Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Sarala Pradhan for at have arbejdet på en tidligere version af denne protokol. Vi vil gerne takke NSF-IOS 1354282 for finansiering, mens vi udviklede denne protokol. Vi vil gerne takke NIH-NIDCR RO1DE025311 for at finansiere vores laboratorium i øjeblikket.

1. opsamling af æg til frembringe larver til dissektion
<ol><li>Cross 30-40 jomfru kvindelige DPP-GAL4/TM6 TB Hu flyver til 10-15 mandlige SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB Hu. Bemærk: Alle to genotyper, der indeholder DPP-GAL4 og UAS-DPP-GFP, kan anvendes, så længe balancerne har larve markører, som gør det muligt at vælge det relevante afkom i larvestadiet.</li>
	<li>For at indsamle æg, flip de krydsede fluer i en frisk hætteglas med mad og tillade dem at lægge for 3 – 4 h før du fjerner...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs som DPP gør deres betydelige indflydelse, når de binder et kompleks af membranbundne receptorer til at forårsage en kaskade af intracellulære signalering i tilstødende eller tilsyneladende fjerne celler. Dr. Thomas kornbergs laboratorium har vist, at celler, der producerer DPP signal kontakt celler, der modtager signalet ved hjælp af actin baseret tynde filapodia-lignende strukturer kaldet cytonemes15,24,25. Disse dat...

Knogle morfogenetiske proteiner (BMPs) er afgørende for tidlig embryogenese og mønster af voksne strukturer. BMPs produceres og udskilles for at påvirke transkriptionen af målgener, der er nødvendige for vækst og Celledifferentiering i responderende celler. Decapentaplegic (DPP) er en Drosophila ligner af BMP4, der er vigtig for udviklingen af embryonale og voksne strukturer som vinge1,2,3,4. Flere grupper har fokuseret på rollen som DPP i mønstret voksen flue vinger, fordi 1) vingerne består af to gennemsigtige epitel ark med et konsistent åretegningen mønster, der let kan vurderes; 2) vinge skiver er også rimeligt fladt, kan dyrkes uden for Larven, og er enkle at billede og kvantificere forskelle i mønster; og 3) vinge mønsteret udvikling er følsom over for DPP sådan, at små forstyrrelser i vejen vil påvirke vinge åretegningen mønster.
DPP produceres i celler beliggende i den forreste/bageste grænse af vinge skiven5,6,7,8. DPP binder sig til et kompleks af type 1 og type 2 Serin/threonine kinase receptorer9,10. Ved DPP binding, type 2 receptor fosforylerer type 1 receptor, som derefter fosforylerer mødre mod DPP (mad), en SMAD 1/5/8 homolog. Fosforylerede SMAD rekrutterede en yderligere Co-SMAD (Medea), som gør det muligt at komme ind i kernen, hvor det regulerer målgener, hvilket fører til downstream-effekter såsom spredning eller differentiering4,11.
For nylig, Bates Lab har vist, at forkert frigivelse af DPP i vinge skiven kan føre til et fald i mad fosforylering, reduktion i Target genekspression, og vinge mønster defekter12,13. Flere ion-kanaler påvirker udviklingen af Drosophila -fløjen og tilhørende strukturer14,15. Disse ion-kanaler kan også være involveret i DPP-udgivelse. Ved fastsættelsen af mekanismen i morphogen frigivelse, er det vigtigt, at der er en metode til at visualisere frigivelse begivenheder.
DRs. Aurelio Teleman og Stephen Cohen skabte et DPP-GFP-fusionsprotein, der kan redde tab af DPP, hvilket betyder, at det er biologisk aktivt og frigives på en biologisk relevant måde16. Her beskriver vi, hvordan vi visualiserer DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af denne DPP-GFP. Dette fusionsprotein er især nyttigt, fordi GFP er pH-følsom, således at fluorescensen slukkes17, når det er i sure vesikler. Når et protein mærket med GFP frigives fra et vesikel til det mere neutrale ekstracellulære miljø, øger GFP-fluorescens intensitet17. Vi udnyttede GFP ' pH-følsomhed til at afgøre, om DPP-GFP bor i sure vesikler. Vi afbildet vinge skiver udtrykker DPP-gfp før og efter tilsætning af ammoniumklorid, som neutraliserer intracellulære rum vesikler18. Vi fandt en signifikant stigning i fluorescens af punkta efter tilsætning af ammoniumklorid, hvilket tyder på, at intracellulær DPP-GFP er slukket før tilsætning af ammoniumklorid18. Vi konkluderer, at intracellulære DPP-GFP bor i sure membranbundne rum, såsom vesikler, og er slukket ved tilsætning af ammoniumklorid for at neutralisere pH af intracellulære rum18. Dette gør levende billeddannelse af DPP-GFP en nyttig teknik til at visualisere dynamikken i DPP i Drosophila Wing disc, da det er frigivet fra sure rum i det ekstracellulære miljø.
Her beskriver vi den metode, vi bruger til at visualisere DPP-udgivelses hændelser ved hjælp af DPP-GFP. DPP-GFP kan udtrykkes i sit oprindelige mønster i Drosophila Wing discs ved hjælp af UAS-GAL4 system19. Dette er den metode, der blev brugt til at bestemme, at irk-kanaler påvirker DPP Release18. Vi validerede metoden ved Live-imaging z-stakke. Vi kan ikke se DPP-GFP punkta bevæger sig inden for det plan af fokus i Time Series, hvis vi har erhvervet i et plan af fokus. Vi kan heller ikke se bevægelsen af DPP-gfp punkta, hvis vi afbildet i en z-stak. Vi konkluderer, at DPP-GFP punkta set ved hjælp af denne metode er frigivelse hændelser snarere end flytning af vesikler intracellulært. Denne metode til Live-imaging af DPP-gfp kunne potentielt bruges til at teste andre formodede modifikatorer af DPP frigivelse for deres indvirkning på DPP dynamik eller kunne ændres til at se på dynamikken i andre ligander

