De data som samlascytometrin genererar är komplexa och behöver visualiseras på ett effektivt och enkelt sätt. Cytofast är en metod som belyser immunologiska mönster inom immuncellpopulationen och bestämmer cellundergrupper som är kopplade till kliniska behandlingar eller experimentella grupper. Cytofast kan tillämpas efter någon kristallisering metod som FlowSOM eller Cytosplore.
Det kommer att tillåta dig att upptäcka en cell delmängd som är kopplade till klinisk behandling eller en experimentell grupp. Med denna metod kommer du att kunna se den immunologiska översikten av data i korthet på ett kvantitativt sätt. Börja med att skapa kluster med antingen Cytosplore eller FlowSOM.
Om du använder Cytosplore laddar du upp FCS-filerna genom att klicka på Filer och öppna FCS-filer. Välj sedan en kofaktor för Hyperbolic ArcSinh omvandling när du uppmanas och klicka på lägg till unika prov tagg som kanal. Välj kör HSNE för att köra en HSNE-nivå på tre och vänta på att kartan genereras.
På den första HSNE-nivån kontrollerar du de celler som är positiva för CD161 genom att markera de CD161-positiva cellerna och högerklicka på zoom i markering. På den andra nivån, upprepa proceduren för att nå den tredje nivån med endast CD161 positiva händelser. När den sista TSNE-kartan har genererats sparar du de kluster som definieras av Cytosplore genom att högerklicka på kartan och välja spara kluster.
Välj katalog över utdatafilerna som uppmanas av Cytosplore och notera denna plats eftersom det senare kommer att användas för att läsa in FSC-filer i R.Use ett enkelt tecken bara namn när du byter namn på utdatafiler som kommer att göra identifiering och ytterligare hantering lättare och välj spara. Ladda filerna i R med den utsedda funktionen readcytosploreFCS. Om du vill rensa data, ta bort vissa parametrar som tid och bakgrund genom att kontrollera positionen för kolumnen som rör dess onödiga parametrar och ta bort den från matrisen.
Därefter ändrar du om markörerna så att härstamningsmarkörer visas först följt av funktionella markörer. Länka metadatafilen till de genererade uppgifterna från Cytosplore genom att ladda upp metafilen för kalkylblad som innehåller klinisk information. Om du vill utföra klustring av FlowSOM läser du in rådata som tidigare gated på CD161 positiva händelser i R med läsningen.
funktionen FlowSet. Välj relevanta biologiska markörer genom att välja rätt kolumner och omvandla data på ett ArcSinh5-sätt. Applicera en kofaktor på fem genom att välja cofacter=5 i funktionen.
Klustra data med funktionen FlowSOM och jämför FlwoSOM och Cytosplore genom att välja att klustra data i 10 delmängder samma som de utdata som tidigare getts av Cytosplore. Tilldela sedan varje cell till dess identifierade delmängd och exempel-ID.Läs in metadatafilen i R som innehåller grupptilldelningen och länka den till FCS-filerna med hjälp av koden från textmanuskriptet. Skapa en CF-lista baserat på dataframe som erhålls från FlowSOM.
Ändra sedan ordning på markörerna så att de visas på samma sätt som utdata från Cytosplore-analysen. Innan du skapar värmekartorna generera du uppräkningstabellen per prov med hjälp av funktionscellenCount. Eftersom vissa kluster innehåller färre celler än andra, skalar du data per kluster genom att ange skala=sant inuti funktionen vilket gör det enkelt att se spridningen bland samplingar.
Visualisera data med en värmekarta sedan visualisera med ruta tomter genom att generera cellen räkna men inte skalning av data för att få frekvensen av varje kluster. Slutligen visualisera uttrycksintensiteten för CD45- CD11c- och CD54-markörerna genom att notermarkörnamnen och inkludera dem i msi-plotfunktionen. Cytofast kör flera möjliga utgångar inklusive värmekartan över alla kluster som identifierats i analysen och baserat på marköruttryck.
Dendrogrammet på toppen representerar den hierarkiska likheten mellan de identifierade klustren. Den övre panelen visar en annan värmekarta som visar den relativa kvantiteten av motsvarande delmängder i varje prov. Samtidigt visar dendrogram till höger likheten mellan prover baserat på delmängd frekvenser som visar att fenotyp av naturliga mördarceller formas av PD-L1 behandling tre dagar efter injektion.
De kombinerade värmekartorna kan erhållas för FlowSOM följt av Cytofast och för Cytosplore följt av Cytofast. Cytofast kan också användas för att presentera data kvantitativt och visa resultaten i rutan tomter. En annan funktion som ingår i Cytofast-paketet är MSI-plotfunktionen som visar mediansignalintensitetsriten för varje markör per grupp.
Denna funktion gör det möjligt att upptäcka globala förändringar såsom ökningar i uttrycket av CD54 eller CD11c i naturliga mördarceller av PD-L1-behandlade gruppen. Denna teknik är ett snabbt sätt att visualisera och kvantifiera data och kan användas för att upptäcka nya cellulära svar efter terapi. Efter den här metoden kan det globala testpaketet i R användas för att testa en grupp kovariater för association med svarsvariabler.
Detta kommer att visa korrelationen mellan varje delmängder och det kliniska resultatet.
