Name: visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore
Uploaded: 2019-12-12T14:00:00
Duration: 6 min 1 s
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Reconocemos la financiación de la Comisión Europea de un premio H2020 MSCA con el número de propuesta 675743 (ISPIC). Agradecemos a Tetje van der Sluis e Iris Pardieck por probar el protocolo.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentos Animales de LUMC y se ejecutaron de acuerdo con las directrices de experimentación animal de la LUMC de acuerdo con las directrices de los comités holandeses y europeos.
NOTA: Para la configuración experimental, los ratones C57BL/6 fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco derecho con el tumor de colon murino MC38 a una concentración de 0,3 x 106 células/200 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de 10 días, cuando los tumores eran palpables, los ratones fueron tratados con anticuerpos de bloqueo PD-L1 (clon MIH-5, 200 g/ratón, inyección intraperitoneal) o fueron tratados simuladamente. Los tumores fueron resecados 3 días después de la inyección de PD-L1, procesados ex vivo, y analizados por citometría de masas CyTOF utilizando 38 marcadores13.
1. Equipo y software para el análisis de datos
NOTA: Utilice un ordenador (Windows 7 o posterior) y el procesador I5 a 2,4 GHz o equivalente, memoria instalada RAM 6 GB y 10 GB de espacio libre en el disco duro. El paquete R Cytofast utiliza funciones existentes: principalmente flowCore, pheatmapy ggplot. Las líneas de comando que se ejecutarán en R se incluyen en el protocolo. El recurso para las instrucciones de R se puede encontrar en <a href="https://education.rstudio.com/" target="_blank">https://education.rstudio.com/</a>.
<ol><li>Para instalar el paquete Cytofast, inicie R (versión "3.6") e instale Bioconductor versión 3.9 introduciendo el siguiente código: if (!requireNamespace("BiocManager", en silencio , TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("cytofast")</li>
	<li>Asegúrese de que el paquete se carga en el entorno deseado ejecutando lo siguiente: biblioteca (citorápido)</li>
</ol>2. Creación de clústeres
NOTA: Para mostrar los dos métodos de agrupación cytosplore y FlowSOM con citorápido,se analizan las células NK (CD161+) en el microambiente tumoral 3 días después del tratamiento con PD-L1.
<ol><li>Clustering realizado porCytosplore
	<ol><li>Después de descargar e instalar Cytosplore, alojado en <www. Cytosplore.org>, cargue los archivos .fcs(Archivos complementarios 1.1–1.8 [Archivos de entrada de Cytosplore]) haciendo clic en Archivo ( Archivo ? Abra Archivos FCS en Cytosplore. Agregue una etiqueta de muestra única como canal haciendo clic en Agregar etiqueta de muestra única como canal cuando se le solicite y seleccione un cofactor para la transformación de arcosinh hiperbólico (el valor predeterminado es 5).</li>
		<li>Seleccione Ejecutar H-SNE, ejecute un nivel HSNE de 3 y espere a que se genere el mapa. NOTA: Este paso puede requerir algún tiempo, dependiendo del número de células analizadas y el nivel de HSNE elegido.</li>
		<li>En el primer nivel HSNE, marque las células que son positivas para CD161. Seleccione las celdas CD161+ y haga clic con el botón derecho en Zoom enla selección . En el segundo nivel, repita el procedimiento para alcanzar el tercer nivel con solo eventos CD161+.</li>
		<li>Una vez que se genera el último mapa tSNE, guarde los clústeres definidos por Cytosplore haciendo clic con el botón derecho en el mapa tSNE y elija Save Clusters. Elija el directorio de los archivos de salida según lo solicite Cytosplore y observe esta ubicación, porque este directorio se utilizará para cargar los archivos .fcs en R. NOTA: El número de subconjuntos se puede cambiar manualmente cambiando el valor sigma. El valor sigma se establece de forma predeterminada en 30; sin embargo, el número real de subconjuntos depende de la entrada. Aquí, Cytosplore detectó 10 subconjuntos diferentes, con cada archivo representando un subconjunto.</li>
		<li>Utilice un nombre simple (solo caracteres) al cambiar el nombre de los archivos de salida, lo que facilitará la identificación y el manejo posterior. Guarde los archivos de salida seleccionando Guardar. NOTA: Después de guardar, Cytosplore crea una carpeta con los archivos .fcs, con cada archivo correspondiente a los clústeres identificados en Cytosplore. El siguiente paso será cargar los archivos en R con la ayuda de Cytofast. Aquí, los archivos de salida generados se proporcionan en Archivos suplementarios 2.1–2.10 (archivos de salida de Cytosplore).</li>