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Den transformerende vækstfaktor-Beta (TGF-β) super familie er afgørende for tidlig embryonale mønster og udvikling af voksne strukturer i flercellede organismer. Den TGF-β superfamilien omfatter TGF-β, knogle morfogenetisk protein (bmps), activins, vækst og differentiering faktorer, og nodals. Det har længe været kendt, at mængden af ligand udsat for celler er vigtig for dens virkninger. Det blev antaget, at langtrækkende koncentrations gradienter oprettet embryonale mønster. Men for nylig er det blevet klart, at tidspunktet for udsættelse for disse ligander er også vigtigt for deres downstream transkriptionelle konsekvenser. En TGF-β super familie ligand kan ikke have en udviklingsmæssige konsekvens, før den frigives fra den celle, hvor den blev produceret. Indtil for nylig var det svært at afgøre, hvornår disse ligander blev frigivet fra celler. Her viser vi hvordan man måler frigivelsen af en Drosophila BMP kaldet Decapentaplegic (DPP) fra cellerne i Wing primordium eller Wing disc. Denne metode kan ændres for andre systemer eller signalering ligands.

Figur 2 viser repræsentative Live-imaging resultater af denne protokol. Når protokollen er vellykket, kan DPP-GFP ses som en stribe ned i midten af vinge skiven med kerner, der er synlige som ikke-fluorescerende cirkler i DPP-GFP-regionen (figur 2). DPP-GFP-frigivelse er synlig som fluorescerende punkta, der vises og forsvinder. Vi har observeret DPP-GFP fluorescens optræder og forsvinder i cellen organer og langt fra cellen organer. DPP signalering er afhæn...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres udviklingsmæssige konsekvenser. Her viser vi hvordan man billede frigivelse af en Drosophila knogle morfogenetisk protein (BMP) kaldet DPP fra celler i vinge skiven.

