Name: visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore
Uploaded: 2019-12-12T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore at JoVE.com

Мы признаем финансирование европейской комиссией премии H2020 MSCA по предложению No 675743 (ISPIC). Мы благодарим Тетье ван дер Слуис и Ирис Пардьек за тестирование протокола.

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментам на животных LUMC и были выполнены в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных LUMC в соответствии с руководящими принципами голландских и европейских комитетов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментальной настройки, C57BL/6 мышей были подкожно привиты на правом фланге с опухолью толстой кишки MC38 при концентрации 0,3 х 106 клеток / 200 Л фосфат-буферного солима (PBS). Через 10 дней, когда опухоли были ощутимы, мышей лечили PD-L1 блокирующими антителами (клон MIH-5, 200 мкг/мышь, внутриперитонеальная инъекция) или подвергались инсценировке. Опухоли были resected 3 дня спустя после инъекции PD-L1, обработанные ex vivo, и проанализированы CyTOF массовой цитометрии с использованием 38 маркеров13.
1. Оборудование и программное обеспечение для анализа данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте компьютер (Windows 7 или новее) и процессор I5 на 2,4 ГГц или эквивалент, установленная память оперативной памяти 6 ГБ, и 10 ГБ свободного пространства жесткого диска. Пакет R Cytofast использует существующие функции: в основном flowCore, pheatmapи ggplot. Командные строки, которые будут выполняться в R, включены в протокол. Ресурс для Инструкций R можно найти по <a href="https://education.rstudio.com/" target="_blank">адресу https://education.rstudio.com/</a>.
<ol><li>Для установки пакета Cytofast запустите R (версия "3.6") и установите версию Bioconductor 3.9, введя следующий код: если (!requireNamespace ("BiocManager", тихо и правда)) install.packages ("BiocManager") BiocManager::установить ("цитофаст")</li>
	<li>Убедитесь, что пакет загружается в нужную среду, запустив следующее: библиотека (цитофаст)</li>
</ol>2. Создание кластеров
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продемонстрировать два метода кластеризации Cytosplore и FlowSOM с Cytofast, НК-клетки (CD161)в микро-окружающей среды опухоли 3 дня после лечения PD-L1 анализируются.
<ol><li>Кластеризация в исполненииCytosplore
	<ol><li>После загрузки и установки Cytosplore, размещенные на lt;www. Cytosplore.org'gt;, загрузить файлы .fcs(Дополнительные файлы 1.1-1.8 «Cytosplore входные файлы»), нажав файл Открыть файл FCS (ы) в Cytosplore. Добавьте уникальный тег образца в качестве канала, нажав Добавить уникальный тег образца в качестве канала, когда предложено и выбрать кофактор для гиперболических arcsinh преобразования (по умолчанию 5).</li>
		<li>Выберите Run H-SNE,запустите уровень HSNE 3 и дождитесь сгенерирования карты. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может потребовать некоторого времени, в зависимости от количества проанализированных ячеек и уровня hSNE выбран.</li>
		<li>На первом уровне HSNE проверьте клетки, которые являются положительными для CD161. Выберите ячейки CD161и нажмите кнопку Увеличить в выборе. На втором уровне повторите процедуру, чтобы достичь третьего уровня только с событиями CD161.</li>
		<li>После того, как последняя карта tSNE генерируется, сохраните кластеры, определенные Cytosplore, нажав на карту tSNE, и выберите Сохранить кластеры. Выберите каталог выводных файлов по инициативе Cytosplore и обратите внимание на это местоположение, потому что этот каталог будет затем использоваться для загрузки файлов .fcs в R. ПРИМЕЧАНИЕ: Количество подмножеств может быть изменено вручную, изменив значение сигмы. Значение сигмы устанавливается по умолчанию на уровне 30; однако фактическое количество подмножеств зависит от ввода. Здесь Cytosplore обнаружил 10 различных подмножеств, каждый из которых представлял один подмножество.</li>
