Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
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Wir möchten Dr. Sarala Pradhan für die Arbeit an einer früheren Version dieses Protokolls danken. Wir möchten NSF-IOS 1354282 für die Finanzierung danken, während wir dieses Protokoll entwickelt haben. Wir danken NIH-NIDCR RO1DE025311 für die Finanzierung unseres Labors.

1. Sammeln von Eiern, um Larven für die Dissektion zu generieren
<ol><li>Cross 30-40 jungfrau weibchen Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu fliegt zu 10-15 männlich Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. HINWEIS: Zwei Genotypen, die Dpp-GAL4 und UAS-Dpp-GFP enthalten, können verwendet werden, solange die Balancer Larvenmarker haben, die die Auswahl der entsprechenden Nachkommen während der Larvenphase ermöglichen.</li>
	<li>Um Eier zu sammeln, kippen Sie die gekreuzten Fliegen in eine frische Durchstechflasche mit L...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs wie Dpp machen ihre signifikante Wirkung, wenn sie einen Komplex von membrangebundenen Rezeptoren binden, um eine Kaskade von intrazellulären Signalisierung in benachbarten oder scheinbar entfernten Zellen zu verursachen. Das Labor von Dr. Thomas Kornberg hat gezeigt, dass Zellen, die die Dpp-Signalkontaktzellen erzeugen, die das Signal mit actinbasierten dünnen Filapodie-ähnlichen Strukturen empfangen, die Zytome15,24,25</sup...

Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind für die frühe Embryogenese und Musterung von erwachsenen Strukturen unerlässlich. BMPs werden produziert und abgesondert, um die Transkription von Zielgenen zu beeinflussen, die für das Wachstum und die Zelldifferenzierung in reagierenden Zellen benötigt werden. Decapentaplegic (Dpp) ist ein Drosophila Homolog von BMP4, das für die Entwicklung von embryonalen und erwachsenen Strukturen wie dem Flügel1,2,3,4wichtig ist. Mehrere Gruppen haben sich auf die Rolle von Dpp bei der Musterung von erwachsenen Fliegenflügeln konzentriert, da 1) die Flügel aus zwei transparenten Epithelia-Blättern mit einem konsistenten Venationsmuster bestehen, das leicht beurteilt werden kann; 2) die Flügelscheiben sind auch einigermaßen flach, können außerhalb der Larve kultiviert werden und sind einfach zu bilden und zu quantifizieren Unterschiede im Muster; und 3) die Flügelmusterentwicklung ist empfindlich gegenüber Dpp, so dass kleine Störungen im Weg flügelvenationsmuster beeinflussen.
Dpp wird in Zellen in der vorderen/hinteren Grenze der Flügelscheibe5,6,7,8produziert. Dpp bindet an einen Komplex von Typ 1 und Typ 2 Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren9,10. Bei Dpp-Bindung phosphorisiert der Typ-2-Rezeptor den Typ-1-Rezeptor, der dann Mütter gegen Dpp (Mad), einen Smad 1/5/8 Homolog, phosphoryliert. Phosphorylierte SMAD rekrutiert einen zusätzlichen Co-Smad (Medea), der es ermöglicht, in den Kern einzutreten, wo es Zielgene reguliert, was zu nachgelagerten Effekten wie Proliferation oder Differenzierung4,11führt.
Kürzlich hat das Bates Lab gezeigt, dass die unsachgemäße Freisetzung von Dpp innerhalb der Flügelscheibe zu einer Abnahme der Mad-Phosphorylierung, einer Verringerung der Zielgenexpression und Flügelmusterdefekten12,13führen kann. Mehrere Ionenkanäle beeinflussen die Entwicklung des Drosophila-Flügels und der zugehörigen Strukturen14,15. Diese Ionenkanäle könnten auch an der Dpp-Veröffentlichung beteiligt sein. Bei der Bestimmung des Mechanismus der Morphogenfreisetzung ist es wichtig, dass es eine Methode gibt, um Freisetzungsereignisse zu visualisieren.
Drs. Aurelio Teleman und Stephen Cohen schufen ein Dpp-GFP-Fusionsprotein, das in der Lage ist, den Verlust von Dpp zu retten, was bedeutet, dass es biologisch aktiv ist und auf biologisch relevante Weise freigesetzt wird16. Hier beschreiben wir, wie wir Dpp-Release-Ereignisse mit diesem Dpp-GFP visualisieren. Dieses Fusionsprotein ist besonders nützlich, da GFP pH-empfindlich ist, so dass, wenn es in sauren Vesikeln ist, die Fluoreszenz abgeschreckt wird17. Wenn also ein mit GFP markiertes Protein aus einem Vesikel in die neutralere extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird, erhöht sich die GFP-Fluoreszenzintensität um17. Wir nutzten die pH-Empfindlichkeit von GFP, um festzustellen, ob Dpp-GFP in sauren Bläschen liegt. Wir abgebildetflügelförmige Nvenzen, die Dpp-GFP vor und nach dem Zusatz von Ammoniumchlorid ausdrücken, das intrazelluläre Kompartimente neutralisiert18. Wir fanden eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz von Punktikern nach der Zugabe von Ammoniumchlorid, was darauf hindeutet, dass intrazelluläres Dpp-GFP vor der Zugabe von Ammoniumchlorid18abgeschreckt wird. Wir schlussfolgern, dass sich intrazelluläres Dpp-GFP in sauren membrangebundenen Kompartimenten wie Vesikeln befindet und nach Zugabe von Ammoniumchlorid unausgequetscht wird, um den pH-Wert der intrazellulären Kompartimente zu neutralisieren18. Dies macht die Live-Bildgebung von Dpp-GFP zu einer nützlichen Technik, um die Dynamik von Dpp in der Drosophila-Flügelscheibe zu visualisieren, da sie aus sauren Kompartimenten in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wird.
Hier beschreiben wir die Methode, mit der wir Dpp-Release-Ereignisse mit Dpp-GFP visualisieren. Dpp-GFP kann in seinem nativen Muster in Drosophila Flügelscheiben mit dem UAS-GAL4 System19ausgedrückt werden. Dies ist die Methode, die verwendet wurde, um zu bestimmen, dass Irk-Kanäle Dpp-Version18beeinflussen. Wir validierten die Methode durch Live-Imaging-Z-Stacks. Wir sehen nicht, dass sich Dpp-GFP puncta innerhalb der Fokusebene in Zeitreihen bewegt, wenn wir in einer Fokusebene erworben werden. Wir sehen auch keine Bewegung von Dpp-GFP puncta, wenn wir in einem Z-Stack abgebildet sind. Wir schlussfolgern, dass die Dpp-GFP-Punktias, die mit dieser Methode beobachtet werden, Freisetzungsereignisse sind und nicht die Intrazellulärbewegung von Vesikeln. Diese Methode der Live-Imaging von Dpp-GFP könnte möglicherweise verwendet werden, um andere vermeintliche Modifikatoren der Dpp-Freisetzung auf ihre Auswirkungen auf die Dpp-Dynamik zu testen, oder könnte geändert werden, um die Dynamik anderer Liganden zu betrachten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Die transformierende Überfamilie des Wachstumsfaktor-Betas (TGF-)ist für die frühe embryonale Musterung und Entwicklung von adulten Strukturen in mehrzelligen Organismen unerlässlich. Die TGF--Überfamilie umfasst TGF-, Knochenmorphogenetisches Protein (BMPs), Activine, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren und Nodals. Es ist seit langem bekannt, dass die Menge an Liganden, die Zellen ausgesetzt sind, für seine Wirkung wichtig ist. Es wurde angenommen, dass weiträumige Konzentrationsgradienten embryonale Muster aufstellen. In jüngster Zeit wurde jedoch deutlich, dass der Zeitpunkt der Exposition gegenüber diesen Liganden auch für ihre nachgelagerten Transkriptionsfolgen wichtig ist. Ein TGF--A-Superfamilienligand kann keine Entwicklungsfolge haben, bis es aus der Zelle, in der es hergestellt wurde, freigesetzt wird. Bis vor kurzem war es schwierig zu bestimmen, wann diese Liganden aus Zellen freigesetzt wurden. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila BMP namens Decapentaplegic (Dpp) aus den Zellen des Flügelprimordiums oder der Flügelscheibe misst. Diese Methode kann für andere Systeme oder Signalligaden geändert werden.