Billedbehandling DPP-udgivelse fra en Drosophila -vinge skive

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP påvirker cellernes skæbne ved at binde receptorer og sende et signal intracellulært for at påvirke transskriptionen. Hvis DPP produceres, men ikke frigives, har det ikke adgang til receptorer og kan derfor ikke udføre sine roller. Denne teknik gør det muligt at visualisere DPP frigivelse gør det muligt for forskere at undersøge, hvilke genetiske og miljømæssige faktorer ændre DPP frigivelse dynamik.BMP-signalvejen bevares fra fluer til mennesker, så vi forventer, at den mekanisme, der dikterer DPP-frigivelse, også vil være relevant for menneskelig udvikling og regenerering. Begynd med at krydse 30 til 40 jomfru kvindelige DPP GAL4 fluer med 10 til 15 mandlige UAS DPP-GFP fluer. Tilskynde æglægning ved at tilføje en lille mængde gær pasta til en frisk hætteglas med mad.For at indsamle æggene, flip de krydsede fluer i hætteglasset og lad dem lægge i tre til fire timer, før du fjerner dem. Hold ægindsamlingshætteglassene ved 25 grader Celsius i ca. 144 timer, indtil larverne er på tredje instarscene. Vælg derefter de relevante larver til dissektion.Først skal du vælge larver, der er ikke-TB, som vil være normal længde snarere end kort og fedt. Hvis du vil vælge DPP-GFP, der udtrykker larver, skal du se dem under et fluorescenssteremikroskop. Alle ikke-TB larver vil have en vis fluorescens, men GFP er begrænset til vingediske og er mindre lyse på DPP-GFP larver.Forbered modificerede HL3 medier i henhold til manuskript retninger, som vil holde vingen diske i live til billedbehandling. Juster pH-3 til 7,1 med HEPES, og filtrer den derefter gennem et 0,22 mikrometerfilter. Placer to stykker farveløs dobbeltsidet tape bredde klogt på tværs af et mikroskop dias forlader et mellemrum på omkring fem millimeter mellem dem og sørg for, at enderne af båndet ligger skyllet med kanterne af diaset.Brug en flad kant til at trykke tapetet fast til sliden. Tilføj 25 mikroliter af de modificerede HL3-medier mellem de to stykker tape. Når vingeskiven er monteret i mediet, vil tapestykkerne forhindre, at den bliver knust af dækslæden.At dissekere larverne, placere den i den modificerede HL3 medier og forsigtigt rive det i halve ved hjælp af to par saftænt. Kassér den bageste halvdel, derefter gribe midten af den forreste halvdel med et par kraftaffængbånd og bruge det andet par til at skubbe munden kroge tilbage i larven, indtil det er helt omvendt. Kig efter de skarpe bøjninger i de to mørkere farvede primære grene af luftrøret, der løber ned begge sider af larven.Vingeskiverne ligger lige nedenunder. Fjern forsigtigt skiverne og læg dem i HL3-mediet på det forberedte dias og sørg for, at der stadig ikke er fastgjort stykker af luftrør til skiverne. Arranger vingeskiverne, så den peripodial side af vingeposen vender opad med disken liggende fladt.Dæk vingen med en dæksel og forsegling med neglelak. Når polerlakken er tør, skal du straks fortsætte med billeddannelse. Billede den monterede vingeskive ved hjælp af en konfokal laserscanning mikroskop med en 40X olie mål og en 488 nanometer laser.Saml billeder med en hastighed på to hertz i to minutter. For de bedste resultater, indstille laser magt lige stærk nok til at få et klart billede af DPP-releasing celler for at undgå over blegning. Saml billederne som en tidsserie og eksportere dem som AVI-filer for at få en video af DPP frigivelse.Når protokollen lykkes, vises DPP-GFP som en stribe ned midt på vingeskiven med kerner, der er synlige som ikke-fluorescerende cirkler. DPP-GFP frigivelse er synlig som fluorescerende punktformet, der vises og forsvinder både i og langt væk fra celle organer. De forskellige punktform og er sandsynligvis i cytoner eller ved cytonemes synapser.Vingeskiverne er monteret, så billeddannelsen udføres fra peripodial siden. Hvis vingeskiven er afbildet fra bagsiden, vises DPP-GFP-fluorescensen uden for fokus, og opløsningen vil være dårlig. Når GFP ikke er smeltet til DPP, observeres der ingen punktform og uden for celleorganerne.Dette kontrolelement viser, at DPP-GFP opfører sig anderledes end GFP alene. Desuden vises der ingen fluorescerende punktform, når DPP-GFP ikke udtrykkes. Under denne procedure er det vigtigt, at vingeskiven monteres peripodial side op.Hvis vingeskiven er forkert orienteret, vises DPP-GFP uden fokus. Denne metode kan bruges til at studere frigivelsen af andre udviklingsmæssige signalering ligander som vingeløs eller pindsvin. Vi kan udforske alle de forskellige miljømæssige og genetiske faktorer, der kan påvirke DPP frigivelse.Derudover kan vi tilpasse denne metode til at studere BMP frigivelse fra andre celletyper.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Levende-billeddannelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppe Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Aktivering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsigtet Live-Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Stænger i Live Heat Stressed Drosophila Embryoner

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Hele Animal Imaging af Drosophila melanogaster ved hjælp af microcomputed tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissektion og levende billeddannelse af den sene embryonale Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...