Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
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Ringraziamo la dott.ssa Sarala Pradhan per aver lavorato su una versione precedente di questo protocollo. Vorremmo ringraziare NSF-IOS 1354282 per il finanziamento mentre abbiamo sviluppato questo protocollo. Ringraziamo NIH-NIDCR RO1DE025311 per aver finanziato il nostro laboratorio.

1. Raccolta di uova per generare larve per la dissezione
<ol><li>Attraversare 30-40 donne vergini Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu vola a 10-15 maschi Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu. NOT:</</c0> Qualsiasi due genotipi contenenti Dpp-GAL4 e UAS-Dpp-GFP possono essere utilizzati a condizione che gli bilanciatori abbiano marcatori larvali che consentono la selezione della progenie appropriata durante la fase larvale.</li>
	<li>Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate in una fiala fresca di cibo ...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMP come Dpp fanno il loro impatto significativo quando legano un complesso di recettori legati alla membrana per causare una cascata di segnalazione intracellulare nelle cellule vicine o apparentemente lontane. Il laboratorio del Dr. Thomas Kornberg ha dimostrato che le cellule che producono le cellule di contatto del segnale Dpp che ricevono il segnale utilizzando strutture sottili filapodia basate su actin chiamati citonemi15,24,25...

Le proteine morfogenetiche ossee (BMP) sono essenziali per l'embriogenesi precoce e la modellazione di strutture adulte. I BMP sono prodotti e secreti per influenzare la trascrizione dei geni bersaglio necessari per la crescita e la differenziazione cellulare nelle cellule che rispondono. Decapentaplegic (Dpp) è un omologo di Drosophila di BMP4 che è importante per lo sviluppo di strutture embrionali e adulte come l'ala1,2,3,4. Diversi gruppi si sono concentrati sul ruolo del Dpp nel patterning adult ole di mosca perché 1) le ali sono costituite da due fogli di epitelia trasparenti con un modello di venazione coerente che può essere facilmente valutato; 2) i dischi ali sono anche ragionevolmente piatti, possono essere coltivati al di fuori della larva e sono semplici da immaginare e quantificare le differenze di modello; e 3) lo sviluppo del modello alare è sensibile al Dpp in modo tale che piccole perturbazioni nel percorso avranno un impatto sul modello di venazione dell'ala.
Dpp è prodotto in celle situate nel contorno anteriore/posteriore del disco alare5,6,7,8. Dpp si lega a un complesso di tipo 1 e tipo 2 serine / preonina recettori della chinasi9,10. Al momento dell'attacco Dpp, il recettore di tipo 2 fa fosforolaili del recettore di tipo 1 che poi fa fosfolato Madri contro Dpp (Mad), un omologa Smad 1/5/8. Phosphorylated SMAD recluta un'ulteriore co-Smad (Medea), che le consente di entrare nel nucleo dove regola i geni bersaglio, portando a effetti a valle come la proliferazione o la differenziazione4,11.
Recentemente, il Bates Lab ha dimostrato che il rilascio improprio di Dpp all'interno del disco alare può portare a una diminuzione del fosfororylazione pazza, alla riduzione dell'espressione genica bersaglio e ai difetti di patterning12,13. Diversi canali ionici influenzano lo sviluppo dell'ala della Drosophila e delle strutture associate14,15. Questi canali ionici potrebbero anche essere coinvolti nel rilascio di Dpp. Nel determinare il meccanismo di rilascio morfogeno, è importante che sia disponibile un metodo per visualizzare gli eventi di rilascio.
I dottori Aurelio Teleman e Stephen Cohen hanno creato una proteina di fusione Dpp-GFP che è in grado di salvare la perdita di Dpp, il che significa che è biologicamente attiva e viene rilasciata in modo biologicamente rilevante16. Qui, descriviamo come visualizziamo gli eventi di rilascio Dpp utilizzando questo Dpp-GFP. Questa proteina di fusione è particolarmente utile perché la GFP è sensibile al pH in modo tale che quando è in vescicoli acidi, la fluorescenza viene spenta17. Pertanto, quando una proteina etichettata con GFP viene rilasciata da una vescica nell'ambiente extracellulare più neutro, l'intensità della fluorescenza GFP aumentadi 17. Abbiamo sfruttato la sensibilità al pH di GFP per determinare se Dpp-GFP risiede in vesciche acide. Abbiamo immaginato dischi alari che esprimono Dpp-GFP prima e dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, che neutralizza i compartimenti intracellulari vescicoli18. Abbiamo trovato un aumento significativo della fluorescenza della puncora dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio, suggerendo che il Dpp-GFP intracellulare viene spento prima dell'aggiunta di cloruro di ammonio18. Concludiamo che il Dpp-GFP intracellulare risiede in compartimenti acidi legati alla membrana, come le vescicle, ed è invaloreso dopo l'aggiunta di cloruro di ammonio per neutralizzare il pH dei compartimenti intracellulari18. Questo rende l'imaging live di Dpp-GFP una tecnica utile per visualizzare la dinamica di Dpp nel disco alare della Drosophila quando viene rilasciato dai compartimenti acidi nell'ambiente extracellulare.
Qui descriviamo il metodo che usiamo per visualizzare gli eventi di rilascio Dpp utilizzando Dpp-GFP. Dpp-GFP può essere espresso nel suo modello nativo nei dischi alari della Drosophila utilizzando il sistema UAS-GAL419. Questo è il metodo utilizzato per determinare che i canali Irk influiscono sulla versione18di Dpp. Abbiamo convalidato il metodo con z-stack di imaging live. Non vediamo Puncta Dpp-GFP muoversi all'interno del piano di messa a fuoco in serie temporali se abbiamo acquisito in un piano di messa a fuoco. Inoltre non vediamo il movimento di Puncta Dpp-GFP se abbiamo immagine in uno z-stack. Concludiamo che la puncta Dpp-GFP vista con questo metodo sono eventi di rilascio piuttosto che movimento di vescicoli intracellulare. Questo metodo di imaging live di Dpp-GFP potrebbe essere potenzialmente utilizzato per testare altri modificatori putatti del rilascio di Dpp per il loro impatto sulla dinamica Dpp o potrebbe essere modificato per esaminare le dinamiche di altri ligandi