Abbildung 2 zeigt repräsentative Live-Imaging-Ergebnisse dieses Protokolls. Wenn das Protokoll erfolgreich ist, kann Dpp-GFP als Streifen in der Mitte der Flügelscheibe mit Kernen gesehen werden, die als nicht fluoreszierende Kreise innerhalb des Dpp-GFP-Bereichs sichtbar sind (Abbildung 2). Die Dpp-GFP-Freisetzung ist als fluoreszierende Punkta sichtbar, die erscheinen und verschwinden. Wir haben beobachtet, wie die Fluoreszenz von Dpp-GFP in den Zellkörpern...

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Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Der Zeitpunkt der Exposition gegenüber Liganden kann sich auf ihre Entwicklungsfolgen auswirken. Hier zeigen wir, wie man die Freisetzung eines Drosophila-Knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) namens Dpp aus Zellen der Flügelscheibe abbilden kann.

Imaging Dpp Release von einer Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP beeinflussen das Zellschicksal, indem sie Rezeptoren bindet und ein Signal intrazellulär sendet, um die Transkription zu beeinflussen. Wenn DPP produziert, aber nicht veröffentlicht wird, hat es keinen Zugriff auf Rezeptoren und kann daher seine Rollen nicht ausführen. Diese Technik ermöglicht es, die DPP-Freisetzung zu visualisieren und ermöglicht es den Forschern zu untersuchen, welche genetischen und ökologischen Faktoren die DPP-Freisetzungsdynamik verändern.Der BMP-Signalweg wird von Fliegen zum Menschen konserviert, so dass wir erwarten, dass der Mechanismus, der die DPP-Freisetzung vorschreibt, auch für die menschliche Entwicklung und Regeneration relevant sein wird. Beginnen Sie mit der Überquerung von 30 bis 40 jungfräulichen weiblichen DPP GAL4-Fliegen mit 10 bis 15 männlichen UAS-DPP-GFP-Fliegen. Fördern Sie die Eiablage, indem Sie eine kleine Menge Hefepaste zu einer frischen Durchstechflasche mit Lebensmitteln hinzufügen.Um die Eier zu sammeln, kippen Sie die gekreuzten Fliegen in die Durchstechflasche und lassen Sie sie für drei bis vier Stunden liegen, bevor Sie sie entfernen. Halten Sie die Eiersammelfläschchen bei 25 Grad Celsius für ca. 144 Stunden, bis die Larven im dritten Instar-Stadium sind. Wählen Sie dann die entsprechenden Larven für die Zerlegung aus.Wählen Sie zunächst Larven, die nicht TB sind, die normale Länge statt kurz und fett sein wird. Um das DPP-GFP zu wählen, das Larven exzessiiert, sehen Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop. Alle Nicht-TB-Larven haben eine gewisse Fluoreszenz, aber das GFP ist auf die Flügelscheiben beschränkt und ist weniger hell auf den DPP-GFP-Larven.Bereiten Sie modifizierte HL3-Medien nach Manuskriptanweisungen vor, die die Flügelscheiben für die Bildgebung am Leben erhalten. Stellen Sie den pH-Wert mit HEPES auf 7,1 ein und filtern Sie ihn dann durch einen 0,22-Mikrometer-Filter. Legen Sie zwei Stücke farbloser doppelseitiger Bandbreite weise über ein Mikroskopschlitten und lassen Sie einen Abstand von etwa fünf Millimetern zwischen sich und stellen Sie sicher, dass die Enden des Bandes mit den Rändern des Dias gespült liegen.Verwenden Sie eine flache Kante, um das Band fest auf die Folie zu drücken. Fügen Sie 25 Mikroliter des modifizierten HL3-Mediums zwischen die beiden Bandstücke. Wenn die Flügelscheibe in den Medien montiert