		<li>Cargue los archivos de salida generados por Cytosplore en R con la función designada: readCytosploreFCS. dirFCS <- "C:-Usuarios-nombre de usuario-Escritorio-tostudy" cfData <- readCytosploreFCS(dir - dirFCS, colNames - "description")</li>
		<li>Limpie los datos eliminando algunos parámetros como "Tiempo" y "Fondo". Compruebe la posición de la columna relacionada con sus parámetros innecesarios y elimínela de la matriz. colnames(cfData@expr) cfData@expr <- cfData@expr[,-c(3,4,6,8:10,46:49,51:54)] NOTA: Las columnas innecesarias se pueden ver leyendo los nombres de columna de la matriz generada. Al ejecutar colnames(cfData@expr) una vez más, asegúrese de que solo se obtienen los parámetros deseados.</li>
		<li>Reordene los marcadores para que los marcadores de linaje se muestren primero, seguidos de marcadores funcionales. cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,3,35,36,31,9,10,18,8,37,20, 29,40,5,30,33,11,34,14,19, 32,28,6,7,4,12,13,17,16,15, 21,22,24,25,26,27,38,39)] NOTA: El paso 2.1.8 es opcional.</li>
		<li>Vincule el archivo de datos meta a los datos generados de Cytosplore cargando el metarchivo de hoja de cálculo que contiene información clínica (Archivo suplementario 3). biblioteca (readxl) meta <- read_excel("C:'Usuarios''nombre de usuario''Escritorio'sample_id.xlsx") cfData@samples <- data.frame(meta) NOTA: La agrupación en clústeres que está realizando Cytosplore ha terminado. Una opción de agrupación en clústeres alternativa a Cytosplore es FlowSOM y se describe en la sección 2.2. Una vez realizado uno de los dos pasos de agrupación en clústeres, continúe con el paso de visualización (sección 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Clustering realizado porFlowSOM
	<ol><li>En primer lugar, instale FlowSOM en R ejecutando el siguiente comando: if (!requireNamespace("BiocManager", en silencio , TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("FlowSOM") library(FlowSOM)</li>
		<li>Instale el paquete flowCore con un método similar y cárguelo en el entorno ejecutando lo siguiente: if (!requireNamespace("BiocManager", en silencio , TRUE)) install.packages("BiocManager") BiocManager::install("flowCore") library(FlowSOM)</li>
		<li>Cargue los datos sin procesar proporcionados en Archivos suplementarios 4.1–4.8 (entrada FCS FlowSOM), que anteriormente estaban bloqueados en eventos CD161+, en R con la función read.flowSet. fcs_raw <- read.flowSet(ruta de acceso"C:'Usuarios''nombredeusuario''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''truncate_max_range'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''</li>
		<li>Seleccione los marcadores biológicos relevantes (eliminar "Fondo" o "Tiempo") seleccionando las columnas adecuadas y transforme los datos de una manera arcsinh5 como se muestra en el código siguiente (aquí, elimine las columnas 1, 2, 4, 5, 6, 17, 21, 24, 25, 34, 35, 37, 38, 51, que no corresponden a ningún marcador biológico). Aplique un cofactor de 5 como se ha aplicado anteriormente con Cytosplore,eligiendo cofactor 5 en la función siguiente. fcs_raw <- fsApply(fcs_raw, function(x, cofactor-5) colnames(x) <- fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc expr <- exprs(x) expr <- asinh(expr[,-c(1,2,4,5,6,17,21,24,25,34,35,37,38,51)]/ cofactor) exprs(x) <- expr return(x)-)</li>
		<li>Agrupe los datos mediante la función FlowSOM. Para comparar FlowSOM y Cytosplore, elija agrupar los datos en diez subconjuntos como la salida anteriormente obtenida por Cytosplore. fsom <- FlowSOM(fcs_raw, transformFunction ? FALSE, escala - FALSE, scaled.center - FALSE, scaled.scale - FALSE, silent , FALSE, colsToUse á c(1:37), nClus 10, maxMeta a 10, importancia, NULL, semilla 123) NOTA: Esto puede ser cambiado manualmente por el usuario.</li>
		<li>Asigne cada celda a su subconjunto identificado e ID de muestra. subset_id <- as.factor(fsom$FlowSOM$map$mapping[,1]) levels(subset_id) <- fsom$metaclustering cabeza (subset_id)</li>
