Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

ברצוני להודות לד ר סאראלה פראדהן על עבודה על גרסה מוקדמת יותר של פרוטוקול זה. אנחנו רוצים להודות NSF-IOS 1354282 למימון בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול. היינו רוצים להודות NIH-נדבך RO1DE025311 למימון המעבדה שלנו כרגע.

1. איסוף ביצים כדי ליצור הזחלים לחיתוך
<ol><li>לחצות 30-40 נקבה בתולה Dpp-GAL4/TM6 Tb הו זבובים ל 10-15 זכר Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. הערה: כל גנוסוגים המכילים Dpp-GAL4 ו UAS-Dpp-GFP יכול לשמש כל עוד אזנים יש סמני זחל המאפשר מבחר של צאצאי המתאים במהלך הזחל.</li>
	<li>כדי לאסוף ביצים, להפוך את הזבובים חצה לתוך בקבוקו?...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs כגון Dpp להפוך את ההשפעה המשמעותית שלהם כאשר הם לאגד מורכבות של קולטנים מאוגדים קרום כדי לגרום מפל של איתות תאיים בתאים השכנה או מרחוק כנראה. מעבדתו של ד ר תומס קורנברג הראו כי תאים המייצרים את אות dpp בתאי מגע המקבלים את האות באמצעות אקטין מבוסס filapodia דק מבנים כמו המכונה cytonemes15...

עצם מורורגנטית חלבונים (BMPs) הם חיוניים עבור embryogenesis מוקדם והסדר של מבנים מבוגרים. BMPs מיוצרים ומופרש כדי להשפיע על תמלול של גנים היעד הדרושים הגידול התא בידול בתאים מגיבים. עריפת ראש (Dpp) היא מטוס הומוסוזוזה של BMP4 שחשוב לפיתוח מבנים עובריים ומבוגרים כמו כנף1,2,3,4. כמה קבוצות התמקדו בתפקיד של Dpp כנפיים לעוף מבוגרים בגלל 1) כנפיים מורכב משני גיליונות epithelia שקוף עם דפוס עקביות עקבית שניתן להעריך בקלות; 2) הדיסקים הכנף הם גם שטוחים באופן סביר, יכול להיות מתורבת מחוץ לזחל, והם פשוטים התמונה והבדלים לכמת בתבנית; ו 3) הפיתוח דפוס הכנף רגיש Dpp כגון רטבאליות קטן בשביל יהיה להשפיע הכנף והוא.
Dpp מופק בתאים הממוקמים בגבול הקדמי/אחורי של דיסק כנף5,6,7,8. Dpp נקשר לקומפלקס מסוג 1 ו-2 קולטני סרין/טראונין קינאז9,10. עם כריכת Dpp, הסוג 2 קולטן זרחתיים את סוג 1 הקולטן אשר לאחר מכן זרחני אמהות נגד Dpp (משוגע), Smad 1/5/8 הומויומן. מגייסים מגויסים שכונתיות נוספת (מדיאה), אשר מאפשר לו להיכנס לגרעין שבו הוא מווסת את הגנים היעד, המוביל לתופעות למטה כגוןהתפשטות אובידול 4,11.
לאחרונה, מעבדת בייטס הראתה כי שחרורו הבלתי ראוי של dpp בתוך הדיסק הכנף יכול להוביל לירידה בזירחון מטורף, הפחתה בביטוי הגנים היעד, ופגמים כנף12,13. מספר ערוצי יונים משפיעים על התפתחות אגף דרוזוהילה ומבנים משויכים14,15. ערוצי יונים אלה יכולים גם להיות מעורבים במהדורת Dpp. בקביעת המנגנון של שחרור מורפוגן, חשוב כי יש שיטה להמחיש את האירועים שחרור.
ד"ר אאורליו טלמאן וסטיבן כהן יצרו חלבון היתוך Dpp-GFP אשר מסוגל להציל אובדן של Dpp, כלומר הוא פעיל ביולוגית ושוחרר באופן ביולוגית רלוונטי16. כאן, אנו מתארים כיצד אנו מדמיינים Dpp לשחרר אירועים באמצעות זה Dpp-GFP. חלבון זה היתוך שימושי במיוחד כי GFP הוא pH רגיש כך כאשר הוא בתוך שלפוחיות חומציים, הזריחה היא17. לכן, כאשר חלבון מתויג עם GFP הוא שוחרר שלפוחית לתוך הסביבה מגלותי יותר נייטרלי, עוצמת הזריחה GFP מגדילה17. ניצלנו את הרגישות של ה-pH של GFP כדי לקבוע אם Dpp-GFP נמצא בתוך שלפוחיות חומציים. אנו התמונה דיסקים כנף המבטא Dpp-GFP לפני ואחרי תוספת של אמוניום כלוריד, אשר מנטרל תאים תאיים ושלפוחיות18. מצאנו עלייה משמעותית בקרינה הפלואורסצנטית לאחר תוספת של אמוניום כלוריד, הרומז כי Dpp-GFP מצוי לפני התוספת של אמוניום כלוריד18. אנו מסיקים כי Dpp-GFP התאיים שוכן בתאי קרום חומצי מאוגד, כגון ושלפוחיות, והוא משוקם בתוספת של אמוניום כלוריד לנטרל את ה-pH של תאי תאיים18. זה עושה הדמיה חיה של Dpp-GFP טכניקה שימושית כדי להמחיש את הדינמיקה של Dpp בדיסק כנף Drosophila ילה כפי שהוא שוחרר מתאי חומצי לתוך הסביבה מגלומת.
כאן, אנו מתארים את השיטה אנו משתמשים כדי להמחיש את Dpp לשחרר אירועים באמצעות Dpp-GFP. Dpp-GFP ניתן להתבטא בתבנית מקורית שלה בתוך מערכת הדיסקים של Drosophila ילה באמצעות המערכת UAS-GAL419. זוהי השיטה ששימש כדי לקבוע כי ערוצי Irk השפעה שחרור Dpp18. הצלחנו לאמת את השיטה. ע י הדמיה חיה בערימות אנחנו לא רואים Dpp-GFP לנוע בתוך מישור המיקוד בסדרת הזמן אם רכשנו במישור אחד של מיקוד. אנחנו גם לא רואים תנועה של Dpp-GFP דקדטתא אם אנו מתמונה במחסנית z. אנו מסיקים כי ה-Dpp-GFP שנראה באמצעות שיטה זו הם שחרור אירועים ולא תנועה של שלפוחיות intracellularly. שיטה זו של לחיות הדמיה של Dpp-GFP יכול לשמש כדי לבדוק מודיטים אחרים של המהדורה Dpp עבור השפעתם על הדינמיקה Dpp או יכול להיות שונה כדי להסתכל על הדינמיקה של ליגונים אחרים

