Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

ونود ان نشكر الدكتورة سارالا برادان علي العمل علي إصدار سابق لهذا البروتوكول. ونود ان نشكر NSF-دائره الرقابة الخارجية 1354282 للحصول علي التمويل في حين وضعنا هذا البروتوكول. نود ان نشكر المعاهد القومية للصحة-NIDCR RO1DE025311 لتمويل مختبرنا حاليا.

1. جمع البيض لتوليد اليرقات لتشريح
<ol><li>الصليب 30-40 عذراء الإناث GAL4/TM6 Tb هو الذباب إلى 10-15 ذكر Sp/CyO-GFP ؛ UAS-الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP/TM6 Tb هو. ملاحظه: ويمكن استخدام اي نوعين من الأنماط الجينية التي تحتوي علي GAL4 و uas-النيابة التقدمية ، طالما كان لموازن علامات يرقات تسمح باختيار النسل الم...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs مثل النيابة العامة جعل تاثيرها الكبير عندما ربط معقده من المستقبلات غشاء ملزمه للتسبب في سلسله من الإشارات داخل الخلايا في المجاورة أو علي ما يبدو النائية. وقد أظهرت مختبر الدكتور توماس كورنبرغ ان الخلايا التي تنتج الخلايا الاتصال اشاره النيابة التقدمية التي تتلقي الاشاره باستخدام ال...