		<li>Cargue el archivo de metadatos en R (disponible en Archivo suplementario 5) que contiene la asignación de grupo y vincúlelo a los archivos .fcs. sampleid <- read_excel ("C:'Usuarios''nombre de usuario''Escritorio''sample_id.xlsx") sampleid <- na.omit(sampleid) sampleid$sampleID <- as.factor(sampleid$sampleID) sampleid$group <- as.factor(sampleid$group) sampleid$CSPLR_ST <- as.factor(sampleid$CSPLR_ST) sampleid <- as.data.frame(sampleid) names(sampleid)[3] <- "sampleID" sampleID <- lapply(fsom$FlowSOM$metaData, function(x)-rep(x[1], each ? length(x[1]:x[2]))-) attr(sampleID, 'names') <- NULL sampleID <- as.factor(unlist(sampleID)) sampleid <- data.frame(sampleid) levels(sampleID) <- paste("ID", 1:dim(sampleid)[1], sep-"_") df <- data.frame(subset_id, sampleID, fsom$FlowSOM$data[, c(1:37)]) cambiar el nombre <- data.frame(colpar-fcs_raw[[1]]@parameters@data$desc) colnames(df) <- c("clusterID", "sampleID", rename$colpar[c(1:37)]) df$ clusterID <- as.factor(df$ clusterID) df$sampleID <- as.factor(df$sampleID)</li>
		<li>Cree un cfList basado en la trama de datos obtenida de FlowSOM ejecutando el siguiente script: cfData <- cfList(samples - sampleid, expr - df)</li>
		<li>Reordene los marcadores para que aparezcan de forma similar a la salida del análisis de Cytosplore. cfData@expr <- cfData@expr[,c(1,2,34,36,37,10,23,24,31,22, 38,15,8,3,27,9,11,28,35,26, 14,33,17,20,21,18,25,29,13, 30,12,16,32,4,5,6,7,19,39)] NOTA: La agrupación en clústeres de FlowSOM ha finalizado. A continuación, realice la visualización de la salida de agrupación en clústeres.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualización: Análisis de clustering posterior al procesamiento
NOTA: Este paso es un método que es común a ambos métodos de agrupación en clústeres. Por lo tanto, se puede realizar después de la agrupación en clústeres con FlowSOM o Cytosplore.
<ol><li>Antes de crear los mapas de calor, genere la tabla de recuento por muestra mediante la función cellCounts como se muestra en el código siguiente. Puesto que algunos clústeres contienen menos celdas que otros, escale los datos por clúster especificando "escala - TRUE" dentro de la función cellCounts, de modo que la dispersión entre muestras se pueda ver fácilmente. cfData <- cellCounts(cfData, frecuencia - TRUE, escala - TRUE) NOTA: Los datos ahora se pueden visualizar.</li>
	<li>Visualice con el mapa de calor. NOTA: Una de las principales funciones de este paquete son los citotermúas, que se utiliza para visualizar el fenotipo de los clústeres creados, así como su heterogeneidad con respecto a las muestras. cytoHeatmaps (cfData, group-"group", legend-TRUE)</li>
	<li>Visualización con diagramas de caja NOTA: Los datos se pueden representar de forma cuantitativa llamando a la función cytoBoxplots. La salida de esta función representa la proporción de cada muestra para cada clúster.<ol>
<li>Genere el recuento de celdas como se hace en el paso 3.1, pero no escale los datos para obtener la frecuencia de cada clúster. cfData <- cellCounts(cfData, frecuencia - TRUE, escala - FALSE) cytoBoxplots(cfData, group ? "group")</li>
	</ol>
</li>
	<li>Visualización con histograma de señal de intensidad media NOTA: Los datos también se pueden visualizar representando el histograma de señal de intensidad mediana.<ol>
<li>Visualice la intensidad de expresión de tres marcadores: CD45, CD11c y CD54.</li>
		<li>Compruebe los nombres de los marcadores deseados llamando a la siguiente línea. Anote los nombres de los marcadores e infórmelos en la función msiPlot. nombres (cfData@expr) NOTA: Aquí, concéntrese en CD45, CD11c y CD54. Compruebe la ortografía exacta de los marcadores y ajuste si es necesario: msiPlot(cfData, markers á c("89Y_CD45", "167Er_CD11c","164Dy_CD54"), byGroup'group')</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Anchang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+cellular+hierarchy+inference+of+single-cell+data+using+SPADE.">Visualization and cellular hierarchy inference of single-cell data using SPADE.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1264-1279 (2016).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 323-337 (2015).</li><li>Van Gassen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlowSOM:+Using+self-organizing+maps+for+visualization+and+interpretation+of+cytometry+data.">FlowSOM: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data.</a> Cytometry A. 87 (7), 636-645 (2015).