		<li>Используйте простое имя (только символы) при переименовании выходных файлов, что упростит идентификацию и дальнейшую обработку. Сохранить выводные файлы, выбрав Сохранить. ПРИМЕЧАНИЕ: После сохранения, папка создается Cytosplore с файлами .fcs, с каждым файлом, соответствующим идентифицированным кластерам в Cytosplore. Следующим шагом будет загрузка файлов в R с помощью Cytofast. Здесь генерируемые выходные файлы предоставляются в дополнительных файлах 2.1-2.10 (выводные файлы Cytosplore).</li>
		<li>Загрузите выходные файлы, генерируемые Cytosplore в R с назначенной функцией: readCytosploreFCS. dirFCS злт;- "C: (Пользователи) cfData злт;- readCytosploreFCS (дир-фюрер, colNames и "описание")</li>
		<li>Очистите данные, удалив некоторые параметры, такие как "Время" и "Фон". Проверьте положение столбца, связанное с ее ненужными параметрами, и удалите его из матрицы. colnames (cfData@expr) cfData@expr :lt;- cfData@expr,-c (3,4,6,8:10,46:49,51:54)) ПРИМЕЧАНИЕ: Ненужные столбцы можно увидеть, читая названия столбцов сгенерированной матрицы. Запуская colnames (cfData@expr) еще раз, убедитесь, что только желаемые параметры получены.</li>
		<li>Повторно закажите маркеры таким образом, чтобы сначала отображались маркеры линии, а затем функциональные маркеры. cfData@expr йlt;- cfData@expr,c (1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20, 29,40,5,30,33,11,34,14,19, 32,28,6,7,4,12,13,17,16,15, 21,22,24,25,26,27,38,39)] ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2.1.8 не является обязательным.</li>
		<li>Свяжите файл мета данных с генерируемыми данными из Cytosplore, загрузив метафайл электронной таблицы, содержащий клиническую информацию(Дополнительный файл 3). библиотека (readxl) мета-лт; - read_excel ("C:"Пользователи (пользователя sample_id) cfData@samples злт;- data.frame (мета) ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеризация, выполняемая Cytosplore, теперь закончена. Альтернативным вариантом кластеризации Cytosplore является FlowSOM и описан в разделе 2.2. После выполнения одного из двух этапов кластеризации приступите к этапу визуализации (раздел 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Кластеризация в исполненииFlowSOM
	<ol><li>Сначала установите FlowSOM в R, запустив следующую команду: если (!requireNamespace ("BiocManager", тихо и правда)) install.packages ("BiocManager") BiocManager::install ("FlowSOM") библиотека (FlowSOM)</li>
		<li>Установите пакет flowCore с помощью аналогичного метода и загрузите его в среду, запустив следующее: если (!requireNamespace ("BiocManager", тихо и правда)) install.packages ("BiocManager") BiocManager::install ("flowCore") библиотека (FlowSOM)</li>
		<li>Загрузите исходные данные, представленные в дополнительных файлах 4.1-4.8 (ввод FCS FlowSOM), которые ранее были закрыты на события CD161, в R с функцией read.flowSet. fcs_raw "lt;-- read.flowSet"(path'"C: »Пользователи »пользовательское имя »Desktop »tocluster», шаблон ».fcs», преобразование , FALSE, truncate_max_range - FALSE, семя 123)</li>
		<li>Выберите соответствующие биологические маркеры (удалить "Background" или "Time"), выбрав соответствующие столбцы и преобразить данные в arcsinh5 образом, как показано в коде ниже (здесь, удалить столбцы 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 38, 51, которые не соответствуют любому биологическому маркеру). Примените кофактор 5, как ранее применяется с Cytosplore, выбрав кофактор no 5 в функции ниже. fcs_raw fcs_raw colnames (x) lt;- @parameters@data fcs_raw expr злт;- exprs(x) expr slt;- asinh (expr',-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)/cofactor) exprs (x) злт;- Expr возврат (x))</li>
		<li>Кластерные данные с помощью функции FlowSOM. Для сравнения FlowSOM и Cytosplore, выберите кластерданные в десяти подмножествах в качестве вывода, ранее полученных Cytosplore. fsom злт;- FlowSOM (fcs_raw, преобразованиеФункция масштабируется.центр - FALSE, масштабная.шкала - FALSE, silent , false, colsToUse c (1:37), nClus No 10, maxMeta 10, значение - NULL, семя No 123) ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть изменено вручную пользователем.</li>
		<li>Назначайте каждую ячейку к идентифицированному подмножеству и идентификатору образца. subset_id «lt;- as.factor»(fsom$FlowSOM$map$mappping,1)) уровни (subset_id) злт;- fsom$metaclustering голова (subset_id)</li>