البروتينات الدهنية العظمية (BMPs) ضرورية لتولد الاجنه في وقت مبكر وزخرفه هياكل البالغين. يتم إنتاج BMPs ويفرز للتاثير علي النسخ من الجينات المستهدفة اللازمة للنمو وتمايز الخلايا في الخلايا المستجيبة. قطع الراس (النيابة التقدمية) هي دروفيميلا هوكولوغ من BMP4 التي هي مهمة لتطوير البني الجنينية والبالغين مثل الجناح1،2،3،4. وقد ركزت عده مجموعات علي دور النيابة العامة في اجنحه يطير الكبار زخرفه لان 1) وتتالف الاجنحه من اثنين من أوراق النعت شفافة مع نمط التعرق متسقة التي يمكن تقييمها بسهوله; 2) أقراص الجناح هي أيضا مسطحه بشكل معقول ، يمكن ان يكون مثقفا خارج اليرقة ، وبسيطه للصورة والاختلافات الكمية في نمط ؛ و 3) الجناح نمط التنمية حساسة لل النيابة العامة من هذا القبيل ان الاضطرابات الصغيرة في المسار سوف تؤثر علي نمط تعرق الجناح.
يتم إنتاج النيابة العامة في الخلايا الموجودة في الحدود الاماميه/الخلفية للقرص الجناح5،6،7،8. النيابة التقدمية يربط إلى مجمع من نوع 1 ونوع 2 سيرين/threonine كيناز مستقبلات9,10. علي [شف] ربط, النوع 2 مستقبل فوسفولات النوع 1 مستقبل اي بعد ذلك [فوسفورلتس] أمهات ضد [شف] ([ماد]), [سماد] 1/5/8 [هوولوغ]. [فوسفورلتد] [سماد] يجند اضافيه [ك-سماد] ([مديه]), اي يمكن هو دخلت إلى النواة حيث هو ينظم مورثات مستهدفه, يقود إلى مصب تاثيرات مثل انتشار أو تمييز4,11.
في الاونه الاخيره ، وقد أظهرت مختبر بيتس ان الإفراج غير لائق من النيابة العامة داخل القرص الجناح يمكن ان يؤدي إلى انخفاض في الفوسفات جنون ، والحد من التعبير الجيني المستهدف ، والجناح زخرفه العيوب12،13. العديد من القناات الايونيه تؤثر علي تطوير جناح دروفيبيلا والهياكل المرتبطة به14،15. ويمكن ان تشارك هذه القناات الايونيه أيضا في الإفراج عن النيابة العامة. في تحديد اليه الإفراج عن مورفجين ، من المهم ان هناك طريقه لتصور احداث الإصدار.
وقد إنشا السيد اوريليو تيلمان وستيفن كوهين بروتينا منصهرا للتقدمي-GFP قادرا علي إنقاذ فقدان النيابة العامة ، وهذا يعني انها نشطه بيولوجيا ويتم إطلاقها بطريقه ذات صله بيولوجيا16. هنا ، ونحن وصف كيف يمكننا تصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام هذا الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. هذا البروتين الانصهار مفيد بشكل خاص لان GFP حساسة لدرجه الحموضة حيث انه عندما يكون في الحويصلات الحمضية ، ويروي فلوري17. ولذلك ، عندما يتم الإفراج عن بروتين الموسومة مع GFP من حويصلة في بيئة أكثر حياديه خارج الخلية ، وزيادة كثافة الفلورية GFP17. أخذنا الاستفادة من حساسية الأس الهيدروجيني من GFP لتحديد ما إذا كان النائب العام التقدمي-GFP يقيم في الحويصلات الحمضية. نحن تصوير أقراص الجناح التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي-gfp قبل وبعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، والتي تحييد المقصورات داخل الخلايا الحويصلات18. وجدنا زيادة كبيره في مضان من الثقوب بعد أضافه كلوريد الأمونيوم ، مما يوحي بان التقدمي-GFP داخل الخلايا هو مروي قبل أضافه كلوريد الأمونيوم18. ونحن نستنتج ان النيابة العامة داخل الخلايا-GFP يتواجد في مقصورات الغشاء الحمضية ، مثل الحويصلات ، وغير مروي علي أضافه كلوريد الأمونيوم لتحييد الأس الهيدروجيني من المقصورات داخل الخلايا18. وهذا يجعل التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-GFP أسلوبا مفيدا لتصور ديناميات النيابة العامة في قرص جناح دروفيسيلا حيث يتم إطلاقها من المقصورات الحمضية في البيئة خارج الخلية.
هنا ، ونحن وصف الطريقة التي نستخدمها لتصور الاحداث الإفراج عن النيابة التقدمية باستخدام الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP. ويمكن التعبير عن الحزب التقدمي الاشتراكي في نمطه الأصلي في أقراص جناح دروفيا باستخدام نظام GAL419. هذا هو الأسلوب الذي تم استخدامه لتحديد ان قنوات Irk تؤثر علي الإفراج عن النيابة العامة18. قمنا بالتحقق من صحة الأسلوب عن طريق التصوير الحي لأكوام z. نحن لا نري الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP ثقب في التحرك داخل الطائرة من التركيز في سلسله زمنيه إذا حصلنا علي مستوي واحد من التركيز. كما اننا لا نري حركه النيابة العامة-GFP ثقب إذا كنا الذين في كومه z. ونستنتج ان ثقب النيابة-GFP التي شوهدت باستخدام هذه الطريقة هي احداث الإفراج بدلا من حركه الحويصلات اينتراسيلولارلي. ويمكن استخدام هذه الطريقة من التصوير الحي للحزب التقدمي الاشتراكي-gfp لاختبار المعدلات المفترضة الأخرى من الإفراج عن النيابة التقدمية لتاثيرها علي ديناميات النيابة التقدمية أو يمكن تعديلها للنظر في ديناميات يغاندس الأخرى

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

عامل النمو تحويل-بيتا (tgf-β) [سوبرفميلي] ضروري لزخرفه الجنينية في وقت مبكر وتطوير هياكل الكبار في الكائنات متعددة الخلايا. وتشمل العائلة الفائقة TGF-β TGF-β ، بروتين العظام الموريفوجيني (BMPs) ، Activins ، والنمو وعوامل التمايز ، وعقيديه. ومن المعروف منذ فتره طويلة ان كميه الاربطه المعرضة للخلايا مهمة لأثاره. وكان يعتقد ان تدرجات التركيز طويلة المدى اعداد نمط الجنينية. ومع ذلك ، أصبح من الواضح في الاونه الاخيره ان توقيت التعرض لهذه اليغاندس مهم أيضا لعواقبها النقل النهائي. ولا يمكن ان يكون لهذه الاسره الفائقة الأثر التنموي حتى يتم إطلاقها من الخلية التي أنتجت فيها. وحتى وقت قريب ، كان من الصعب تحديد متى تم الإفراج عن هؤلاء المدافعين من الخلايا. هنا نعرض كيفيه قياس الإفراج عن دروفيسيلا BMP تسمي ديبننتابلاييك (النيابة التقدمية) من خلايا الجناح القرص أو الجناح. يمكن تعديل هذه الطريقة للانظمه الأخرى أو للاشاره إلى الإشارات الليفية.