</li><li>Levine, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis.">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li><li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data.">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13 (6), 493-496 (2016).</li><li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system.">An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425 (2015).</li><li>Hotelling, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+complex+of+statistical+variables+into+principal+components.">Analysis of a complex of statistical variables into principal components.</a> Journal of Educational Psychology. 24 (6), 417-441 (1933).</li><li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Data+using+t-SNE.">Visualizing Data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. , (2008).</li><li>Pezzotti, N., Hollt, T., Lelieveldt, B., Eisemann, E., Vilanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+Stochastic+Neighbor+Embedding.">Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding.</a> Computer Graphics Forum. 35 (3), 21-30 (2016).</li><li>Becht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimensionality+reduction+for+visualizing+single-cell+data+using+UMAP.">Dimensionality reduction for visualizing single-cell data using UMAP.</a> Nature Biotechnology. 37, 38 (2018).</li><li>Haghverdi, L., Buettner, F., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+maps+for+high-dimensional+single-cell+analysis+of+differentiation+data.">Diffusion maps for high-dimensional single-cell analysis of differentiation data.</a> Bioinformatics. 31 (18), 2989-2998 (2015).</li><li>Beyrend, G., Stam, K., H&#246;llt, T., Ossendorp, F., Arens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytofast:+A+workflow+for+visual+and+quantitative+analysis+of+flow+and+mass+cytometry+data+to+discover+immune+signatures+and+correlations.">Cytofast: A workflow for visual and quantitative analysis of flow and mass cytometry data to discover immune signatures and correlations.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 435-442 (2018).</li><li>Beyrend, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-L1+blockade+engages+tumor-infiltrating+lymphocytes+to+co-express+targetable+activating+and+inhibitory+receptors.">PD-L1 blockade engages tumor-infiltrating lymphocytes to co-express targetable activating and inhibitory receptors.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 217 (2019).</li><li>Goeman, J. J., van de Geer, S. A., de Kort, F., van Houwelingen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+test+for+groups+of+genes:+testing+association+with+a+clinical+outcome.">A global test for groups of genes: testing association with a clinical outcome.</a> Bioinformatics. 20 (1), 93-99 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cytofast es una herramienta computacional rápida que proporciona una exploración rápida y global de los datos citométricos resaltando y cuantificando subconjuntos celulares específicos del tratamiento. El protocolo descrito tiene como objetivo seguir procesando análisis de clustering con Cytosplore o FlowSOM. Otras herramientas de análisis de agrupación en clústeres son adecuadas para Cytofast, pero esto requiere el uso de Cytofast para asignar cada celda a un subconjunto. Cytofast, sin embargo, no es un método de agrupación en clústeres y, por lo tanto, requiere procedimientos de agrupación en clústeres antes de su uso.
El análisis realizado aquí mostró que ciertos subconjuntos de células CD161+ NK en el microambiente tumoral eran sensibles a un bloqueo PD-L1. Esto fue evidenciado por los cambios en su fenotipo y abundancia, que se observaron utilizando Cytosplore y FlowSOM como métodos de agrupación en clústeres. Ambos métodos distinguieron el clúster principal de células NK (CD11b+ NKG2A+) con frecuencias ligeramente diferentes (15%–20% para Cytosplore,30%–40% para FlowSOM). Las diferencias en abundancia y esta aproximación no afectaron al patrón global, porque ambos dendrogramas mostrados en los paneles derecho de la Figura 2 y la Figura 3 mostraron resultados similares. Por lo tanto, mediante el uso de Citofast, es posible (independientemente del método de agrupación en clústeres elegido) segregar ratones tratados con PD-L1 y no tratados en función de los análisis del fenotipo y la abundancia del racimo de células NK.