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

La superfamiglia trasformante Growth Factor-beta (TGF-z) è essenziale per il patterning embrionale precoce e lo sviluppo di strutture adulte in organismi multicellulari. La superfamiglia TGF-z comprende la proteina morfogenetica ossea (BMP), gli Activins, i fattori di crescita e differenziazione e i Nodali. È noto da tempo che la quantità di ligando esposto alle cellule è importante per i suoi effetti. Si pensava che i gradienti di concentrazione a lungo raggio fossero un modello embrionale. Tuttavia, recentemente è diventato chiaro che la tempistica dell'esposizione a questi ligandi è importante anche per le loro conseguenze trascrizionali a valle. Un ligando di superfamiglia TGF -z non può avere una conseguenza di sviluppo fino a quando non viene rilasciato dalla cella in cui è stato prodotto. Fino a poco tempo fa, era difficile determinare quando questi ligando sono stati rilasciati dalle cellule. Qui mostriamo come misurare il rilascio di un BMP Drosophila chiamato Decapentaplegic (Dpp) dalle celle del primordium o disco alare. Questo metodo potrebbe essere modificato per altri sistemi o legature di segnalazione.

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi dell'imaging in tempo reale di questo protocollo. Quando il protocollo ha successo, Dpp-GFP può essere visto come una striscia al centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti all'interno della regione Dpp-GFP (Figura 2). Rilascio Dpp-GFP è visibile come puncta fluorescente che appaiono e scompaiono. Abbiamo osservato la fluorescenza Dpp-GFP che appare e scompare nei corpi cellulari e lon...

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Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

La tempistica dell'esposizione ai ligandi può influire sulle loro conseguenze di sviluppo. Qui mostriamo come visualizzare l'immagine di una proteina morfogenetica ossea della Drosophila (BMP) chiamata Dpp dalle cellule del disco alare.

