAW-celletal pr. klynge pr. prøve i cfList. Fra dette trin kan cytoheatmap bygges som forklaret i afsnit 3.
Cytofast er med held blevet brugt som et visualiserings-og kvantificerings værktøj til at sammenligne forskellige klynge metoder13. Denne R-pakke er også kompatibel med avancerede funktioner, såsom globaltest14, som kan teste foreninger mellem grupper af klynger ved hjælp af kliniske variabler. I fremtiden kan det globale test værktøj og andre algoritmer integreres med cytofast for mere dybtgående visualisering og kvantificering.

Masse cytometri (cytometri ved time-of-Flight, eller CyTOF) giver mulighed for påvisning af en bred vifte af intracellulære eller ekstracellulære biomarkører i millioner af enkeltceller. Den høje dimensionelle karakter af massecytometri data nødvendiggør visse analyseværktøjer, såsom celle klynge teknikker som spade1, flowmaps2, flowsom3, phenograph4, VorteX5og stilladser kort6. Desuden er forskellige dimensionalitets reduktions baserede teknikker blevet udviklet (dvs. vigtigste komponent analyse [PCA]7, t-distribueret stokastisk nabo indlejring [t-sne]8, hierarkisk stokastisk nabo indlejring [hsne]9, ensartet manifold tilnærmelse og projektion [UMAP]10, og diffusion Maps11) for at forbedre hastigheden, fortolkning og visualisering af High-dimensionelle datasæt.
Downstream-analyse af højdimensionale flow og masse cytometriske data mangler ofte automatiske processer til at udføre statistiske tests på klynge frekvens og forbindelser med kliniske resultater. Tidligere udviklede vi en R-baseret arbejdsgang kendt som cytofast12, som giver mulighed for visuelle og kvantitative downstream analyser af klyngedannelse teknikker ved cytosplore eller flowsom.
Den protokol, der er beskrevet her, tydeliggør brugen af Cytofast i R og viser, hvordan man genererer kvantitative og kvalitative Heatmaps og grafer. Desuden letter det bestemmelsen af forbindelser mellem observerede immun fænotyper og kliniske resultater. Denne rapport beskriver også analysen af et specifikt massecytometri-datasæt ved hjælp af to forskellige klynge procedurer: Flowsom og cytosplore. Ved at bruge Cytofast med begge klynge metoder er det tilsvarende vist, at aktiverings Fænotypen af NK-celler påvirkes af PD-L1-immun kontrolpunkts blokade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore

Kompleksiteten af data genereret af massecytometri har nødvendiggjort nye værktøjer til hurtigt at visualisere analytiske resultater. Klyngedannelse metoder som Cytosplore eller flowsom bruges til visualisering og identifikation af celle klynger. For downstream analyse, en nyudviklet R-pakke, Cytofast, kan generere en hurtig visualisering af resultater fra klyngedannelse metoder. Cytofast tager hensyn til fænotypiske karakterisering af celle klynger, beregner celle klyngens overflod, derefter kvantitativt sammenlignes grupper. Denne protokol forklarer anvendelser af Cytofast til anvendelse af massecytometri data baseret på graduering af immunsystemet i tumor mikromiljø (dvs. den naturlige Killer [NK] celle respons) på tumor udfordring efterfulgt af immunterapi (PD-L1 blokade). Påvisning af nytten af Cytofast med Flowsom og cytosplore er vist. Cytofast genererer hurtigt visuelle repræsentationer af gruppe relaterede immuncelle klynger og korrelationer med immunsystemets sammensætning. Der observeres forskelle i klynge analysen, men adskillelsen mellem grupperne er synlig med begge klynge metoder. Cytofast viser visuelt de mønstre INDUCERET af PD-L1-behandling, der omfatter en højere overflod af aktiverede NK-celle undersæt, hvilket udtrykker en højere intensitet af aktiverings markører (dvs., CD54 eller CD11c).