Dependiendo de los parámetros registrados, se necesitan modificaciones en el protocolo. En concreto, se deben quitar determinados parámetros, como el tiempo y el fondo, al realizar el análisis de agrupación en clústeres. Además, es importante que cada celda se asigne a un subconjunto. La función cfData simplemente agregará los recuentos de celdas sin procesar por clúster por muestra en cfList. A partir de este paso, el citoheatmap se puede construir como se explica en la sección 3.
Cytofast se ha utilizado con éxito como herramienta de visualización y cuantificación para comparar diferentes métodos de agrupación en clústeres13. Este paquete R también es compatible con características avanzadas, como el globaltest14,que puede probar asociaciones entre grupos de clústeres utilizando variables clínicas. En el futuro, la herramienta globaltest y otros algoritmos se pueden integrar con Cytofast para una visualización y cuantificación más detalladas.

La citometría masiva (citometría por tiempo de vuelo, o CyTOF) permite la detección de una amplia gama de biomarcadores intracelulares o extracelulares en millones de células individuales. La naturaleza de alta dimensión de los datos de citometría de masas requiere ciertas herramientas de análisis, como las técnicas de agrupación de células como SPADE1, FlowMaps2, FlowSOM3, Phenograph4, VorteX5y scaffold maps6. Además, se han desarrollado diversas técnicas basadas en la reducción de dimensionalidad (es decir, análisis de componentes principales [PCA]7,incrustación de vecino estocástico distribuido en t [t-SNE]8, incrustación jerárquica de vecinos estocásticos [HSNE]9, aproximación y proyección uniformes [UMAP]10,y mapas de difusión11) para mejorar la velocidad, interpretación y visualización de conjuntos de datos de alta dimensión.
El análisis posterior de los datos citométricos de masa y flujo de alta dimensión a menudo carece de procesos automáticos para realizar pruebas estadísticas sobre la frecuencia del clúster y los vínculos con los resultados clínicos. Anteriormente, desarrollamos un flujo de trabajo basado en R conocido como Cytofast12,que permite análisis visuales y cuantitativos posteriores de las técnicas de clustering por Cytosplore o FlowSOM.
El protocolo descrito aquí aclara el uso de Cytofast en R y muestra cómo generar mapas de calor cuantitativos y cualitativos y gráficos. Además, facilita la determinación de las conexiones entre los fenotipos inmunes observados y los resultados clínicos. Este informe también describe el análisis de un conjunto de datos de citometría de masa específico mediante dos procedimientos de agrupación en clústeres diferentes: FlowSOM y Cytosplore. Mediante el uso de citorápido con ambos métodos de agrupación en clústeres, se muestra correspondientemente que el fenotipo de activación de las células NK está influenciado por el bloqueo del punto de control inmune PD-L1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of high-dimensional cytometry data using cytofast and the upstream clustering methods flowsom and cytosplore

La complejidad de los datos generados por la citometría masiva ha requerido nuevas herramientas para visualizar rápidamente los resultados analíticos. Los métodos de agrupación en clústeres como Cytosplore o FlowSOM se utilizan para la visualización e identificación de clústeres de celdas. Para el análisis posterior, un paquete de R recientemente desarrollado, Cytofast, puede generar una visualización rápida de los resultados de los métodos de agrupación en clústeres. Cytofast tiene en cuenta la caracterización fenotípica de los clústeres de células, calcula la abundancia del clúster de celdas y, a continuación, compara cuantitativamente los grupos. Este protocolo explica las aplicaciones de Citofast al uso de datos de citometría de masabasados en la modulación del sistema inmunitario en el microambiente tumoral (es decir, la respuesta celular del asesino natural [NK]) al desafío tumoral seguido de la inmunoterapia (bloqueo PD-L1). Se muestra la demostración de la utilidad del citorápido con FlowSOM y Cytosplore. El citorápido genera rápidamente representaciones visuales de cúmulos de células inmunitarias relacionadas con el grupo y correlaciones con la composición del sistema inmunitario. Las diferencias se observan en el análisis de agrupación en clústeres, pero la separación entre grupos es visible con ambos métodos de agrupación en clústeres. El citorápido muestra visualmente los patrones inducidos por el tratamiento PD-L1 que incluyen una mayor abundancia de subconjuntos de células NK activados, expresando una mayor intensidad de los marcadores de activación (es decir, CD54 o CD11c).