		<li>Загрузите файл метаданных в R (доступно в дополнительном файле 5),содержащий групповое назначение, и свяжите его с файлами .fcs. образец (lt;- read_excel ("C:"Пользователи (пользователя sample_id) sampleid злт;- na.omit (образец) sampleid$sampleID злт;- as.factor (sampleid$sampleID) sampleid$group злт;- as.factor (sampleid$group) sampleid$CSPLR_ST злт;- as.factor (образец $CSPLR_ST) sampleid злт;- as.data.frame (образец) имена (образец) sampleID (fsom$FlowSOM.metaData, функция (x) attr (образец, 'имена') ЗЛТ;- NULL sampleID злт;- as.factor (несписок (sampleID)) sampleid злт;- data.frame (образец) уровни (образец) (образец) (lt;- паста("ID", 1:dim (образец) df slt;- data.frame (subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data, c (1:37)) переименование в slt;- data.frame (colpar-@parameters@data fcs_raw colnames (df) злт;- c ("clusterID", "sampleID", переименование $colpar'c (1:37)) df$ clusterID злт;- as.factor (df$ clusterID) df$sampleID злт;- as.factor (df$sampleID)</li>
		<li>Создайте cfList на основе кадра данных, полученного от FlowSOM, запустив следующий скрипт: cfData slt;- cfList (образцы - выборки, expr й df)</li>
		<li>Повторно закажите маркеры, чтобы они отображались аналогично выходу из анализа Cytosplore. cfData@expr cfData@expr 38,15,8,3,27,9,11,28,35,26, 14,33,17,20,21,18,25,29,13, 30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)] ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеризация FlowSOM завершена. Далее выполните визуализацию вывода кластеризации.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Визуализация: Анализ кластеризации после обработки
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является методом, который является общим для обоих методов кластеризации. Таким образом, он может быть выполнен после кластеризации либо с FlowSOM или Cytosplore.
<ol><li>Перед созданием тепловых карт создайте таблицу подсчетов на образец, используя функциональные ячейки Counts, как показано в приведенном ниже коде. Поскольку некоторые кластеры содержат меньше ячеек, чем другие, масштабируйте данные по кластеру, указав "масштаб и правда" внутри ячейки функции Counts, так что дисперсия между образцами может быть легко видна. cfData злт;- cellCounts (cfData, частота - правда, масштаб - правда) ПРИМЕЧАНИЕ: Данные теперь могут быть визуализированы.</li>
	<li>Визуализируйте с тепловой картой. ПРИМЕЧАНИЕ: Одной из основных функций этого пакета является cytoHeatmaps, который используется для визуализации фенотипа созданных кластеров, а также их неоднородности по отношению к образцам. cytoHeatmaps (cfData, группа "группа", легенда-правда)</li>
	<li>Визуализация с boxplots ПРИМЕЧАНИЕ: Данные могут быть представлены в количественном порядке, позвонив функции cytoBoxplots. Выход этой функции представляет собой пропорцию каждого образца для каждого кластера.<ol>
<li>Создание количества ячейки, как это делается в шаге 3.1, но не масштабируйте данные для получения частоты каждого кластера. cfData -lt;- cellCounts (cfData, частота , правда, масштаб - FALSE) cytoBoxplots (cfData, группа и "группа")</li>
	</ol>
</li>
	<li>Визуализация со средней интенсивностью сигнальной гистограммы ПРИМЕЧАНИЕ: Данные также могут быть визуализированы, представляя медианную гистограмму сигнала интенсивности.<ol>
<li>Визуализируйте интенсивность выражения трех маркеров: CD45, CD11c и CD54.</li>
		<li>Проверьте имена нужных маркеров, позвонив по следующей строке. Обратите внимание на имена маркеров и включите его в функцию msiPlot. имена (cfData@expr) ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь сосредоточьтесь на CD45, CD11c и CD54. Проверьте точное написание маркеров и при необходимости отрегулируйте: msiPlot (cfData, маркеры c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"), группа 'группы')</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Anchang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+cellular+hierarchy+inference+of+single-cell+data+using+SPADE.">Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).</li><li>Van Gassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlowSOM:+Using+self-organizing+maps+for+visualization+and+interpretation+of+cytometry+data.">FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data.