ويبين الشكل 2 نتائج التصوير الحي التمثيلية لهذا البروتوكول. وعندما يكون البروتوكول ناجحا ، يمكن اعتبار الحزب التقدمي الاشتراكي-GFP مخططا أسفل وسط القرص الجناح مع وجود نوى مرئية كدوائر غير فلورية داخل منطقه النيابة التقدمية-GFP (الشكل 2). الإفراج عن النيابة الت...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

وقد يؤثر توقيت التعرض للمضايق علي اثارها الانمائيه. هنا نعرض كيفيه الإفراج عن صوره من البروتين الوراثي العظام دروفوليا (BMP) تسمي النيابة التقدمية من خلايا القرص الجناح.

التصوير التقدمي الإفراج عن القرص الجناح دروفيا

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP تؤثر على مصير الخلية عن طريق مستقبلات ملزمة وإرسال إشارة داخل الخلايا للتأثير على النسخ. إذا تم إنتاج DPP ولكن لم يتم إصداره ، فإنه لا يملك إمكانية الوصول إلى المستقبلات وبالتالي لا يمكنه أداء أدواره. هذه التقنية تجعل من الممكن تصور إطلاق DPP مما يتيح للباحثين فحص العوامل الوراثية والبيئية التي تغير ديناميكيات إطلاق DPP.يتم الحفاظ على مسار إشارة BMP من الذباب إلى البشر لذلك نتوقع أن تكون الآلية التي تملي إطلاق DPP ذات صلة أيضًا بالتنمية البشرية والتجدد. تبدأ عن طريق عبور 30 إلى 40 عذراء أنثى DPP GAL4 الذباب مع 10 إلى 15 الذباب الذكور UAS DPP-GFP الذباب. تشجيع وضع البيض عن طريق إضافة كمية صغيرة من معجون الخميرة إلى قارورة طازجة من الطعام.لجمع البيض، قم بقلب الذباب المتقاطع في القارورة والسماح لهم بالتمدد لمدة ثلاث إلى أربع ساعات قبل إزالتها. حافظ على قارورة جمع البيض عند 25 درجة مئوية لمدة 144 ساعة تقريبًا حتى تكون اليرقات في المرحلة الثالثة من النجوم. ثم حدد اليرقات المناسبة للتشريح.أولاً، اختر اليرقات غير السل التي ستكون طول طبيعي بدلاً من قصيرة والدهون. لتحديد DPP-GFP التعبير عن اليرقات، وعرضها تحت المجهر ستيريو الفلوريسنس. وسيكون لجميع اليرقات غير السل بعض الفلور، ولكن GFP يقتصر على أقراص الجناح وأقل إشراقا على يرقات DPP-GFP.إعداد وسائل الإعلام HL3 المعدلة وفقا لاتجاهات المخطوطات التي سوف تبقي أقراص الجناح على قيد الحياة للتصوير. ضبط درجة الحرارة إلى 7.1 مع HEPES ثم تصفية من خلال مرشح ميكرومتر 0.22. ضع قطعتين من عديم اللون عرض الشريط على الوجهين من الحكمة عبر شريحة المجهر ترك مساحة من حوالي خمسة ملليمترات بينهما والتأكد من أن نهايات الشريط مسح مع حواف الشريحة.استخدم حافة مسطحة للضغط على الشريط بقوة إلى الشريحة. إضافة 25 ميكروليترس من الوسائط HL3 المعدلة بين قطعتي الشريط. عندما يتم تركيب قرص الجناح في وسائل الإعلام، فإن قطع الشريط تمنعه من السحق بواسطة الغطاء.لتشريح اليرقة ، ضعها في وسائط HL3 المعدلة وتمزيقها بلطف إلى نصفين باستخدام زوجين من ملقط. تخلص من النصف الخلفي ، ثم فهم منتصف النصف الأمامي مع زوج واحد من ملقط واستخدام الزوج الآخر لدفع السنانير الفم مرة أخرى إلى اليرقة حتى يتم عكس ذلك تماما. ابحث عن الانحناءات الحادة في اثنين من أغمق الفروع الأولية الملونة من القصبة الهوائية التي تسيل أسفل جانبي اليرقة.