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

שינוי מקדם הצמיחה-בטא (TGF-β) סופר משפחה חיונית עבור המבנה העובריים המוקדמים ופיתוח של מבנים מבוגרים באורגניזמים רב-תאיים. TGF-β סופר משפחה כולל TGF-β, עצם חלבון מורורגנטי (BMPs), הפעלות, צמיחה ובידול, ו Nodals. זה כבר מזמן ידוע כי כמות ליגו חשוף לתאים חשוב השפעותיו. זה היה חשוב כי מעברי הריכוז לטווח ארוך להגדיר דפוס עובריים. עם זאת, לאחרונה התברר כי עיתוי החשיפה לליפות אלה חשוב גם עבור ההשלכות שלהם במורד הזרם. Tgf-β סופרמשפחה ליגנד לא יכול להיות תוצאה התפתחותית עד שהוא שוחרר מתא שבו הוא הופק. עד לאחרונה, היה קשה לקבוע מתי הליטרים האלה שוחררו מתאים. כאן אנו מראים כיצד למדוד את שחרורו של Drosophila ילה BMP הנקרא עריפת ראש (dpp) מן התאים של הראש הזרוע הפרידיום או הכנף. ניתן לשנות שיטה זו עבור מערכות אחרות או לאותת ליגנדס.

