Name: imaging dpp release from a drosophila wing disc
Uploaded: 2019-10-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. Sarala Pradhan for å ha jobbet med en tidligere versjon av denne protokollen. Vi takker NSF-IOS 1354282 for finansiering mens vi utviklet denne protokollen. Vi vil gjerne takke NIH-NIDCR RO1DE025311 for finansiering av laboratoriet vårt for øyeblikket.

1. samle egg for å generere larver for disseksjon
<ol><li>Cross 30-40 Virgin kvinnelig DPP-GAL4/TM6 TB Hu flyr til 10-15 mannlige SP/CyO-GFP; UAS-DPP-GFP/TM6 TB Hu. Merk: Alle to genotyper inneholder DPP-GAL4 og UAS-DPP-GFP kanskje bli brukt idet lang idet det fordelinger ha larvestadiet merker tillater for utvalg av det passende avkom under larvestadiet scene.</li>
	<li>For å samle egg, Vend de kryssende fluene inn i en fersk hetteglass med mat og la dem ligge i 3 – 4 timer før de fjernes fra ...

<ol>
	<li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decapentaplegic+acts+as+a+morphogen+to+organize+dorsal-ventral+pattern+in+the+Drosophila+embryo.">Decapentaplegic acts as a morphogen to organize dorsal-ventral pattern in the Drosophila embryo.</a> Cell. 71 (3), 451-461 (1992).</li><li>Ferguson, E. L., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+enhancement+and+repression+of+the+activity+of+the+TGF-beta+family+member,+decapentaplegic,+is+necessary+for+dorsal-ventral+pattern+formation+in+the+Drosophila+embryo.">Localized enhancement and repression of the activity of the TGF-beta family member, decapentaplegic, is necessary for dorsal-ventral pattern formation in the Drosophila embryo.</a> Development. 114 (3), 583-597 (1992).</li><li>Wharton, K. A., Ray, R. P., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activity+gradient+of+decapentaplegic+is+necessary+for+the+specification+of+dorsal+pattern+elements+in+the+Drosophila+embryo.">An activity gradient of decapentaplegic is necessary for the specification of dorsal pattern elements in the Drosophila embryo.</a> Development. 117 (2), 807-822 (1993).</li><li>Raftery, L. A., Twombly, V., Wharton, K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+to+identify+elements+of+the+decapentaplegic+signaling+pathway+in+Drosophila.">Genetic screens to identify elements of the decapentaplegic signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 139 (1), 241-254 (1995).</li><li>Raftery, L. A., Sanicola, M., Blackman, R. K., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+decapentaplegic+and+engrailed+expression+in+Drosophila+imaginal+disks:+do+these+genes+mark+the+anterior-posterior+compartment+boundary.">The relationship of decapentaplegic and engrailed expression in Drosophila imaginal disks: do these genes mark the anterior-posterior compartment boundary.</a> Development. 113 (1), 27-33 (1991).</li><li>Blackman, R. K., Sanicola, M., Raftery, L. A., Gillevet, T., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extensive+3'+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic,+a+member+of+the+TGF-beta+family+in+Drosophila.">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-beta family in Drosophila.</a> Development. 111 (3), 657-666 (1991).</li><li>de Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+decapentaplegic+and+thick+veins+during+the+differentiation+of+the+veins+in+the+Drosophila+wing.">Expression and function of decapentaplegic and thick veins during the differentiation of the veins in the Drosophila wing.</a> Development. 124 (5), 1007-1018 (1997).