أقراص الجناح تقع مباشرة تحتها. قم بإزالة الأقراص بلطف ووضعها في وسائط HL3 على الشريحة المعدة للتأكد من عدم وجود قطع من القصبة الهوائية لا تزال متصلة بالاسطوانات. ترتيب أقراص الجناح بحيث الجانب حولية من الحقيبة الجناح تواجه صعودا مع القرص الكذب شقة.تغطية الجناح مع غطاء وختم مع طلاء الأظافر. بمجرد أن يجف البولندية ، والمضي قدما على الفور مع التصوير. صورة القرص الجناح المركب باستخدام مجهر ليزر التفحص confocal مع هدف النفط 40X و488 نانومتر الليزر.جمع الصور بسرعة اثنين من هيرتز لمدة دقيقتين. للحصول على أفضل النتائج، تعيين قوة الليزر قوية بما يكفي للحصول على صورة واضحة للخلايا DPP الإفراج لتجنب أكثر من التبييض. جمع الصور كسلسلة زمنية وتصديرها كملفات AVI للحصول على فيديو لإطلاق سراح DPP.عندما يكون البروتوكول ناجحاً، يظهر DPP-GFP كقعر أسفل وسط القرص الجناح مع النوى مرئية كدوائر غير فلورية. يُرى إطلاق DPP-GFP مثل الـ puncta الفلورسنت التي تظهر وتختفي داخل وخارج أجسام الخلايا. ومن المرجح أن تكون البوتكا المتميزة في السيتونات أو في نقاط الاشتباك العصبي السيتونية.يتم تركيب أقراص الجناح بحيث يتم التصوير من الجانب حولي. إذا تم تصوير القرص الجناح من الجانب العكسي، فإن الفلوراس DPP-GFP سوف تظهر من التركيز والقرار سيكون ضعيفا. عندما لا يتم دمج GFP إلى DPP، لا يتم ملاحظة أي puncta خارج من أجسام الخلايا.يوضح عنصر التحكم هذا سلوك DPP-GFP بشكل مختلف عن GFP وحدها. وعلاوة على ذلك، لا تظهر أي فلورسنت بونتا عندما لا يتم التعبير عن DPP-GFP. أثناء هذا الإجراء، من المهم أن يتم تحميل القرص الجناح الجانب حولية.إذا كان القرص الجناح بشكل غير صحيح الموجهة، DPP-GFP سوف تظهر خارج التركيز. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الإفراج عن غيرها من الإشارات التنموية يغاندس مثل الجناح أو القنفذ. يمكننا استكشاف جميع العوامل البيئية والجينية المختلفة التي قد تؤثر على إطلاق DPP.وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا تكييف هذه الطريقة لدراسة إطلاق BMP من أنواع الخلايا الأخرى.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

التصوير تستقيم من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; غرف البيض

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

التصوير الكالسيوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; في تنشيط البيض

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

طريقة مباشرة وبسيطة لتقييم قدرة دروسوفيلا ميلانوغاسترعلى البقاء من الجنين إلى الكبار

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

التصوير داخل النواة أكتين رودز في الحرارة الحية وشدد الأجنة Drosophila

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

التصوير الحيواني كله من الميلانوغاستر Drosophila باستخدام التصوير المقطعي microcomputed

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

تشريح وتصوير حي للغدد التناسلية ذبابة الفاكهة الجنينية المتأخرة

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...