Workflow Cytofast (figur 1) er beregnet til at give et kvantitativt og kvalitativt overblik over de data, der oprindelig blev grupperet efter analyse software (f. eks. Flowsom eller cytosplore). Cytofast kører flere mulige udgange, herunder heatmap for alle klynger identificeret i analysen og baseret på markør udtryk (figur 2 og figur 3). Dendrogram øverst repræsenterer den hierarkiske lighed mellem de identificerede klynger. Det øverste panel viser en anden heatmap, der viser det relative antal af tilsvarende delmængder i hver prøve. Dendrogram til højre viser ligheden mellem prøverne og er baseret på hierarkisk klyngedannelse udført på euklidisk afstanden mellem prøverne. De kombinerede varmekort vises for Flowsom efterfulgt af cytofast i figur 2 og for Cytosplore efterfulgt af cytofast i figur 3. Cytofast kan også bruges til at præsentere data kvantitativt og vise resultaterne i Boxplots (ved hjælp af cytoboxplots funktion), som vist i figur 4 og figur 5.
Lignende klynger blev fundet mellem de to forskellige metoder (f. eks., klynge 8 fra Cytosplore svarer til klynge 10 fra flowsom), og co-ekspression af nogle hæmmende markører som PD-1 og lag-3 var stadig synlige i begge metoder). Begge klynge metoder tillod diskrimination mellem PD-L1 vs. PBS-behandlede mus. I modsætning hertil kan der fremhæves visse forskelle mellem de to metoder. Flowsom identificerer 2 klynger (MHC-II+), hvorimod cytosplore kun viser én klynge (MHC-II+ Dim). Dette skyldes den indledende gating strategi, hvor NK celler blev manuelt gated på CD161+ celler, derefter yderligere behandlet af flowsom. Cytosplore indhegnet imidlertid automatisk celler fra CD45+- populationen på det første hsne-niveau, som derefter blev grupperet i et højere hierarkisk niveau. Således, Cytosplore defineret NK celle undersæt mere præcist end hvordan manuel gating FOKUSERET på CD161. Ikke desto mindre blev de hierarkiske klynger af prøverne bevaret, som vist i dendrogram til højre, hvilket indikerer, at adskillelsen mellem de to grupper (PD-L1 og PBS) ikke var afhængig af den valgte klynge metode.
Antallet af klynger kan defineres manuelt ved hjælp af begge metoder. Cytofast gør det muligt for brugeren at vurdere heterogeniteten af deres data og kan give indsigt i, hvordan man vælger det antal klynger, som dataene skal opdeles i. Andre funktioner er inkluderet i Cytofast -pakken, såsom funktionen msiplot (trin 3.4.2), der viser den mediane signalintensitet (MSI) for hvert mærke pr. gruppe (figur 6 og figur 7). Denne funktion gør det muligt at opdage globale ændringer, såsom stigninger i ekspression af CD54 eller CD11c i NK-cellerne i den PD-L1-behandlede gruppe. Valgfrie funktioner kan inkorporeres i Cytofast -pakken, såsom visning af data i bjælkediagrammer og andre metoder til data repræsentation. Sidstnævnte kræver tilsætning af ggplot værktøjer, som kan genereres af R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig01.jpg"> Figur 1: workflow af Cytofast -pakken. Dataene blev genereret af massecytometri fra en tumor 3 dage efter behandling med immunterapi eller venstre ubehandlet. To forskellige klyngedannelse teknikker blev sammenlignet: cytosplore og flowsom. Cytofast blev brugt til at visualisere forskelle mellem de to teknikker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig02.jpg"> Figur 2: klynge oversigt og klynge tæthed pr. gruppe som analyseret af Cytofast efter cytosplore. Heatmap af alle NK celle klynger (CD161+ celler defineret automatisk af cytosplore), som blev identificeret 3 dage efter immunterapi (PD-L1). De viste data er baseret