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Letsou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dpp+signaling+is+mediated+by+the+punt+gene+product:+a+dual+ligand-binding+type+II+receptor+of+the+TGF+beta+receptor+family.">Drosophila Dpp signaling is mediated by the punt gene product: a dual ligand-binding type II receptor of the TGF beta receptor family.</a> Cell. 80 (6), 899-908 (1995).</li><li>Nellen, D., Affolter, M., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+serine/threonine+kinases+implicated+in+the+control+of+Drosophila+body+pattern+by+decapentaplegic.">Receptor serine/threonine kinases implicated in the control of Drosophila body pattern by decapentaplegic.</a> Cell. 78 (2), 225-237 (1994).</li><li>Raftery, L. A., Sutherland, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+family+signal+transduction+in+Drosophila+development:+from+Mad+to+Smads.">TGF-beta family signal transduction in Drosophila development: from Mad to Smads.</a> Developmental Biology. 210 (2), 251-268 (1999).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+regulate+Dpp+release+in+the+Drosophila+wing+disc.">Inwardly rectifying potassium channels regulate Dpp release in the Drosophila wing disc.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Dahal, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inwardly+rectifying+K++channel+is+required+for+patterning.">An inwardly rectifying K+ channel is required for patterning.</a> Development. 139 (19), 3653-3664 (2012).</li><li>George, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+Channel+Contributions+to+Wing+Development+in+Drosophila+melanogaster.">Ion Channel Contributions to Wing Development in Drosophila melanogaster.</a> G3. 9 (4), 999-1008 (2019).</li><li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses.">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li><li>Teleman, A. A., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dpp+gradient+formation+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc.">Dpp gradient formation in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Cell. 103 (6), 971-980 (2000).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Dahal, G. R., Pradhan, S. J., Bates, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inwardly+rectifying+potassium+channels+influence+Drosophila+wing+morphogenesis+by+regulating+Dpp+release.">Inwardly rectifying potassium channels influence Drosophila wing morphogenesis by regulating Dpp release.</a> Development. 144 (15), 2771-2783 (2017).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li><li>Hazegh, K. E., Reis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Buoyancy-based+Method+of+Determining+Fat+Levels+in+Drosophila.">A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54744 (2016).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Hsiung, F., Ramirez-Weber, F. A., Iwaki, D. D., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependence+of+Drosophila+wing+imaginal+disc+cytonemes+on+Decapentaplegic.">Dependence of Drosophila wing imaginal disc cytonemes on Decapentaplegic.</a> Nature. 437 (7058), 560-563 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332 (6027), 354-358 (2011).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytonemes+as+specialized+signaling+filopodia.">Cytonemes as specialized signaling filopodia.</a> Development. 141 (4), 729-736 (2014).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>Kornberg, T. B., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communicating+by+touch--neurons+are+not+alone.">Communicating by touch--neurons are not alone.</a> Trends in Cell Biology. 24 (6), 370-376 (2014).</li></ol>