</a> Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).</li><li>Levine, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Hotelling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+complex+of+statistical+variables+into+principal+components.">Analysis of a complex of statistical variables into principal components.</a> Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. , (2008).</li><li>Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Stochastic+Neighbor+Embedding.">Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding.</a> Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensionality+reduction+for+visualizing+single-cell+data+using+UMAP.">Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP.</a> Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).</li><li>Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+maps+for+high-dimensional+single-cell+analysis+of+differentiation+data.">Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data.</a> Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).</li><li>Beyrend, G., Stam, K., H&#246;llt, T., Ossendorp, F., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofast:+A+workflow+for+visual+and+quantitative+analysis+of+flow+and+mass+cytometry+data+to+discover+immune+signatures+and+correlations.">Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).</li><li>Beyrend, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+blockade+engages+tumor-infiltrating+lymphocytes+to+co-express+targetable+activating+and+inhibitory+receptors.">PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).</li><li>Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+test+for+groups+of+genes:+testing+association+with+a+clinical+outcome.">A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome.</a> Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Cytofast является быстрым вычислительным инструментом, который обеспечивает быстрое и глобальное исследование цитометрических данных путем выделения и количественной оценки конкретных клеточных подмножеств. Описанный протокол направлен на дальнейшее процесс кластеризации анализов с Cytosplore или FlowSOM. Другие инструменты анализа кластеризации подходят для Cytofast,но для этого требуется использование Cytofast для присвоения каждой ячейки подмножеству. Цитофаст,однако, не является методом кластеризации, и поэтому требует процедур кластеризации перед использованием.
Проведенный здесь анализ показал, что некоторые подмножества клеток CD161и НК в микроокружении опухоли были чувствительны к блокаде PD-L1. Об этом свидетельствуют изменения в их фенотипе и изобилии, которые наблюдались с использованием Cytosplore и FlowSOM в качестве методов кластеризации. Оба метода отличали основной кластер НК-клеток (CD11bи NKG2A) с несколько разными частотами (15%-20% для Cytosplore, 30%-40% для FlowSOM). Различия в изобилии и это приближение не повлияли на глобальную модель, поскольку обе дендрограммы, отображаемые в правых панелях рисунка 2 и рисунка 3, показали аналогичные результаты. С помощью Cytofast,таким образом, можно (независимо от метода кластеризации выбрали) для сегрегации PD-L1 обработанных и необработанных мышей на основе анализа фенотипа и изобилия нк-клеточного кластера.
В зависимости от записанных параметров необходимы изменения в протоколе. В частности, при выполнении анализа кластеризации необходимо удалить определенные параметры, такие как время и фон. Кроме того, важно, чтобы каждая ячейка была назначена подмножеству. Функция cfData просто добавит количество необработанных ячеек на кластер на образец в cfList. С этого шага, cytoheatmap может быть построен, как это объясняется в разделе 3.
Cytofast успешно используется в качестве инструмента визуализации и количественной оценки для сравнения различных методов кластеризации13. Этот пакет R также совместим с расширенными функциями, такими как globaltest14, которые могут тестировать ассоциации между группами кластеров с использованием клинических переменных. В будущем инструмент globaltest и другие алгоритмы могут быть интегрированы с Cytofast для более глубокой визуализации и количественной оценки.