El flujo de trabajo Citofast (Figura 1) está destinado a proporcionar una visión cuantitativa y cualitativa de los datos agrupados originalmente por software de análisis (es decir, FlowSOM o Cytosplore). Cytofast ejecuta varias salidas posibles, incluido el mapa de calor de todos los clústeres identificados en el análisis y basado según la expresión de marcador(Figura 2 y Figura 3). El dendrograma en la parte superior representa la similitud jerárquica entre los clústeres identificados. El panel superior muestra otro mapa de calor que muestra la cantidad relativa de subconjuntos correspondientes en cada muestra. El dendrograma de la derecha muestra la similitud entre las muestras y se basa en el clustering jerárquico realizado en las distancias euclidianas entre las muestras. Los mapas de calor combinados se muestran para FlowSOM seguido de Citofast en la Figura 2 y para Cytosplore seguidos de Cytofast en la Figura 3. Cytofast también se puede utilizar para presentar los datos cuantitativamente y mostrar los resultados en diagramas de caja (mediante la función cytoBoxplots), como se muestra en la Figura 4 y la Figura 5.
Se encontraron grupos similares entre los dos métodos diferentes (por ejemplo, el cluster 8 de Cytosplore corresponde al cluster 10 de FlowSOM),y la co-expresión de algunos marcadores inhibitorios como PD-1 y LAG-3 seguían siendo visibles en ambos métodos). Ambos métodos de agrupación en clústeres permitieron la discriminación entre PD-L1 vs. Ratones tratados con PBS. Por el contrario, se pueden resaltar algunas diferencias entre ambos métodos. FlowSOM identifica 2 clústeres (MHC-II+), mientras que Cytosplore muestra solo un clúster (MHC-II+dim). Esto se debe a la estrategia de gating inicial en la que las células NK se encerradon manualmente en las células CD161+, luego procesadas por FlowSOM. Sin embargo, Cytosplore agarredó automáticamente las células del CD45+ población en el primer nivel HSNE, que luego se agruparon en un nivel jerárquico más alto. Por lo tanto, Cytosplore definió los subconjuntos de celdas NK con mayor precisión que cómo se centraba el gating manual en CD161. Sin embargo, se conservó el clustering jerárquico de las muestras, como se muestra en el dendrograma de la derecha, lo que indica que la segregación entre los dos grupos (PD-L1 y PBS) no dependía del método de agrupación en clústeres elegido.
El número de clústeres se puede definir manualmente utilizando ambos métodos. Cytofast permite al usuario evaluar la heterogeneidad de sus datos y puede proporcionar información sobre cómo elegir el número de clústeres en los que se deben dividir los datos. Otras características se incluyen en el paquete Cytofast, como la función msiPlot (paso 3.4.2), que muestra la gráfica de intensidad de señal mediana (MSI) de cada marcador por grupo(Figura 6 y Figura 7). Esta función permite la detección de cambios globales, como aumentos en la expresión de CD54 o CD11c en celdas NK del grupo tratado con PD-L1. Las características opcionales se pueden incorporar en el paquete Cytofast, como mostrar datos en gráficos de barras y otros métodos de representación de datos. Este último requiere la adición de herramientas ggplot, que pueden ser generadas por R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo del paquete Cytofast. Los datos fueron generados por citometría de masas de un tumor 3 días después del tratamiento con inmunoterapia o sin tratar. Se compararon dos técnicas de agrupación en clústeres diferentes: Cytosplore y FlowSOM. El citorápido se utilizó para visualizar las diferencias entre las dos técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig02.jpg"> Figura 2: Visión general del clúster y abundancia de clústeres por grupo analizado por Cytofast siguiendo Cytosplore. Mapa térmico de todos los cúmulos de células NK (CD161+ células definidas automáticamente por Cytosplore),que se identificaron 3 días después de la inmunoterapia (PD-L1). Los datos mostrados se basan en la agrupación en clústeres de Cytosplore y se agrupan a partir de los grupos no tratados y tratados con PD-L1. Los niveles del marcador de expresión transformado en ArcSinh5 se muestran en una escala de arco iris. En el panel inferior, la abundancia relativa de cada muestra se representa mediante la escala de verde a púrpura. El dendrograma de la derecha representa