BMPs som DPP gjøre sin betydelige innvirkning når de binder et kompleks av membran bundet reseptorer å forårsake en kaskade av intracellulære signalering i nabolandet eller tilsynelatende fjerne celler. Dr. Thomas Kornberg ' laboratorium har vist det celler det tilvirke det DPP signal kontakt celler det få signalet benytter utgangen basert spinkle filapodia-like strukturer alarmert cytonemes15,24,25. Disse dataene tyder p?...

Bone Morfogenetiske proteiner (BMPs) er avgjørende for tidlig embryogenesis og mønstre av voksen strukturer. BMPs produseres og utskilles for å påvirke transkripsjon av målet gener som trengs for vekst og celle differensiering i å svare på celler. Decapentaplegic (DPP) er en Drosophila HOMOLOGE av BMP4 som er viktig for utvikling av embryonale og voksne strukturer som fløy1,2,3,4. Flere grupper har fokusert på rollen som DPP i mønster voksen flyvinger fordi 1) vingene består av to gjennomsiktige prolifererende ark med en konsistent en mønster som lett kan vurderes; 2) vingen platene er også rimelig flat, kan kultivert utenfor Larven, og er enkle å avbilde og kvantifisere forskjeller i mønster; og 3) vingen mønster utviklingen er følsom for DPP slik at små forstyrrelser i veien vil påvirke vinge en mønster.
DPP produseres i celler som ligger i fremre/bakre grense av vinge platen5,6,7,8. DPP binder seg til et kompleks av type 1 og type 2 Serine/threonin kinase reseptorer9,10. Etter DPP binding, type 2 reseptor fosforylerer type 1 reseptor som deretter fosforylerer mødre mot DPP (Mad), en Smad 1/5/8 homologe. Fosforylert SMAD rekrutterer en ekstra co-Smad (Medea), som gjør det inn til kjernen der det regulerer mål gener, som fører til nedstrøms effekter som spredning eller differensiering4,11.
I den seneste tid har Bates Lab vist at den feilaktige utgivelsen av DPP innenfor vingen platen kan føre til en reduksjon i gal fosforylering, reduksjon i målet genuttrykk, og vinge mønster defekter12,13. Flere ion-kanaler påvirker utviklingen av Drosophila vingen og tilhørende strukturer14,15. Disse ion kanalene kunne likeledes være involvert inne DPP løslate. Ved fastsettelsen av mekanismen for morphogen utgivelse, er det viktig at det er en metode for å visualisere Release hendelser.
DRS. Aurelio Teleman og Stephen Cohen opprettet en DPP-GFP Fusion protein som er i stand til å redde tap av DPP, noe som betyr at det er biologisk aktive og er utgitt i en biologisk relevant måte16. Her beskriver vi hvordan vi visualiserer DPP løslate hendelser ved hjelp av denne DPP-GFP. Dette Fusion proteinet er spesielt nyttig fordi GFP er pH-følsom slik at når den er i Sure blemmer, er fluorescens slukket17. Derfor, når et protein merket med GFP frigjøres fra en vesicle til det mer nøytrale ekstracellulære miljøet, øker GFP fluorescens intensitet17. Vi tok fordel av pH-følsomheten til GFP å avgjøre om DPP-GFP bor i Sure blemmer. Vi avbildet vinge plater uttrykker DPP-GFP før og etter tilsetning av ammonium klorid, som nøytraliserer intracellulære rom blemmer18. Vi fant en betydelig økning i fluorescens av puncta etter tilsetning av ammonium klorid, noe som tyder på at intracellulære DPP-GFP er slukket før tilsetning av ammonium klorid18. Vi konkluderer med at intracellulære DPP-GFP bor i Sure membran-bundet rom, slik som blemmer, og er unquenched ved tilsetning av ammonium klorid for å nøytralisere pH i intracellulære rom18. Dette gjør live Imaging av DPP-GFP en nyttig teknikk for å visualisere dynamikken i DPP i Drosophila vingen platen som det er sluppet fra Sure rom i ekstracellulære miljøet.
Her beskriver vi metoden vi bruker for å visualisere Utgivelses hendelser i DPP ved hjelp av DPP-GFP. DPP-GFP kan uttrykkes i sitt opprinnelige mønster i Drosophila vinge plater ved hjelp av UAS-GAL4 system19. Dette er metoden som ble brukt til å fastslå at irk kanaler innvirkning DPP utgivelse18. Vi validerte metoden ved Live-Imaging z-stabler. Vi ser ikke DPP-GFP puncta beveger seg innenfor flyet av fokus i tidsserier hvis vi ervervet i ett plan av fokus. Vi ser heller ikke bevegelse av DPP-GFP puncta hvis vi avbildet i en z-stack. Vi konkluderer med at DPP-GFP puncta sett ved hjelp av denne metoden er Release hendelser snarere enn bevegelse av blemmer intracellulært. Denne metoden for Live-Imaging av DPP-GFP kan potensielt brukes til å teste andre antatte bestemmelsesord av DPP utgivelse for deres innvirkning på DPP dynamikk eller kan endres for å se på dynamikken i andre ligander