Массовая цитометрия (цитометрия во время полета, или CyTOF) позволяет обнаружить широкий спектр внутриклеточных или внеклеточных биомаркеров в миллионах одиночных клеток. Высокомерный характер данных масс-цитометрии требует определенных инструментов анализа, таких как методы кластеризации клеток, такие как SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Фенограф4, VorteX5, и эшафот карты6. Кроме того, различные методы сокращения размерности были разработаны (т.е. основной анализ компонентов (PCA)7, t-распределенный стохастический сосед встраивания »t-SNE»8, иерархический стохастический сосед встраивания »HSNE»9, равномерное многообразное приближение и проекция »UMAP»10, и диффузионные карты11)для улучшения скорости измерения.
Анализ высокомерных потоков и массовых цитометрических данных часто не имеет автоматических процессов для проведения статистических тестов на кластерной частоте и связи с клиническими исходами. Ранее мы разработали R-рабочий процесс, известный как Cytofast12, который позволяет визуальный и количественный анализ вниз по течению методов кластеризации Cytosplore или FlowSOM.
Описанный здесь протокол разъясняет использование Cytofast в R и показывает, как генерировать количественные и качественные тепловые карты и графики. Кроме того, он облегчает определение связей между наблюдаемыми фенотипами иммунных и клиническими исходами. В настоящем докладе также описывается анализ конкретного набора данных масс-цитометрии с использованием двух различных процедур кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. При использовании Cytofast с обоими методами кластеризации, соответственно показано, что фенотип активации НК-клеток находится под влиянием блокады контрольно-пропускного пункта PD-L1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore

Сложность данных, генерируемых массовой цитометрией, потребовала новых инструментов для быстрого визуализации аналитических результатов. Методы кластеризации, такие как Cytosplore или FlowSOM, используются для визуализации и идентификации клеточных кластеров. Для анализа ниже по течению, недавно разработанный пакет R, Cytofast, может генерировать быструю визуализацию результатов от методов кластеризации. Цитофаст учитывает фенотипическую характеристику клеточных кластеров, вычисляет изобилие клеточного кластера, затем количественно сравнивает группы. Этот протокол объясняет применение Cytofast к использованию данных массовой цитометрии на основе модуляции иммунной системы в микроокружении опухоли (т.е. естественный ответ клетки убийцы )) на вызов опухоли следуют иммунотерапии (PD-L1 блокады). Демонстрация полезности Cytofast с FlowSOM и Cytosplore показано. Cytofast быстро генерирует визуальные представления групповых групповых групповых иммунных клеток и корреляции с составом иммунной системы. Различия наблюдаются в анализе кластеризации, но разделение между группами видно с помощью обоих методов кластеризации. Cytofast визуально показывает модели, индуцированные PD-L1 лечения, которые включают в себя более высокое изобилие активированных подмножеств НК ячейки, выражая более высокую интенсивность активации маркеров (т.е., CD54 или CD11c).