la similitud entre las muestras en función de las frecuencias de subconjunto. La escala de frecuencia representa la dispersión de la media. Una frecuencia baja o alta se representa mediante un color verde o púrpura, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig03.jpg"> Figura 3: Visión general del clúster y abundancia de clústeres por grupo analizado por Cytofast después de FlowSOM. Mapa de calor de todos los cúmulos de células NK (pre-cerrado en CD161+ eventos), que fueron identificados 3 días después de la inmunoterapia (PD-L1). Los datos mostrados se basan en la agrupación en clústeres de FlowSOM y se agrupan a partir de los grupos tratados no tratados y PD-L1. Los niveles del marcador de expresión transformado en ArcSinh5 se muestran en una escala de arco iris. En el panel inferior, la abundancia relativa de cada muestra se representa mediante la escala de verde a púrpura. El dendrograma de la derecha representa la similitud entre las muestras en función de las frecuencias de subconjunto. La escala de frecuencia representa la dispersión de la media. Una frecuencia baja o alta se representa mediante un color verde o púrpura, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig04.jpg"> Figura 4: Representación de citorrápida con diagramas de caja de los clústeres definidos por Cytosplore. La frecuencia de cada clúster se representa en una gráfica de caja, separada en los dos grupos (PBS y PD-L1). Un punto individual corresponde a un ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig05.jpg"> Figura 5: Representación de citovelocidad con diagramas de caja de los clústeres definidos por FlowSOM. La frecuencia de cada clúster se representa en una gráfica de caja, separada en los dos grupos (PBS y PD-L1). Un punto individual corresponde a un ratón. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig06.jpg"> Figura 6: Distribución de las gráficas de intensidad de señal de las células NK cerradas automáticamente por Cytosplore. La distribución de las intensidades de la señal se muestra en un histograma para tres marcadores específicos: CD45, CD11c y CD54. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60525/60525fig07.jpg"> Figura 7: Distribución de las gráficas de intensidad de señal de las células NK silenciadas automáticamente por FlowSOM. La distribución de las intensidades de la señal se muestra en un histograma para tres marcadores específicos: CD45, CD11c y CD54, segregados por los grupos PBS y PD-L1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60525/60525fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivos Suplementarios 1.1–1.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_1.1-1.8.zip" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Archivos Suplementarios 2.1–2.10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_2.1-2.10.zip" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Archivo Suplementario 3. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_3_sample_id_Cytosplore.xlsx.zip" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Archivos Suplementarios 4.1–4.8. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_Files_4.1-4.8.zip" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>
Archivo Suplementario 5. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60525/Supplementary_File_5._sample_id_FlowSOM.xlsx.zip" target="_blank">Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>

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Visualization and Quantification of High-Dimensional Cytometry Data using Cytofast and the Upstream Clustering Methods FlowSOM and Cytosplore

Cytofast es una herramienta de visualización utilizada para analizar la salida de la agrupación en clústeres. Cytofast se puede utilizar para comparar dos métodos de agrupación en clústeres: FlowSOM y Cytosplore. Cytofast puede generar rápidamente una visión cuantitativa y cualitativa de los datos de citometría de masa y resaltar las principales diferencias entre los diferentes algoritmos de agrupación en clústeres.

Visualización y cuantificación de datos de citometría de alta dimensión mediante citorápido y los métodos de agrupación en clústeres ascendentes FlowSOM y Cytosplore

The complexity of data generated by mass cytometry has necessitated new tools to rapidly visualize analytic outcomes. Clustering methods like Cytosplore ...