på Cytosplinklynge dannelse og poolet fra de ubehandlede og PD-L1-behandlede grupper. Niveauer af ArcSinh5-transformerede udtryks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panel repræsenteres den relative overflod af hver prøve af den grøn-til-lilla skala. Dendrogram til højre repræsenterer ligheden mellem prøver baseret på delmængde frekvenser. Frekvens skalaen repræsenterer spredningen af middelværdien. En lav eller en høj frekvens repræsenteres af henholdsvis en grøn eller lilla farve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig02large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig03.jpg"> Figur 3: klynge oversigt og klynge tæthed pr. gruppe som analyseret af Cytofast efter flowsom. Heatmap af alle NK celle klynger (præ-gated på CD161+ hændelser), som blev identificeret 3 dage efter immunterapi (PD-L1). De viste data er baseret på flowsom -klyngedannelse og poolet fra de ubehandlede og PD-L1-behandlede grupper. Niveauer af ArcSinh5-transformerede udtryks markør vises på en regnbue skala. På det nederste panel repræsenteres den relative overflod af hver prøve af den grøn-til-lilla skala. Dendrogram til højre repræsenterer ligheden mellem prøver baseret på delmængde frekvenser. Frekvens skalaen repræsenterer spredningen af middelværdien. En lav eller en høj frekvens repræsenteres af henholdsvis en grøn eller lilla farve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig03large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig04.jpg"> Figur 4: Cytofast repræsentation med Boxplots af klynger defineret af cytosplore. Hyppigheden af hver klynge er repræsenteret i en boxplot, opdelt i de to grupper (PBS og PD-L1). En enkelt prik svarer til én mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig05.jpg"> Figur 5: Cytofast repræsentation med Boxplots af klynger defineret af flowsom. Hyppigheden af hver klynge er repræsenteret i en boxplot, opdelt i de to grupper (PBS og PD-L1). En enkelt prik svarer til én mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig06.jpg"> Figur 6: fordeling af signalintensitet plot fra NK celler automatisk gated af Cytosplore. Fordelingen af signal intensiteterne vises i et histogram for tre specifikke markører: CD45, CD11c og CD54. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig07.jpg"> Figur 7: fordeling af signalintensitet plot fra NK celler automatisk gated af flowsom. Fordeling af signal intensiteter vises i et histogram for tre specifikke markører: CD45, CD11c og CD54, adskilt af gruppe PBS og PD-L1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig7large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende filer 1.1 – 1.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_1.1-1.8.zip" target="_blank">Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).</a>
Supplerende filer 2.1 – 2.10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_2.1-2.10.zip" target="_blank">Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).</a>
Supplerende fil 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_3_sample_id_Cytosplore.xlsx.zip" target="_blank">Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).</a>
Supplerende filer 4.1 – 4.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_4.1-4.8.zip" target="_blank">Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).</a>
Supplerende fil 5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_5._sample_id_FlowSOM.xlsx.zip" target="_blank">Klik venligst her for at se denne fil (Højreklik for at downloade).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore at JoVE.com

Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore

Cytofast er et visualiseringsværktøj, der bruges til at analysere output fra klyngedannelse. Cytofast kan bruges til at sammenligne to metoder til klyngedannelse: Flowsom og cytosplore. Cytofast kan hurtigt generere en kvantitativ og kvalitativ oversigt over massecytometri data og fremhæve de vigtigste forskelle mellem forskellige klynge algoritmer.

Visualisering og kvantificering af Højdimensionale cytometri-data ved hjælp af Cytofast og upstream-klynge metoderne FlowSOM og Cytosplore

The complexity of data generated by mass cytometry has necessitated new tools to rapidly visualize analytic outcomes. Clustering methods like Cytosplore ...

De data, der genereres af massecytometri, er komplekse og skal visualiseres på en effektiv og enkel måde. Cytofast er en metode, der fremhæver immunologiske mønstre i immuncellepopulationen og bestemmer celledelmængder, der er knyttet til kliniske behandlinger eller forsøgsgrupper. Cytofast kan anvendes efter enhver krystallisering metode som FlowSOM eller Cytosplore.Det vil give dig mulighed for at opdage en celle delmængde, som er knyttet til klinisk behandling eller en eksperimentel gruppe. Med denne metode vil du kunne se det immunologiske overblik over dataene på en kvantitativ måde. Begynd med at oprette klynger med enten Cytosplore eller FlowSOM.Hvis du bruger Cytosplore, skal du uploade FCS-filerne ved at klikke på Filer og åbne FCS-filer. Vælg derefter en cofaktor til Hyperbolic ArcSinh transformation, når du bliver bedt om det, og klik på tilføj unikt eksempeltag som kanal. Vælg kør HSNE for at køre et HSNE-niveau på tre og vente på, at kortet genereres.På det første HSNE-niveau skal du kontrollere de celler, der er positive for CD161, ved at markere cd161-positive celler og højreklikke på zoom ind på markeringen. På det andet niveau skal du gentage proceduren for at nå det tredje niveau med kun CD161 positive hændelser. Når det sidste TSNE-kort er genereret, skal du gemme de klynger, der er defineret af Cytosplore, ved at højreklikke på kortet og vælge gem klynger.Vælg mappen med outputfiler som bedt af Cytosplore og bemærk denne placering, fordi det senere vil blive brugt til at indlæse FSC filer i R.Brug en simpel tegn kun navn, når omdøbning af output-filer, som vil gøre identifikation og yderligere håndtering lettere og vælge gem. Læg filerne i R med den angivne funktion readcytosploreFCS. Hvis du vil rense dataene, skal du fjerne nogle parametre, f.eks.Derefter skal du omarrangere mærkerne, så afstamningsmærker vises først efterfulgt af funktionelle mærker. Sammenkæd metadatafilen med de genererede data fra Cytosplore ved at uploade regnearkets metafil, der indeholder kliniske oplysninger. Hvis du vil udføre klyngedannelse af FlowSOM, skal du indlæse de rådata, der tidligere var gated på CD161 positive hændelser i R med læsningen.flowSet funktion. Vælg de relevante biologiske markører ved at vælge de korrekte kolonner og transformere dataene på en ArcSinh5-måde. Anvend en cofaktor på fem ved at vælge cofacter=5 i funktionen.Gruppere dataene ved hjælp af FlowSOM-funktionen, og sammenlign FlwoSOM og Cytosplore ved at vælge at gruppere dataene i 10 delmængder på samme måde som det output, der tidligere blev givet af Cytosplore. Tildel derefter hver celle til det identificerede undersæt, og eksempel-id.Indlæs metadatafilen i R, der indeholder gruppetildelingen, og knyt den til FCS-filerne ved hjælp af koden fra tekstmanuskriptet. Opret en CF-liste baseret på den dataframe, der er hentet fra FlowSOM.Bestil derefter markørerne, så de vises på samme måde som outputtet fra Cytosplore-analysen. Før du opretter varmetilknytningerne, skal du generere tælletabellen pr. prøve ved hjælp af funktionscellenCount. Da nogle klynger indeholder færre celler end andre, skaleres dataene pr. klynge ved at angive skal=sand inde i funktionen, hvilket gør det nemt at se spredningen mellem prøverne.Visualiser dataene med et varmekort, og visualiser derefter med kasseområder ved at generere celletallet, men ikke skalere dataene for at få hyppigheden af hver klynge. Endelig visualisere udtrykket intensiteten af CD45, CD11c og CD54 mærker ved at notere markør navne og medtage dem i MSI plot funktion. Cytofast kører flere mulige udgange, herunder varmekortet over alle klynger identificeret i analysen og baseret på markørudtryk.Dendrogram øverst repræsenterer den hierarkiske lighed mellem de identificerede klynger. Det øverste panel viser et andet varmekort, der viser den relative mængde af tilsvarende undersæt i hver prøve. I mellemtiden viser dendrogram til højre ligheden mellem prøver baseret på delmængdefrekvenser, der viser, at fænotypen af naturlige dræberceller er formet af PD-L1-behandling tre dage efter injektionen.De kombinerede varmekort kan fås for FlowSOM efterfulgt af Cytofast og for Cytosplore efterfulgt af Cytofast. Cytofast kan også bruges til at præsentere dataene kvantitativt og vise resultaterne i kasseområder. En anden funktion, der er inkluderet i Cytofast pakken er MSI plot funktion, der viser median signalintensitet plot af hver markør pr gruppe.Denne funktion gør det muligt at opdage globale ændringer såsom stigninger i udtrykket af CD54 eller CD11c i naturlige dræberceller i PD-L1 behandlet gruppe. Denne teknik er en hurtig måde at visualisere og kvantificere data og kan bruges til at opdage nye cellulære reaktioner efter terapi. Efter denne metode kan den globale testpakke i R bruges til at teste en gruppe kovariater for tilknytning til responsvariabler.Dette vil vise sammenhængen mellem de enkelte delmængder og det kliniske resultat.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Brug af Image Cytometry til kvantificering af patogene svampe i forbindelse med Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: High-throughput Kvantificering af Colony vækst og Latenstid

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolation, karakterisering og rensning af makrofager fra væv ramt af fedme-relaterede Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

ExCYT: En grafisk brugergrænseflade til at strømline analyse af høj-dimensionelle flowcytometri Data

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Flerfarvet Flow flowcytometri-baserede kvantificering af mitokondrier og lysosomer i T celler

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Visualisering, kvantificering og kortlægning af immuncellepopulationer i tumormikromiljøet

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...