ist, verhindern die Bandstücke, dass sie durch den Deckelbeschlag zerquetscht wird.Um die Larve zu sezieren, legen Sie sie in das modifizierte HL3-Medium und zerreißen Sie sie vorsichtig mit zwei Zangenpaaren. Entsorgen Sie die hintere Hälfte, dann greifen Sie die Mitte der vorderen Hälfte mit einem Paar Zange und verwenden Sie das andere Paar, um die Mundhaken zurück in die Larve zu drücken, bis sie vollständig invertiert ist. Achten Sie auf die scharfen Biegungen in den beiden dunkleren primären Zweigen der Luftröhre, die beide Seiten der Larve verlaufen.Die Flügelscheiben liegen direkt darunter. Entfernen Sie die Scheiben vorsichtig und legen Sie sie in das HL3-Medium auf dem vorbereiteten Dia, um sicherzustellen, dass noch keine Luftröhre an den Scheiben befestigt ist. Ordnen Sie die Flügelscheiben so an, dass die Peripodial-Seite des Flügelbeutels nach oben zeigt und die Scheibe flach liegt.Bedecken Sie den Flügel mit einem Deckelund Dichtung mit Nagellack. Sobald die Politur trocken ist, gehen Sie sofort mit der Bildgebung fort. Stellen Sie die montierte Flügelscheibe mit einem konfokalen Laserscanmikroskop mit einem 40-fachen Ölobjektiv und einem 488-Nanometer-Laser auf.Sammeln Sie Bilder mit einer Geschwindigkeit von zwei Hertz für zwei Minuten. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie die Laserleistung gerade stark genug, um ein klares Bild der DPP-releasing Zellen zu erhalten, um über Bleichen zu vermeiden. Sammeln Sie die Bilder als Zeitreihe und exportieren Sie sie als AVI-Dateien, um ein Video der DPP-Version zu erhalten.Wenn das Protokoll erfolgreich ist, erscheint DPP-GFP als Streifen in der Mitte der Flügelscheibe mit Kernen, die als nicht fluoreszierende Kreise sichtbar sind. Die DPP-GFP-Freisetzung ist als fluoreszierende Punkta sichtbar, die sowohl in als auch weit weg von den Zellkörpern erscheinen und verschwinden. Die deutlichen Puncta sind wahrscheinlich in Zytonen oder bei Cytoneme-Synapsen.Die Flügelscheiben sind so montiert, dass die Bildgebung von der Peripodial-Seite aus erfolgt. Wenn die Flügelscheibe von der Rückseite abgebildet wird, erscheint die DPP-GFP-Fluoreszenz aus dem Fokus und die Auflösung wird schlecht sein. Wenn GFP nicht mit DPP verschmolzen ist, werden keine Punktzeichen außerhalb der Zellkörper beobachtet.Diese Kontrolle zeigt, dass sich DPP-GFP anders verhält als GFP allein. Darüber hinaus erscheinen keine fluoreszierenden Puncta, wenn DPP-GFP nicht ausgedrückt wird. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, dass die Flügelscheibe peripodial Seite nach oben montiert wird.Wenn die Flügelscheibe falsch ausgerichtet ist, erscheint DPP-GFP aus dem Fokus. Diese Methode könnte verwendet werden, um die Freisetzung von anderen entwicklungssignalen Liganden wie flügellos oder Igel zu studieren. Wir können alle verschiedenen ökologischen und genetischen Faktoren untersuchen, die die Freisetzung von DPP beeinflussen können.Darüber hinaus können wir diese Methode anpassen, um die BMP-Freisetzung von anderen Zelltypen zu untersuchen.

Research

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Developmental Biology

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Forschung

Entwicklungsbiologie

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