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Baker&#39;s yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td>&#160;</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 dyhydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>484-457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Agar Type II</td>
			<td>Apex</td>
			<td>66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Dpp-GAL4/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster: Sp/CyO-GFP; UAS-Dpp-GFP/TM6 Tb Hu</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This stock will soon be made available at Bloomington Drosophila Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500233</td>
			<td>Forceps for dissecting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC193780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Corn Syrup</td>
			<td>Karo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malt Extract</td>
			<td>Breiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>RPI</td>
			<td>S22060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>Electron Micsroscopy Sciences</td>
			<td>72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soy Flour</td>
			<td>ADM Specialty Ingredients</td>
			<td>062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S5-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose dyhydrate</td>
			<td>Chem-Impex International, Inc.</td>
			<td>00766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Corn Meal</td>
			<td>Quaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss SteREO Discovery.V8 microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Microscope for dissections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging dpp release from a drosophila wing disc

Den transformere vekstfaktor-beta (TGF-β) overfamilie er avgjørende for tidlig embryonale mønstre og utvikling av voksne strukturer i flercellede organismer. Den TGF-β overfamilie inkluderer TGF-β, bein Morfogenetiske protein (BMPs), Activins, vekst og differensiering faktorer, og Nodals. Det har lenge vært kjent at mengden av ligand eksponert for celler er viktig for dens virkninger. Det var antatt at langtrekkende konsentrasjon graderinger satt opp embryonale mønsteret. Men nylig har det blitt klart at tidspunktet for eksponering for disse ligander er også viktig for deres nedstrøms transcriptional konsekvenser. En TGF-β overfamilie ligand kan ikke ha en utviklingsmessige konsekvens før den slippes ut fra cellen der den ble produsert. Inntil nylig var det vanskelig å fastslå når disse ligander ble løslatt fra celler. Her viser vi hvordan du måler utgivelsen av en Drosophila BMP kalt Decapentaplegic (DPP) fra cellene i vingen primordium eller vinge plate. Denne metoden kan endres for andre systemer eller signalering ligander.

Figur 2 viser representative Live-Imaging resultatene av denne protokollen. Når protokollen er vellykket, kan DPP-GFP sees som en stripe nedover midten av vingen plate med kjerner synlig som ikke-fluorescerende sirkler i DPP-GFP regionen (figur 2). DPP-GFP løslate er synlig idet fluorescerende puncta det komme og forsvinne. Vi har observert DPP-GFP fluorescens vises og forsvinner i cellen organer og langt fra celle organer. DPP signalering er avhengig av utgan...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc at JoVE.com

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Tidspunktet for eksponering for ligander kan påvirke deres utviklingsmessige konsekvenser. Her viser vi hvordan du bilde utgivelsen av en Drosophila Bone Morfogenetiske PROTEIN (BMP) kalt DPP fra cellene i vingen platen.

Imaging DPP Release fra en Drosophila vinge Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