Los datos generados por la citometría de masas son complejos y deben visualizarse de manera eficiente y sencilla. Cytofast es un método que resalta los patrones inmunológicos dentro de la población de células inmunitarias y determina subconjuntos celulares que están vinculados a tratamientos clínicos o grupos experimentales. Cytofast se puede aplicar después de cualquier método de cristalización como FlowSOM o Cytosplore.Le permitirá descubrir un subconjunto celular que están vinculados al tratamiento clínico o a un grupo experimental. Con este método, usted será capaz de ver la visión general inmunológica de los datos de un vistazo de una manera cuantitativa. Comience creando clústeres con Cytosplore o FlowSOM.Si utiliza Cytosplore, cargue los archivos FCS haciendo clic en Archivos y abra los archivos FCS. A continuación, seleccione un cofactor para la transformación Arco hiperbólico cuando se le solicite y haga clic en Agregar etiqueta de muestra única como canal. Seleccione Ejecutar HSNE para ejecutar un nivel HSNE de tres y esperar a que se genere el mapa.En el primer nivel de HSNE, compruebe las celdas que son positivas para CD161 seleccionando las celdas positivas CD161 y haciendo clic con el botón derecho en el zoom en la selección. En el segundo nivel, repita el procedimiento para alcanzar el tercer nivel con sólo eventos positivos CD161. Una vez que se genera el último mapa TSNE, guarde los clústeres definidos por Cytosplore haciendo clic con el botón derecho en el mapa y eligiendo guardar clústeres.Elija el directorio de los archivos de salida según lo indique Cytosplore y observe esta ubicación porque más adelante se utilizará para cargar archivos FSC en R.Utilice un nombre de solo caracteres simple al cambiar el nombre de los archivos de salida, lo que facilitará la identificación y el manejo adicional y seleccione guardar. Cargue los archivos en R con la función designada readcytosploreFCS. Para limpiar los datos, elimine algunos parámetros como el tiempo y el fondo comprobando la posición de la columna relacionada con sus parámetros innecesarios y eliminándola de la matriz.A continuación, reordene los marcadores para que los marcadores de linaje se muestren primero seguidos de marcadores funcionales. Vincule el archivo de metadatos a los datos generados desde Cytosplore cargando el metarchivo de hoja de cálculo que contiene información clínica. Para realizar la agrupación en clústeres mediante FlowSOM, cargue los datos sin procesar que anteriormente estaban cerrados en eventos positivos CD161 en R con la lectura.función flowSet. Seleccione los marcadores biológicos relevantes seleccionando las columnas adecuadas y transformando los datos de una manera ArcSinh5. Aplique un cofactor de cinco eligiendo cofacter-5 en la función.Agrupe los datos mediante la función FlowSOM y compare FlwoSOM y Cytosplore eligiendo agrupar los datos en 10 subconjuntos igual que la salida previamente yielded por Cytosplore. A continuación, asigne cada celda a su subconjunto identificado y a id de ejemplo.Cargue el archivo de metadatos en R que contiene la asignación de grupo y vincúlalo a los archivos FCS utilizando el código del manuscrito de texto. Cree una lista CF basada en la trama de datos obtenida de FlowSOM.A continuación, reordene los marcadores para que aparezcan de forma similar a la salida del análisis de citosplore. Antes de crear los mapas de calor, genere la tabla de recuento por muestra mediante la función cellCount. Puesto que algunos clústeres contienen menos celdas que otros, escale los datos por clúster especificando scale-true dentro de la función, lo que facilita la vista de la dispersión entre muestras.Visualice los datos con un mapa de calor y, a continuación, visualice con diagramas de cuadro generando el recuento de celdas, pero sin escalar los datos para obtener la frecuencia de cada clúster. Por último, visualice la intensidad de expresión de los marcadores CD45, CD11c y CD54 mediante los nombres de los marcadores de notificación e incluyéndolos en la función de trazado MSI. Cytofast ejecuta varias salidas posibles, incluido el mapa de calor de todos los clústeres identificados en el análisis y basados en la expresión del marcador.El dendrograma en la parte superior representa la similitud jerárquica entre los clústeres identificados. El panel superior muestra otro mapa de calor que muestra la cantidad relativa de subconjuntos correspondientes en cada muestra. Mientras tanto, el dendrograma de la derecha muestra la similitud entre las muestras basadas en frecuencias de subconjuntos que demuestran que el fenotipo de las células asesinas naturales está formado por el tratamiento con PD-L1 tres días después de la inyección.Los mapas de calor combinados se pueden obtener para FlowSOM seguidos de Cytofast y para Cytosplore seguidos de Cytofast. Cytofast también se puede utilizar para presentar los datos cuantitativamente y mostrar los resultados en gráficas de caja. Otra característica que se incluye en el paquete Cytofast es la función de trazado MSI que muestra la gráfica de intensidad de señal mediana de cada marcador por grupo.Esta función permite la detección de cambios globales como aumentos en la expresión de CD54 o CD11c en células asesinas naturales del grupo tratado con PD-L1. Esta técnica es una forma rápida de visualizar y cuantificar datos y se puede utilizar para descubrir nuevas respuestas celulares después de la terapia. Después de este método, el paquete de prueba global en R se puede utilizar para probar un grupo de covariables para la asociación con variables de respuesta.Esto mostrará la correlación entre cada subconjunto y el resultado clínico.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supresión como herramienta de cribado para el reconocimiento de un estado inicial de desequilibrio inmunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Investigación

Inmunología e Infección

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

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ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

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Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

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Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

The immune landscape of the tumor microenvironment (TME) is a determining factor in cancer progression and response to therapy. Specifically, the density ...