איור 2 מראה את תוצאות ההדמיה החיה הייצוגית של פרוטוקול זה. כאשר הפרוטוקול הוא מוצלח, Dpp-GFP ניתן לראות פס במורד המרכז של דיסק כנף עם גרעינים גלויים כמו עיגולים שאינם פלורסנט בתוך אזור Dpp-GFP (איור 2). השחרור dpp-GFP גלוי כמו פלורסנט המופיעים ונעלמים. הבחנו בקרינה Dpp-GFP ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP להשפיע על גורל התא על ידי קולטני קשירה ושליחת אות תאיים כדי להשפיע על שעתוק. אם DPP מיוצר אך לא שוחרר, אין לו גישה לקולטנים ולכן אינו יכול לבצע את תפקידיו. טכניקה זו מאפשרת לדמיין שחרור DPP המאפשר לחוקרים לבחון אילו גורמים גנטיים וסביבתיים משנים את דינמיקת שחרור DPP.מסלול האיתות של BMP שמור מזבובים לבני אדם ולכן אנו מצפים כי המנגנון המכתיב שחרור DPP יהיה רלוונטי גם להתפתחות אנושית והתחדשות. התחל על ידי חציית 30 עד 40 בתולה נקבה DPP GAL4 זבובים עם 10 עד 15 זבובים זכר UAS DPP-GFP. לעודד הטלת ביצים על ידי הוספת כמות קטנה של משחת שמרים לבקבוקון טרי של מזון.כדי לאסוף את הביצים, להפוך את הזבובים המוצלבים לתוך הבקבוקון ולאפשר להם להטיל במשך שלוש עד ארבע שעות לפני הסרתם. שמור את בקבוקוני איסוף הביצים ב 25 מעלות צלזיוס במשך כ 144 שעות עד הזחלים נמצאים בשלב instar השלישי. לאחר מכן בחרו את הזחלים המתאימים לפירוק.ראשית, לבחור זחלים שאינם שחפת אשר יהיה אורך נורמלי ולא קצר ושומן. כדי לבחור את ה- DPP-GFP המבטא זחלים, הצג אותם תחת מיקרוסקופ סטריאו-פלואורסצנטי. כל הזחלים שאינם TB יהיו קצת פלואורסצנטיות, אבל GFP מוגבל דיסקי הכנף והוא פחות בהיר על הזחלים DPP-GFP.הכן מדיה HL3 שונה על פי הוראות כתב יד אשר ישמור על דיסקי הכנף בחיים להדמיה. התאם את ה- pH ל- 7.1 באמצעות HEPES ולאחר מכן סנן אותו באמצעות מסנן מיקרומטר 0.22. מקם שתי חתיכות של רוחב סרט דו-צדדי חסר צבע לאורך שקופית מיקרוסקופ והשאיר רווח של כ-5 מילימטרים ביניהן וודא שקצוות הקלטת סמוקים עם קצות השקופית.השתמש בקצה שטוח כדי ללחוץ היטב על הקלטת לשקופית. הוסף 25 מיקרוליטרים של מדיה HL3 שונה בין שתי חתיכות של קלטת. כאשר דיסק הכנף מותקן במדיה, פיסות הקלטת ימנעו ממנו להימחץ על ידי העטיפה.כדי לנתח את הזחל, מקם אותו במדיה HL3 שונה בעדינות לקרוע אותו לשניים באמצעות שני זוגות של מדפים. השלך את החצי האחורי, ואז לתפוס את אמצע המחצית הראשונה עם זוג אחד של ממטרות ולהשתמש בזוג השני כדי לדחוף את ווים הפה בחזרה לתוך הזחל עד שהוא הפוך לחלוטין. חפש את העיקולים החדים בשני הענפים הראשיים בצבע כהה יותר של קנה הנשימה כי לרוץ במורד שני צידי הזחל.דיסקי הכנף נמצאים ממש מתחת. הסר בעדינות את הדיסקים והכניס אותם למדיית HL3 בשקופית המוכנה כדי לוודא שאף פיסות קנה הנשימה עדיין מחוברות לדיסקים. מסדרים את דיסקי הכנף כך שהצד הקדמוני של כיס הכנף פונה כלפי מעלה כשהדיסק מונח שטוח.מכסים את הכנף עם כיסוי וחותמים עם לק. לאחר הלק יבש, מיד להמשיך עם הדמיה. תמונה דיסק הכנף רכוב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל עם מטרה שמן 40X לייזר 488 ננומטר.לאסוף תמונות במהירות של שני הרץ במשך שתי דקות. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הגדר את כוח הלייזר חזק מספיק כדי לקבל תמונה ברורה של התאים משחררי DPP כדי למנוע הלבנת יתר. לאסוף את התמונות כסדרת זמן ולייצא אותם כקבצי AVI כדי לקבל וידאו של שחרור DPP.כאשר הפרוטוקול מצליח, DPP-GFP מופיע כפס במרכז דיסק הכנף עם גרעינים הנראים כעיגולים שאינם פלואורסצנטיים. שחרור DPP-GFP גלוי כנקב פלואורסצנטי המופיעים ונעלמים הן פנימה והן הרחק מגופי התא. הפנצטה המובהק עשויה להיות בצייטונים או בסינאפסות ציטונס.דיסקי הכנף מותקנים כך שההדמיה נעשית מהצד הקרדיאלי. אם דיסק הכנף הוא בתמונה מהצד ההפוך, פלואורסצנטיות DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס והרזולוציה תהיה ירודה. כאשר GFP אינו מותך DPP, אין puncta מחוץ לגופי התא נצפו.פקד זה מדגים כי DPP-GFP מתנהג בצורה שונה מאשר GFP בלבד. יתר על כן, אין פנצטה פלואורסצנטי להופיע כאשר DPP-GFP אינו בא לידי ביטוי. במהלך הליך זה, חשוב כי דיסק הכנף נטען צד peripodial למעלה.אם דיסק הכנף אינו מונחה כראוי, DPP-GFP יופיע מחוץ לפוקוס. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד את שחרורו של ליגנדים איתות התפתחותי אחרים כמו wingless או קיפוד. אנו יכולים לחקור את כל הגורמים הסביבתיים והגנטיים השונים שעשויים להשפיע על שחרור DPP.בנוסף, אנו יכולים להתאים שיטה זו כדי ללמוד שחרור BMP מסוגי תאים אחרים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...