Рабочий процесс Cytofast (рисунок 1) предназначен для обеспечения количественного и качественного обзора данных, первоначально сгруппированных программным обеспечением анализа (т.е. FlowSOM или Cytosplore). Cytofast выполняет несколько возможных выходов, включая тепловую карту всех кластеров, определенных в анализе и основанных на выражении маркеров(рисунок 2 и рисунок 3). Дендрограмма сверху представляет иерархическое сходство между идентифицированными кластерами. Верхняя панель отображает другую тепловую карту, показывающую относительное количество соответствующих подмножеств в каждом образце. Дендрограмма справа показывает сходство между образцами и основана на иерархической кластеризации, выполняемой на евклидовых расстояниях между образцами. Комбинированные тепловые карты показаны для FlowSOM, за которымследуют Cytofast на рисунке 2 и для Cytosplore, за которым следуют Cytofast на рисунке 3. Cytofast также может быть использован для представления данных количественно и отображения результатов в boxplots (с помощью функции cytoBoxplots), как показано на рисунке 4 и рисунке 5.
Аналогичные кластеры были обнаружены между двумя различными методами (например, кластер 8 из Cytosplore соответствует кластеру 10 из FlowSOM),и совместное выражение некоторых ингибирующих маркеров, таких как PD-1 и LAG-3, все еще было видно в обоих методах). Оба метода кластеризации позволили дискриминации между PD-L1 против. PBS лечил мышей. В отличие от этого, некоторые различия между обоими методами могут быть выделены. FlowSOM идентифицирует 2 кластера (MHC-II)в то время как Cytosplore показывает только один кластер (MHC-IIзум). Это связано с первоначальной стратегией gating, в которой НК-клетки были вручную закрыты на клетки CD161, а затем дальнейшей обработки FlowSOM. Тем не менее, Cytosplore автоматически закрытых ячеек от CD45- населения на первом уровне HSNE, которые затем были сгруппированы в более высоком иерархическом уровне. Таким образом, Cytosplore определил подмножества клеток НК более точно, чем то, как ручной gating сосредоточены на CD161. Тем не менее иерархическая кластеризация образцов была сохранена, как показано в дендрограмме справа, что свидетельствует о том, что сегрегация между двумя группами (PD-L1 и PBS) не зависит от выбранного метода кластеризации.
Количество кластеров можно определить вручную с помощью обоих методов. Cytofast позволяет пользователю оценить неоднородность своих данных и может дать представление о том, как выбрать количество кластеров, в которые данные должны быть разделены. Другие функции включены в пакет Cytofast, такие как функция msiPlot (шаг 3.4.2), показывающий средний график интенсивности сигнала (MSI) каждого маркера на группу(рисунок 6 и рисунок 7). Эта функция позволяет обнаруживать глобальные изменения, такие как увеличение экспрессии CD54 или CD11c в НК-клетках группы PD-L1. Дополнительные функции могут быть включены в пакет Cytofast, такие как отображение данных в барных графиках и других методах представления данных. Последнее требует добавления инструментов ggplot, которые могут быть сгенерированы R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig01.jpg"> Рисунок 1: Рабочий процесс пакета Cytofast. Данные были получены с помощью массовой цитометрии из опухоли через 3 дня после лечения иммунотерапией или не лечиться. Были сравнены две различные методы кластеризации: Cytosplore и FlowSOM. Cytofast был использован для визуализации различий между двумя методами. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig02.jpg"> Рисунок 2: Обзор кластера и изобилие кластеров в группе, как анализируется Cytofast после Cytosplore. Тепловая карта всех нк-клеточных кластеров (CD161- клетки, автоматически определяемые Cytosplore),которые были определены через 3 дня после иммунотерапии (PD-L1). Данные, показанные на основе кластеризации Cytosplore и объединены из необработанных и PD-L1 обработанных групп. Уровни маркера выражения ArcSinh5 отображаются в радужной шкале. На нижней панели относительное изобилие каждого образца представлено по зеленой и фиолетовой шкале. Дендрограмма справа представляет сходство между образцами на основе частот подмножеством. Шкала частот представляет дисперсию среднего. Низкая или высокая частота представлена зеленым или фиолетовым цветом, соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig03.jpg"> Рисунок 3: Обзор кластера и изобилие кластеров в группе, как анализируется Cytofast после FlowSOM. Тепловая карта всех нк-клеточных кластеров (предварительно загнано на CD161и события), которые были выявлены через 3 дня после иммунотерапии (PD-L1). Показанные данные основаны на кластеризации FlowSOM и объединены из необработанных и PD-L1 обработанных групп. Уровни маркера выражения ArcSinh5 отображаются в радужной шкале. На нижней панели относительное изобилие каждого образца представлено по зеленой и фиолетовой шкале. Дендрограмма справа представляет сходство между образцами на основе частот подмножеством. Шкала частот представляет дисперсию среднего. Низкая или высокая частота представлена зеленым или фиолетовым цветом, соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig04.jpg"> Рисунок 4: Цитофаст представление с boxplots кластеров определяется Cytosplore. Частота каждого кластера представлена в почтовом участке, разделенном на две группы (PBS и PD-L1). Одна индивидуальная точка соответствует одной мыши. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig05.jpg"> Рисунок 5: Представление Cytofast с boxplots кластеров, определенных FlowSOM. Частота каждого кластера представлена в почтовом участке, разделенном на две группы (PBS и PD-L1). Одна индивидуальная точка соответствует одной мыши. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig06.jpg"> Рисунок 6: Распределение участков интенсивности сигнала из НК-клеток, автоматически закрытых Cytosplore. Распределение интенсивности сигнала отображается в гистограмме для трех конкретных маркеров: CD45, CD11c и CD54. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig6large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig07.jpg"> Рисунок 7: Распределение участков интенсивности сигнала из НК-ячеек, автоматически закрытых FlowSOM. Распределение интенсивности сигнала отображается в гистограмме для трех конкретных маркеров: CD45, CD11c и CD54, разделенных группами PBS и PD-L1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig7large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительные файлы 1.1-1.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_1.1-1.8.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительные файлы 2.1-2.10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_2.1-2.10.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительный файл 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_3_sample_id_Cytosplore.xlsx.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительные файлы 4.1-4.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_4.1-4.8.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>
Дополнительный файл 5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_5._sample_id_FlowSOM.xlsx.zip" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore at JoVE.com

Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore

Cytofast — это инструмент визуализации, используемый для анализа результатов кластеризации. Cytofast можно использовать для сравнения двух методов кластеризации: FlowSOM и Cytosplore. Cytofast может быстро генерировать количественный и качественный обзор данных массовой цитометрии и выявить основные различия между различными алгоритмами кластеризации.

Визуализация и количественная оценка высокомерных данных цитометрии с использованием Cytofast и upstream кластерных методов FlowSOM и Cytosplore

The complexity of data generated by mass cytometry has necessitated new tools to rapidly visualize analytic outcomes. Clustering methods like Cytosplore ...

Данные, генерируемые массовой цитометрией, сложны и нуждаются в визуализации эффективным и простым способом. Cytofast это метод, который подчеркивает иммунологические модели в популяции иммунных клеток и определяет клеточные подмножества, которые связаны с клиническим лечением или экспериментальных групп. Cytofast может быть применен после любого метода кристаллизации, как FlowSOM или Cytosplore.Это позволит вам обнаружить подмножество клеток, которые связаны с клиническим лечением или экспериментальной группы. С помощью этого метода вы сможете увидеть иммунологический обзор данных с первого взгляда в количественном порядке. Начните с создания кластеров с помощью Cytosplore или FlowSOM.При использовании Cytosplore загрузите файлы FCS, нажав на Файлы и откройте файлы FCS. Затем выберите кофактор для гиперболической трансформации ArcSinh при запросе и нажмите на добавление уникального тега образца в качестве канала. Выберите запустить HSNE для запуска уровня HSNE из трех и ждать, пока карта будет создана.На первом уровне HSNE проверьте ячейки, которые являются положительными для CD161, выбрав положительные ячейки CD161 и правое нажатие зум в выборе. На втором уровне повторите процедуру, чтобы достичь третьего уровня только с CD161 положительные события. После того, как будет создана последняя карта TSNE, сохраните кластеры, определенные Cytosplore, нажав правой кнопкой мыши на карте и выбрав кластеры сохранения.Выберите каталог выходных файлов по запросу Cytosplore и обратите внимание на это место, потому что позже он будет использоваться для загрузки файлов FSC в R.Use простое имя символов только при переименовании выходных файлов, которые сделают идентификацию и дальнейшую обработку проще и выбрать сохранить. Загрузите файлы в R с обозначенной функцией readcytosploreFCS. Для очистки данных удалите некоторые параметры, такие как время и фон, проверив положение столбца, связанное с его ненужными параметрами, и удалив его из матрицы.Затем переупорядочить маркеры так, чтобы маркеры линии отображались сначала с последующими функциональными маркерами. Свяжите файл метаданных с генерируемыми данными из Cytosplore, загрузив метафилу электронной таблицы, содержащую клиническую информацию. Для выполнения кластеризации FlowSOM загрузите необработанные данные, которые ранее были закрыты на CD161 положительные события в R с чтением.функция flowSet. Выберите соответствующие биологические маркеры, выбрав соответствующие столбцы и преобразовав данные в arcSinh5 образом. Нанесите кофактор из пяти человек, выбрав в функции cofacter-5.Кластерные данные с использованием функции FlowSOM и сравните FlwoSOM и Cytosplore, выбрав кластеризацию данных в 10 подмножествах так же, как выход, ранее полученный Cytosplore. Затем назначьте каждую ячейку в идентифицированный подмножество и образец ID.Load файл метаданных в R, содержащий групповое назначение, и свяжите его с файлами FCS, используя код из текстовой рукописи. Создайте список CF на основе кадра данных, полученного из FlowSOM.Затем переупорядочить маркеры, чтобы появиться аналогично выходу из анализа Cytosplore. Перед созданием тепловых карт создайте таблицу подсчета на выборку с помощью функции cellCount. Поскольку некоторые кластеры содержат меньше ячеек, чем другие, масштабировать данные на кластер, указывая scale'true внутри функции, что позволяет легко увидеть дисперсию между образцами.Визуализировать данные с тепловой картой затем визуализировать с участками коробки, генерируя количество ячеей, но не масштабирование данных для получения частоты каждого кластера. Наконец, визуализировать интенсивность выражения маркеров CD45, CD11c и CD54 с помощью имен маркеров и включения их в функцию сюжета MSI. Cytofast выполняет несколько возможных выходов, включая тепловую карту всех кластеров, выявленных в анализе и основанных на выражении маркера.Дендрограмма сверху представляет собой иерархическое сходство между идентифицированных кластерами. Верхняя панель отображает другую тепловую карту, показывающую относительное количество соответствующих подмножественн в каждом образце. Между тем, дендрограмма справа показывает сходство между образцами на основе подмножества частот, демонстрирующих, что фенотип естественных клеток-убийц формируется путем лечения PD-L1 через три дня после инъекции.Комбинированные тепловые карты могут быть получены для FlowSOM с последующим Cytofast и для Cytosplore следуют Cytofast. Cytofast также может быть использован для количественного представления данных и отображения результатов в участках коробок. Еще одной особенностью, которая включена в пакет Cytofast, является функция участка MSI, которая показывает средний участок интенсивности сигнала каждого маркера на группу.Эта функция позволяет обнаруживать глобальные изменения, такие как увеличение экспрессии CD54 или CD11c в естественных клетках-убийцах обработанной группы PD-L1. Этот метод является быстрым способом визуализации и количественной оценки данных и может быть использован для обнаружения новых клеточных реакций после терапии. После этого метода глобальный тестовый пакет в R может быть использован для тестирования группы ковариатов на связь с переменными ответа.Это покажет корреляцию между каждым подмножествам и клиническим исходом.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: Высокая пропускная Количественная оценка колонии роста и время запаздывания

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em&gt; В Vivo</em&gt; С использованием анализа проточной цитометрии на основе

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

ExCYT: A Graphical User Interface for Streamlining Analysis of High-Dimensional Cytometry Data

ExCYT: Графический интерфейс пользователя для упорядочения анализ высокого мерных данных цитометрии

With the advent of flow cytometers capable of measuring an increasing number of parameters, scientists continue to develop larger panels to phenotypically ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Visualization, Quantification, and Mapping of Immune Cell Populations in the Tumor Microenvironment

Визуализация, количественная оценка и картирование популяций иммунных клеток в микроокружении опухолей

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...