Imaging Dpp Release da un disco ala Drosophila

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Il DPP influenza il destino cellulare legando i recettori e inviando un segnale intracellulare per influenzare la trascrizione. Se DPP viene prodotto ma non rilasciato, non ha accesso ai recettori e quindi non può svolgere i suoi ruoli. Questa tecnica consente di visualizzare il rilascio di DPP consentendo ai ricercatori di esaminare quali fattori genetici e ambientali cambiano la dinamica di rilascio del DPP.La via di segnalazione BMP è conservata dalle mosche agli esseri umani, quindi ci aspettiamo che il meccanismo che impone il rilascio di DPP sia rilevante anche per lo sviluppo e la rigenerazione umana. Inizia incrociando da 30 a 40 mosche DPP GAL4 femminili vergini con 10-15 mosche UAS DPP-GFP maschili. Incoraggiare la deposizione delle uova aggiungendo una piccola quantità di pasta di lievito a una fiala fresca di cibo.Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate nella fiala e consentire loro di deporre per tre o quattro ore prima di rimuoverle. Mantenere le fiale di raccolta delle uova a 25 gradi Celsius per circa 144 ore fino a quando le larve non sono al terzo stadio instar. Quindi selezionare le larve appropriate per la dissezione.In primo luogo, scegli larve che non sono TB che saranno di lunghezza normale piuttosto che corte e grasse. Per selezionare le larve che esprimono il DPP-GFP, visualizzarle al microscopio stereo a fluorescenza. Tutte le larve non TB avranno una certa fluorescenza, ma la GFP è limitata ai dischi delle ali ed è meno luminosa sulle larve DPP-GFP.Preparare supporti HL3 modificati secondo le indicazioni manoscritte che manterranno in vita i dischi delle ali per l'imaging. Regolare il pH a 7.1 con HEPES, quindi filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Posizionare due pezzi di larghezza del nastro a doppia fronte incolore in modo saggio su uno scivolo del microscopio lasciando uno spazio di circa cinque millimetri tra di loro e assicurandosi che le estremità del nastro giacciono arrossate con i bordi della diapositiva.Utilizzare un bordo piatto per premere saldamente il nastro nella diapositiva. Aggiungere 25 microlitri del supporto HL3 modificato tra i due pezzi di nastro. Quando il disco dell'ala è montato nel supporto, i pezzi di nastro impediranno che venga schiacciato dal coperchio.Per sezionare la larva, posizionarla nel supporto HL3 modificato e strapparla delicatamente a metà usando due paia di forcep. Scartare la metà posteriore, quindi afferrare il centro della metà anteriore con un paio di forcep e utilizzare l'altra coppia per spingere i ganci della bocca nella larva fino a quando non è completamente invertita. Cerca le curve affilate nei due rami primari di colore più scuro della trachea che corrono su entrambi i lati della larva.I dischi delle ali giacciono direttamente sotto. Rimuovere delicatamente i dischi e metterli nel supporto HL3 sulla diapositiva preparata assicurandosi che nessun pezzo di trachea sia ancora attaccato ai dischi. Disporre i dischi delle ali in modo che il lato peripodiale della borsa dell'ala sia rivolto verso l'alto con il disco piatto.Coprire l'ala con un coverslip e sigillare con smalto per unghie. Una volta che lo smalto è asciutto, procedere immediatamente con l'imaging. Immagine del disco alare montato utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di olio 40X e un laser da 488 nanometri.Raccogli immagini a una velocità di due hertz per due minuti. Per ottenere i migliori risultati, imposta la potenza del laser abbastanza forte da ottenere un'immagine chiara delle cellule che rilasciano DPP per evitare lo sbiancamento. Raccogli le immagini come serie temporali ed esportale come file AVI per ottenere un video della versione DPP.Quando il protocollo ha successo, il DPP-GFP appare come una striscia verso il centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti. Il rilascio di DPP-GFP è visibile come puncta fluorescente che appare e scompare sia all'interno che lontano dai corpi cellulari. I puncta distinti sono probabili nei citotoni o nelle sinapsi dei citotoni.I dischi delle ali sono montati in modo che l'imaging sia fatto dal lato peripodiale. Se il disco alare viene visualizzato dal retro, la fluorescenza DPP-GFP apparirà fuori fuoco e la risoluzione sarà scarsa. Quando la GFP non viene fusa al DPP, non si osserva no puncta al di fuori dei corpi cellulari.Questo controllo dimostra che DPP-GFP si comporta in modo diverso rispetto alla sola GFP. Inoltre, non compaiono puncta fluorescenti quando il DPP-GFP non è espresso. Durante questa procedura, è importante che il disco dell'ala sia montato lateralmente peripodiale verso l'alto.Se il disco dell'ala è orientato in modo improprio, DPP-GFP apparirà fuori fuoco. Questo metodo potrebbe essere usato per studiare il rilascio di altri ligandi di segnalazione dello sviluppo come ala o riccio. Possiamo esplorare tutti i diversi fattori ambientali e genetici che possono influenzare il rilascio di DPP.Inoltre, possiamo adattare questo metodo per studiare il rilascio di BMP da altri tipi di cellule.

Research

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