DPP påvirker celleskjebnen ved å binde reseptorer og sende et signal intracellulært for å påvirke transkripsjon. Hvis DPP er produsert, men ikke utgitt, det har ikke tilgang til reseptorer og derfor ikke kan utføre sine roller. Denne teknikken gjør det mulig å visualisere DPP-utgivelse slik at forskere kan undersøke hvilke genetiske og miljømessige faktorer som endrer DPP-utgivelsesdynamikk.BMP signalveien bevares fra fluer til mennesker, så vi forventer at mekanismen som dikterer DPP-utgivelsen, også vil være relevant for menneskelig utvikling og regenerering. Begynn med å krysse 30 til 40 jomfrukvinne dpp gal4 fluer med 10 til 15 mannlige UAS DPP-GFP fluer. Oppmuntre egglegging ved å legge til en liten mengde gjærpasta til et nytt hetteglass med mat.For å samle eggene, snu de kryssede fluene inn i hetteglasset og la dem ligge i tre til fire timer før de fjernes. Hold eggsamlings hetteglassene ved 25 grader Celsius i ca. 144 timer til larvene er på tredje instar-stadium. Velg deretter de riktige larver for disseksjon.Først velger larver som ikke er TB som vil være normal lengde i stedet for kort og fett. For å velge DPP-GFP som uttrykker larver, se dem under et fluorescensstereomikroskop. Alle ikke-TB larver vil ha noen fluorescens, men GFP er begrenset til vingeplatene og er mindre lyse på DPP-GFP larver.Forbered modifiserte HL3-medier i henhold til manuskriptretninger som vil holde vingeplatene i live for bildebehandling. Juster pH til 7,1 med HEPES og filtrer den deretter gjennom et 0,22 mikrometerfilter. Plasser to stykker fargeløs dobbeltsidig tapebredde klok over et mikroskop lysbilde forlater et mellomrom på ca fem millimeter mellom dem og sørge for at endene av båndet ligge spylt med kantene på lysbildet.Bruk en flat kant til å trykke tapen godt til lysbildet. Legg til 25 mikroliter av det modifiserte HL3-mediet mellom de to tapebitene. Når vingeskiven er montert i media, vil tapebitene hindre at den knuses av dekkslippen.For å dissekere larven, legg den i det modifiserte HL3-mediet og riv den forsiktig i to ved hjelp av to par tang. Kast den bakre halvdelen, ta deretter tak i midten av den fremre halvdelen med ett par tang og bruk det andre paret til å skyve munnkrokene tilbake i larven til den er helt invertert. Se etter de skarpe svingene i de to mørkere primærgrenene av luftrøret som går ned begge sider av larven.Vingeplatene ligger rett under. Fjern platene forsiktig og legg dem i HL3-mediet på det klargjorte lysbildet, og pass på at ingen stykker luftrør fortsatt er festet til platene. Ordne vingeskivene slik at den peripodiale siden av vingeposen vender oppover med platen liggende flatt.Dekk vingen med en dekkslipp og forsegle med neglelakk. Når polishen er tørr, fortsett umiddelbart med bildebehandling. Bilde den monterte vingeplaten ved hjelp av et konfokal laserskanningsmikroskop med et 40X oljemål og en 488 nanometer laser.Samle bilder med en hastighet på to hertz i to minutter. For best resultat, angi laserkraften akkurat sterk nok til å få et klart bilde av DPP-frigjørende celler for å unngå over bleking. Samle bildene som en tidsserie og eksportere dem som AVI-filer for å få en video av DPP-utgivelsen.Når protokollen er vellykket, vises DPP-GFP som en stripe nedover midten av vingeplaten med kjerner synlig som ikke-fluorescerende sirkler. DPP-GFP-utgivelsen er synlig som fluorescerende punktpunkt som vises og forsvinner både i og langt borte fra cellelegemene. Den distinkte punktta er sannsynlig i cytonemes eller på cytonemes synapser.Vingeskivene er montert slik at bildet gjøres fra peripodialsiden. Hvis vingeplaten er avbildet fra baksiden, vil DPP-GFP-fluorescensen vises ute av fokus og oppløsningen vil være dårlig. Når GFP ikke er smeltet sammen til DPP, observeres ingen punktpunkt utenfor cellelegemene.Denne kontrollen viser at DPP-GFP oppfører seg annerledes enn GFP alene. Videre vises ingen fluorescerende punktpunkt når DPP-GFP ikke uttrykkes. Under denne prosedyren er det viktig at vingeskiven er montert peripodial side opp.Hvis vingeplaten er feil orientert, vises DPP-GFP ute av fokus. Denne metoden kan brukes til å studere utgivelsen av andre utviklingssignalering ligands som vingeløs eller pinnsvin. Vi kan utforske alle de forskjellige miljømessige og genetiske faktorene som kan påvirke DPP-utgivelsen.I tillegg kan vi tilpasse denne metoden for å studere BMP-frigjøring fra andre celletyper.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Oppreist Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Kalsium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Langsiktig live Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode for å vurdere Drosophila melanogaster' s levedyktighet fra embryo til Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Imaging Intranukleære Actin stenger i Live Heat Stresset Drosophila Embryoer

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Hele dyrets avbildning av Drosophila melanogaster ved hjelp av mikrocomputert tomografi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Disseksjon og live-imaging av sen embryonal drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...